ELISA实验操作中常见问题分析.doc

由于 ELISA(酶联免疫试验)具有敏捷度较高、特异性好特点，已广泛应用于多种传染性疾病筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA试验重要环节中一种，但作为专业洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA试验成果各原因有一定认识。优质 试剂 ，良好仪器和对操作是保证ELISA 检测成果精确可靠必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔成果正常，而标本孔OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中常常碰到问题。现将ELISA试验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来某些启发，以改善洗板机安装调试水平，提高临床检测质量。
    1 标本及采集、贮运原因
严重溶血 ，以 HRP 为标识ELISA 测定中，残留在孔内血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色导致假阳性； 混有红细胞血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有 细菌污染 ，菌体中也许具有内源性HRP，也会产生假阳性反应； 标本凝固不全 ，有时为了争取时间迅速检测，常在血液尚未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见纤维蛋白块，易导致假阳性成果； 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染； 塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降导致假阴性。
    血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保留时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法 试剂 本底加深。超过一周测定需－20℃保留。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充足混匀并防止产生气泡。混浊或有沉淀血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，因此测 抗体 血清标本如需保留作多次检测，宜少许分装冰存；最佳使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增长OD值，也许与高浓度肝素具有强大负电荷能吸附酶标识物不易洗脱有关；EDTA、酶克制剂（如NaN3）可克制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充足凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶采血管或于采血管中加入合适促凝剂。
2、试剂影响
    ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原过渡。由于历史原因，人们往往以反应本底好坏来衡量ELISA 反应 试剂 盒，因此有些厂家为了保持很好本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类 试剂 盒流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持 试剂 盒高流行病学敏感度，科学地看待反应成果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟优越性，就HCV-ELISA 试剂 盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，重要是HCV 特异性抗原决定簇肽片段；第二代产品包被抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时基因工程抗原不全，仅包括了HCV 关键区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，并且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高HCV 特异性抗原。第三代 试剂 敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原区别如下：
    基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核体现蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母 菌为体现系统。该类抗原与合成肽相比具有如下特点：
a.分子量大。合成肽采用化学措施制备，由于工艺局限，合成数量有限，只能到达数百个氨基酸；而运用基因工程制备抗原，分子量更大。
b.稳定性好。包被抗原稳定性可使 试剂 盒效期得到保证，初期以合成肽为包被抗原 试剂 盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合体现，体现产物包括更多抗原决定簇，可提高 试剂 盒敏捷度，提高检出率。
d.纯化难度大。基因工程抗原纯化技术难度较大。
    合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子某一抗原决定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。合成肽抗原有如下特点： a.分子量太小；b.一般只具有一种抗原决定簇；c.纯度高；d.稳定性差。
    国内乙肝两对半试剂厂家较多；不一样厂家出产试剂敏捷度与特异性存在一定差异，资料显示，不一样厂家试剂特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有厂家酶标板孔间A值差不小于15%；标识酶活性及显色液稳定比较差。使用质劣试剂必然导致成果假阳性或假阴性。因此。选择高质量试剂是保证成果精确关键之一。
•  选择试剂时应选择敏捷度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作以便省时优良检测试剂，国家参比试验室每年对各厂家试剂进行质量评估并定期公布评估成果，可作为选择试剂重要根据。
•  要注意试剂批号和出厂日期，虽然试剂有效期多为 1年。最佳选择刚出厂试剂使用。
不一样厂家试剂不能混用。
    不一样措施学检测试剂，会使两对半成果出现某些不一样。例如：在实际工作中常用 ELISA检测HBsAg成果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除措施学敏捷度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂差异。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，提议试剂厂家对剂制备应当考虑亚型及型浓度问题。
3、操作技术影响
操作过程控制：
⑴ 严格按照试剂阐明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60min。
