山楂叶多糖提取工艺优化及体外抗氧化和抑菌活性研究_李杰.pdf

91 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 4 期2018,81:161-170.20 刘思含.抑制米饭回生技术研究D.沈阳:沈阳农业大学,2017:1-6.21 NIU L Y,WU L Y,XIAO J H.Inhibition of gelatinized rice starch retrogradation by rice bran protein hydrolysatesJ.Carbohydrate Polymers,2017,175:311-319.22 WU P,LI C F,BAI Y M,et al.A starch molecular basis for aging-induced changes in pasting and textural properties of waxy riceJ.Food Chemistry,2019,284(30):270-278.23 ZHANG C,CHEN S,REN X,et al.Molecular structure and physicochemical properties of starches from rice with different amylose contents resulting from modification of Os GBSSI activityJ.Journal of Agricultural&Food Chemistry,2017,65(10):2222-2232.24 GU F,GONG B,GILBERT R G,et al.Relations between changes in starch molecular fine structure and in thermal properties during rice grain storageJ.Food Chemistry,2019,295:484-492.山楂叶多糖提取工艺优化及体外抗氧化和抑菌活性研究李杰，田思雨，谭怡然，赵嘉，周铭懿*1.锦州医科大学食品与健康学院（锦州 121001）；2.辽宁省肉类加工与质量安全控制专业技术创新中心 锦州医科大学（锦州 121001）摘要以山楂叶为原料,采用传统热水提取法提取山楂叶多糖,在单因素试验基础上应用响应面法优化提取的最佳工艺,并对提取的山楂叶多糖的抗氧化性及其抑菌性进行研究。结果表明,山楂叶多糖的最佳提取工艺条件:以提取两次为前提,料液比143 g/mL、提取时间2.2 h、提取温度93,山楂叶多糖的平均提取率为8.916%0.005%。山楂叶多糖的抗氧化性结果表明,多糖质量浓度达到5.0 mg/mL时,ABTS+自由基的清除率为46.24%0.26%,DPPH自由基的清除率可达到70.18%0.04%。抑菌试验结果表明,在最优的提取工艺条件下,山楂叶多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都起到抑制作用。关键词山楂叶;多糖;抗氧化;抑菌Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Hawthorn Leaves and Study on Its Antioxidant and Antibacterial Activities in VitroLI Jie,TIAN Siyu,TAN Yiran,ZHAO Jia,ZHOU Mingyi*1.College of Food and Health,Jinzhou Medical University(Jinzhou 121000);2.Liaoning Province Meat Processing and Quality Safety Control Technical Innovation Center Jinzhou Medical University(Jinzhou 121000)Abstract Hawthorn leaves were used as raw materials to extract polysaccharide from hawthorn leaves by traditional hot water extraction method.Response surface method was used to optimize the extraction process based on single factor test,and the antioxidant activity and antibacterial activity of polysaccharide were studied.The results showed that the optimal extraction conditions of hawthorn leaf polysaccharide were as follows:under the conditions of two extraction times,the ratio of solid to liquid was 143 g/mL,extraction time was 2.2 h,extraction temperature was 93,and the average extraction