染色体步移步骤复习过程.doc
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1、染色体步移步骤精品资料染色体步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术,使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用: 1. 根据已知的基因或分子标记连续步移,获取人、动物和植物的重要调控基因,可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究; 2. 步查获取新物种中基因的非保守区域,从而获得完整的基因序列; 3. 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点,鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等; 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补,获得完整的基因组序列; 5. 用于人工染色体 PAC、Y
2、AC 和 BAC 的片段搭接。其主要原理是根据已知 DNA 序列,分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物(SP Primer),与退火温度较低的兼并引物,进行热不对称 PCR 反应。现在有很多Genome Walking Kit,相应的说明书都介绍的很详尽,下面给你发一个原理图:大致的原理是这样的,依据TaKaRa的试剂盒,具体的操作步骤如下:1. 基因组 DNA 的获取。 基因组 DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组 DNA(例如:只进行细胞热处理或蛋白酶处理)作为模板,而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。此外,由于本方法灵敏度极高
3、,模板 DNA 一定不要污染,所需的 DNA 量不要少于 3 g。 2. 已知序列的验证。 在进行 PCR 实验之前必须对已知序列进行验证,以确认已知序列的正确性。具体方法为:根据已知序列设计特异性引物(扩增长度最好不少于500 bp),对模板进行 PCR 扩增,然后对 PCR 产物进行测序,再与参考序列比较确认已知序列的正确性。 3. 特异性引物的设计。 根据验证的已知序列,按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物,即:SP1、SP2、SP3。 4. 1st PCR 反应。 基因组 DNA 经 OD 测定准确定量后,取适量作为模板(不同物种的最佳反应 DNA 量并不相同,实际用量参考下
4、面的注*1),以 AP Primer(四种中的任意一种,以下以 AP1 Primer 为例)作为上游引物,SP1 Primer 为下游引物,进行 1st PCR 反应。 按下列组份配制 1st PCR反应液。 Template(基因组 DNA) x ng *1 dNTP Mixture(2.5 m each ) 8 l 10LA PCR Buffer II(Mg2+plus) 5 l TaKaRa LA Taq (5 U/l) 0.5 l AP1 Primer(100 pmol/l) 1 l SP1 Primer(10 pmol/l) 1 l dH2O up to 50 l 1st PCR 反
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