⑵ 加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按阐明环节严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
(3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本液体蒸发，产生周围现象从而导致“花板”出现。
(4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最佳在吸水纸(选择洁净、无或少尘吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板过程中易产生拖带现象而导致“花板”出现。
(5)合理安排检测量，以免反应板过多导致洗板等待时间长。
(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
(7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色TMB显色剂不用。
(8)加样时保持显色剂不外流；A、B液应防止接触金属器械。加终止液时应防止产生气泡。
(9)应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上措施可以使“花板”降至最低程度。从而提高检测特异性。并得到更精确、可靠试验成果。
    加样吸嘴洁净与否和吸量精确性，直接影响检测成果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染机会。提议用一次性吸嘴。加样器也要常常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在 ELISA 板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可溅出。
    温浴影响，在建立 ELISA 措施作反应动力学研究时，试验表明，两次抗原 抗体 反应一般在37℃经1-2 小时，产物生成可达顶峰。为防止蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不适宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡。应注意温育温度和时间应按规定力争精确。由于企业 试剂 盒温育是在空气浴中完毕，采用水浴会导致值偏高或花板。此外温育中尚有边缘效应，边上值会偏高，提议为了客观判断成果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板构造尤其；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格规定，酶标板周围与内部孔升降温速率不一样，导致周围与内部孔成果差异；干浴与水浴存在明显差异，尽量使用水浴，并规定固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。
    洗涤在 ELISA 过程中虽不是一种反应环节，但却决定着试验成败。ELSIA 就是靠洗涤来到达分离游离和结合酶标识物目。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质吸附是普遍性，而在洗涤时应把这种非特异性吸附干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最重要关键技术，应引起操作者高度重视，操作者应严格按规定洗涤，不得马虎。
    洗涤液多为含非离子型洗涤剂中性缓冲液，多种 试剂 盒洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质结合是疏水性，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质疏水基团借疏水键结合，从而减弱蛋白质与固相载体结合，并借助于亲水基团和水分子结合作用，使蛋白质答复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上抗原或抗体解吸附而减低试验敏捷度。洗液需要稀释，应按规定稀释。配制洗液应用新鲜和高质量纯化水，电导率不不小于1.5μs/cm，洗液假如结晶应待其融解后配制。手洗条件一致性较差，对成果影响较大，防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动冼板机使用不妥也会影响成果，血清中残留纤维蛋白丝或洗涤液析出结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，导致未结合标识酶洗脱不彻底，导致“花板”导致假阳性或假阴性；因此操作洗板机过程中要不时观测洗板机针孔内洗液畅通状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。
    保证洗板浸泡时间为 40 秒左右，孔内液体被洗板机吸得越洁净洗涤效果更好，手工洗板
4.显色和比色
    TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶克制剂均可使反应终止。此类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，一般指专用于测读ELISA 成果吸光度光度计。酶标仪重要性能指标有：测读速度、读数精确性、反复性、精确度和可测范围、线性等等。优良酶标仪读数一般可精确到0.001，精确性为±1%，反复性达0.5%。酶标仪不应安顿在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15 -30℃ ，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读成果更稳定。
    测读 A 值时，要选用产物敏感吸取峰，如OPD用492nm 波长。有酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板位置，最终测得A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上划痕或指印等导致光干扰。
    肉眼判断成果时，显色浅不易观测，影响成果精确性，必须使用酶标仪检测，以保成果一致性。
5.HooK效应影响
    伴随ELISA一步法应用，某些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测成果，采用同步稀释测定或使用线性范围高两对半定量法可以减HooK反应发生。
6.干扰物质影响
    有人认为大概 40%人血清标本中具有非特异性干扰物质，可以不一样程度影响检测成果；常见干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其他物质等。如RF因子可与标识二抗FC段法结合导致假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗抗体分子发生变构，FcC1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将两者连接起来导致假阳性，采用56℃30分钟灭活补体可减少假阳性率，高浓度AFP（如孕妇），在储存过程中也许形成二聚体会导致本底过深影响检测成果。
7.药物影响