rate of hawthorn leaf polysaccharide was 8.916%0.005%.The results showed that when the concentration of polysaccharide reached 5.0 mg/mL,the scavenging rate of ABTS+free radical was 46.24%0.26%,and that of DPPH free radical was 70.18%0.04%.The results showed that polysaccharide from hawthorn leaves had inhibitory effects on Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Bacillus subtilis under optimal extraction conditions.Keywords hawthorn leaf;polysaccharide;anti-oxidation;bacteriostatic山楂叶为蔷薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥叶，主产于我国华北、东北等地。山楂叶中富含各种生物活性物质，包括黄酮类、氨基酸、多糖、维生素、微量元素1。植物多糖的来源广泛、高效且无毒副作用2。由于植物多糖被证实具有诸多生理功能，如免疫调节、抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等作用3，使得对其研究日益受到关注。目前对山楂叶中活性物质研究主要集中在黄酮类化合物提取、功能特性等方面，对多糖类物质的研究较少。目前对多糖的提取多采用热水提取、超声辅助提取4、酶辅助提取及微波辅助提取5-6等方法。采用传食品工业 2023 年第44卷第 4 期 92 工艺技术统热水提取法对山楂叶多糖进行提取。采用单因素试验对山楂叶多糖的提取条件进行优化，对提取次数、料液比、提取时间和提取温度进行了考察，利用响应面法进行优化分析。同时通过测定DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率，探讨山楂叶多糖的抗氧化能力。此外，还对山楂叶多糖的抑菌活性进行研究，以期为山楂叶作为天然抗氧化功能产品的进一步开发利用提供理论依据和参考。1材料与方法1.1材料与仪器山楂叶（广西桂林天堂漓江有限公司）；葡萄糖标准品（江西佰草源生物科技有限公司）；石油醚、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、抗坏血酸（天津市富宇精细化工有限公司）；DPPH试剂、ABTS+试剂（上海研启生物科技有限公司）；所有试剂均为分析纯。RE-2 000 B旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DF-101 S集热式恒温加热磁力搅拌器（韩国DAIHAN公司）；UV-1600紫外可见分光光计（上海精密科学仪器有限公司）；LC-20 a高效液相色谱仪（岛津仪器苏州有限公司）；SHZ-D予华牌循环水真空泵（陕西太康生物科技有限公司）；MIKRO220 R高速低温离心机（德安徽中科中佳科学仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1山楂叶多糖提取1.2.1.1山楂叶的预处理将鲜山楂叶在60 干燥24 h，烘干后用粉碎机粉碎，然后将粉碎的山楂叶粉末过0.250 mm筛，并将过筛后的山楂叶粉末收集备用。称取100 g处理好的山楂叶粉与2 L石油醚混合，室温搅拌处理12 h，并重复3次。抽滤，将石油醚除去，即得除脂的山楂叶粉末，收集备用。1.2.1.2提取工艺参考龚频等7的方法稍作修改。准确称取4 g脱脂后的山楂叶粉，在一定的料液比、提取次数、提取时间和提取温度下提取粗多糖。然后离心（6 000 r/min，10 min）收集上清液，负压浓缩后，向提取液中加入4倍体积的无水乙醇，在4 过夜沉淀，离心后收集沉淀，并冷冻干燥即为山楂叶粗多糖。1.2.1.3标准曲线的绘制参考Lin等8的苯酚-硫酸法。以葡萄糖作为标准品，来绘制标准曲线。精确称取10 mg葡萄糖加蒸馏水，定容至10 mL容量瓶中，配制成 1 mg/mL葡萄糖标准溶液，备用。准确吸取0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL葡萄糖标准对照溶液，分别定容至10 mL容量瓶中。取各稀释液1 mL于试管中，依次添加1 mL 5%的苯酚标准溶液、5 mL浓硫酸，充分混合后静置30 min冷却至室温后，用蒸馏水作为空白对照，在490 nm波长处测吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。其标准曲线回归方程为y=0.003 87x+0.006 75，R2=0.998。1.2.1.4多糖含量的测定用1.1.2.3小节中的方法测定吸光度。并计算山楂叶粗多糖的得率，山楂叶多糖得率按式（1）计算。多糖得率=100%（1）CVNM式中：C为葡萄糖标准溶液质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为样品溶液体积，mL，M为山楂叶粉质量，mg。1.2.2多糖提取工艺优化1.2.2.1单因素试验以粗多糖得率为指标，分析料液比、提取次数、提取时间和提取温度四个因素对粗多糖得率的影响。固定各因素水平：料液比140 g/mL，提取次数2次，提取时间2 h，提取温度80。改变各因素水平参数：提取次数为1，2，3，4和5次时，分析提取次数对得率的影响；料液比为120，130，140，150和160 g/mL时，分析料液比对得率的影响；提取时间为1，1.5，2，2.5和3 h时，分析提取时间对得率的影响；提取温度为60，70，80，90和100 时，分析提取温度对得率的影响。根据单因素结果进行正交试验，从而确定粗多糖的最佳提取工艺参数。1.2.2.2响应面试验根据单因素试验的结果，对提取料液比、提取时间和提取温度3个因素分别取3个水平进行响应面试验，优化山楂叶多糖提取工艺。响应面试验的三因素三水平选取见表1。表1响应面试验因素与水平水平因素A料液比/(gmL-1)B提取时间/hC提取温度/-11 301.58001 402.09011 502.51001.2.3体外抗氧化性测定1.2.3.1DPPH自由基清除能力的测定参考张婉君等9测定方式并进行修改。分别取不同质量浓度梯度（0.5，1，2，3，4和5 mg/mL）的多糖溶液与抗坏血酸于不同试管中，加入2.0 mL DPPH 溶液，再加0.5 mL蒸馏水摇匀室温避光静置30 min，在波长517 nm下分别测定吸光度。按式（2）计算DPPH的清除率。W=1-100%（2）A1-A2A0mc式中：A0为空白溶液吸光度；A1为多糖或抗坏血酸溶*通信作者；基金项目：2022年辽宁省大学生创新创业训练项目编号：157 93 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 4 期液吸光度；A2为样品溶液本底吸光度。1.2.3.2ABTS+自由基清除能力的测定参考韦志等10的方法。取与1.2.3.1小节相同浓度梯度的多糖溶液进行试验，以抗坏血酸VC为阳性对照，体积分数为95%乙醇与ABTS+工作液混合液为参比液，在波长734 nm处测定吸光度，进而计算粗多糖对ABTS+自由基的清除率，按式（3）计算。W=1-100%（3）A1-A2A0mc式中：A0为空白溶液吸光度；A1为多糖或抗坏血酸溶液吸光度；A2为样品溶液本底吸光度。1.3山楂叶多糖提取液对细菌生长的影响用打孔器将滤纸打成直径9 mm的圆滤纸片，与营养琼脂培养基一同在121 条件下灭菌20 min。制作培养基平皿，用无菌移液枪吸取菌悬液，涂布均匀。将灭菌后的滤纸片浸入山楂叶多糖的提取液中30 min，用无菌镊子取出，晾干，平铺于含有涂布细菌的凝固培养基中，倒置放在37 恒温培养箱中培养24 h。观察测量抑菌圈的直径。1.4数据处理以上每个试验重复3次，结果以平均值标准差表示。采用响应面分析，Design Expert 13及Origin 2019软件对试验数据进行处理、方差分析及试验数据作图。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1提取次数对山楂叶多糖得率的影响由图1的结果可知，提取次数从1次到2次的过程中多糖得率有所增加，提取2次之后多糖得率变化并不明显。原因可能是提取2次能够使得全部多糖溶出。所以固定提取次数2次。图1提取次数对山楂叶多糖得率的影响2.1.2料液比对山楂叶多糖得率的影响由图2可知，随着液料占比不断增大，山楂叶多糖的得率先升高后降低。料液比为140 g/mL时，山楂叶多糖的得率最高，为8.33%。所以，最佳料液比为140 g/mL。图2料液比对山楂叶多糖得率的影响2.1.3提取时间对山楂叶多糖得率的影响由图3可知，随着提取时间的延长，山楂叶多糖的得率呈现先升高而后降低的趋势。当提取时间达到2 h时，多糖得率达到最大值，为8.63%。可能的原因是随着提取时间的延长，其他物质溶出，导致多糖得率有所下降。因此，最佳提取时间为2 h。图3提取时间对山楂叶多糖得率的影响2.1.4提取温度对山楂叶多糖得率的影响由图4可看出，温度在6090 区间内，得率一直呈上升趋势，且趋势显著。在90100 区间，得率上升趋势趋于平稳，当温度达到100 时提取率达到最大值7.44%。因此选取100 为最佳的提取温度。图4提取温度对山楂叶多糖得率的影响2.2响应面优化试验2.2.1响应面优化试验结果根据单因素试验结果选取料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）进行响应面试验。响应面试食品工业 2023 年第44卷第 4 期 94 工艺技术验设计及结果见表2。表2响应面试验设计及结果试验号ABC得率/%10008.6220008.68310-17.2541-107.3550-117.3161108.287-1-106.528-1107.299-1017.30100008.691101-17.46120-1-16.50130118.28140008.73151018.10160008.6017-10-16.48通过Design-Expert 13软件分析试验数据，得二次多项回归方程：得率Y=8.66+0.423 8A+0.453 8B+0.412 5C+0.04AB+0.007 5AC+0.002 5BC-0.704 5A2-0.599 5B2-0.677C2。模型显著，具有统计学意义。方差分析结果见表3。模型决定系数R2为0.997 6，模型显著性较高，Radj2=0.994 4，能够解释试验响应值变异的97.64%，接近预测相关系数Pred R2，表明试验模型与实际数据拟合较好。表3方差分析结果因素平方和 自由度均方F值P值显著性模型10.6391.18318.700.000 1*A料液比1.4411.44387.570.000 1*B提取时间1.6511.65444.390.000 1*C提取温度1.3611.36367.270.000 1*AB0.006 410.006 41.730.230 3 不显著AC0.000 210.000 20.060 70.812 5 不显著BC0.000 010.000 00.006 70.936 8 不显著A22.0912.09563.820.000 1*B21.5111.51408.280.000 1*C21.9311.93520.660.000 1*残差0.025 970.003 7失拟项0.014 630.004 91.720.299 8 不显著纯误差0.011 340.002 8合计10.6616注:“*”表示影响极显著(P0.01),“*”表示影响显著(P0.05)。2.2.2各因素的交互作用分析图5图7为各个因素之间两两交互作用的响应面图和等高线图。图5为料液比和提取时间的交互作用对多糖得率的影响。料液比在130150 g/mL范围内，提取时间在1.52.5 h范围内时，多糖得率的变化趋势为先增加后降低，二者交互作用使得多糖得率达到最大值8.69%0.001 2%。图6为料液比和提取温度的交互作用对多糖得率的影响。料液比在130150 g/mL范围内，提取温度在80100 范围内，随着料液比和提取温度的持续增加，多糖得率先增加后降低，二者交互作用使得多糖得率达到最大值8.73%1.46%。图7为提取时间和提取温度的交互作用对多糖得率的影响。提取时间在1.52.5 h范围内，提取温度在80100 范围，随着提取温度和提取时间的升高，多糖得率均先增加后降低，两者交互作用使得多糖得率最大值达到8.68%0.002%。根据Design-Expert 13软件运行结果，在料液比、提取时间、提取温度的共同影响下，最优提取工艺为料液比143.136 g/mL、提取时间2.195 h、提取温度93.072，该条件下模型预测的得率达到8.882%。图5料液比和提取时间的交互作用对多糖得率的影响图6料液比和提取温度的交互作用对多糖得率的影响图7提取时间和提取温度的交互作用对多糖得率的影响2.2.3最优工艺条件试验验证结合实际操作的可行性，在提取次数2次、料液比143 g/mL、提取时间2.2 h、提取温度93 条件下进行3次重复试验，平均提取率为8.916%0.005%，95 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 4 期与模型预测结果较吻合，表明响应面模型用于分析优化得率的最佳工艺有效可行。2.3山楂叶多糖的体外抗氧化活性山楂叶多糖的体外抗氧化活性结果如图8所示。ABTS+和DPPH自由基清除率在05.0 mg/mL范围内，都是随着多糖浓度的升高，其自由基清除率逐渐升高。当多糖质量浓度达到5.0 mg/mL时，ABTS+自由基的清除率为46.24%0.26%，与VC相比相差较大。而DPPH自由基的清除率可达到70.18%0.04%。结果表明山楂叶多糖具有良好的抗氧化活性。图8DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力2.4山楂叶多糖的抑菌效果对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌3种细菌进行抑菌试验，由表4可看出，在圆滤纸片的周围均出现抑菌圈，说明山楂叶多糖提取液对这3种细菌的生长都有抑制作用。从抑菌圈直径大小可以看出，山楂叶多糖对大肠杆菌的抑制作用最明显。表4山楂叶多糖对细菌的抑制试验菌种抑制圈直径/mm金黄色葡萄球菌16.20.1大肠杆菌18.40.1枯草芽孢杆菌12.70.13结论此试验研究了山楂叶多糖的提取工艺条件及其抗氧化活性和抑菌活性。通过单因素试验及响应面优化试验结果可得出：提取山楂叶多糖的最优工艺条件为提取次数2次、料液比143 g/mL、提取时间2.2 h、提取温度93，此时山楂叶多糖的平均提取率为8.916%0.005%，与响应面模型预测值相符。山楂叶多糖对DPPH和ABTS+都有清除能力，ABTS+自由基的清除率为46.24%0.26%，DPPH自由基的清除率可达到70.18%0.04%。抑菌试验研究结果表明，在最优的提取工艺条件下，山楂叶多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都起到抑制作用，但抑制的程度并不相同。参考文献：1 SHI Y,KONG X,YIN H,et al.Effect of hawthorn leaf flavonoids in dehydroepiandrosterone-induced polycystic ovary syndrome in ratsJ.Pathobiology,2019,86(2/3):102110.2 KONG F,CHEN T,LI X,et al.The current application and future prospects of astragalus 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