    高效价乙肝免疫球蛋白会与 HBsAg形成复合物，影响HBsAg检出，因此某些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式出现，如我们常碰到乙肝大三阳孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射200mg乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg检出；并且其所生产生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、也许是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5M盐酸处理标本1小时可提高出率。
    为防止乙肝，部分 HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后1—2周内，血清中可检出HBsAg成分，形成一过性HBsAg阳性，这也许是乙肝疫苗重要成分是HBsAg.，有措施可以把它检出；如电化学发光法，提议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。
8.抗原自身原因
    融合蛋白对基因工程抗原特异性影响。以丙肝诊断 试剂 盒为例为例，由于包被基因工程抗原为融合蛋白，包括了来自体现载体某些序列可以与血清中抗大肠杆菌因子发生反应而产生了可疑标本。
    少数 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如爆发性乙型肝炎、HBVS基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇不一样分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高免疫原性，在HBV自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其本来甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇抗原性发生变化，使机体产生抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同步出现HBsAg和抗HBs。同步乙肝疫苗接种也不能有效防止此类变异病毒感染。乙型肝炎病毒S基因变异有自然变异和逃防止疫变异，变异可发生在多种部位，并且几处突变可同步存在，这些变异有助于病毒携带状态持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58～118）是引起HBsAg阴性HBV感染重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg调整元件，前S1丢失突变则会影响S启动子功能，进而影响HBsAg合成。
    总之，优质 试剂，良好状态仪器，排除多种影响原因干扰和对操作是保证ELISA 检测成果精确可靠必要条件。
异常
成果描述
原因分析
对策
白板
显色环节结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。
试剂已过效期，或不一样试剂盒组分混用
检查试剂组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应试剂盒。不一样试剂盒或不一样批号试剂不能混用。
错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B
严格按阐明书环节操作，加完试剂后可观测一下液面高度与否一致，以减少漏加现象。
洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色能力
确认盛酶标容器不含酶克制剂如叠氮钠等，确认配制洗液容器已洗洁净。
终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制
每次配制时都应看清标签标明物质。
蒸馏水有问题
确认配制洗液纯化水到达规定且未污染，与好蒸馏水比较。
显色弱、敏捷度低
试验结束后，包括阳性对照、质控在内所有板孔颜色均较淡。
试剂盒超过期， 超过有效期产品也许会产生很弱信号； 试剂盒没有按规定进行保留，受高温影响；
试验前检查试剂组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储备。
试剂、样品用前未平衡至室温
从低温冰箱中取出试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。
加入试剂体积和时间有误， 移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；
确定所使用试剂体积对，加入时间合适。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不适宜太快，排放应完全。
洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色能力；
确认盛酶标容器不含酶克制剂如叠氮钠等，确认配制洗液容器已洗洁净，确认配制洗液纯化水到达规定且未受污染。
孵育时间及孵育温度未到达规定 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。
孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照阐明书操作。 保温期内不适宜多开门，以免影响保温。
洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合规定；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长；
严格按阐明书规定稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按阐明书规定置留洗涤液时间和洗涤次数。
显色剂加量局限性或次序颠倒，或混合后加入；
显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不适宜过快，先加显色剂 A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。
底物作用时间不够；
精确定期。
蒸馏水水质有问题；
测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法影响。
试验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱
待测标本中也许不含强阳性标本，故成果也许是正常
如有怀疑，可复检
标本加入叠氮钠作为防腐剂
酶免试验中标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂
阴阳性对照正常，但质控、参照品或个别弱阳性标本未能检出。
未达规定孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出。
确认孵育温度及孵育时间到达规定。
质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出
质控品或标本防止反复冻融。标本在一周内使用，可存于 2-8℃，如需长期保留，应置于-20℃如下保留。质控品应小量分装，并置于-20℃如下保留。
仪器设定不对，滤光片不匹配。
重新设定酶标仪参数，尤其是检查滤光片与否匹配。
终止后，目测成果正常，但酶标仪读值成果偏低
酶标仪参数设定不对。
重新设定酶标仪参数，尤其是检查滤光片与否匹配。
敏捷度过高、板底高、高背景
终止后，整板成果显现均一黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本 OD值过高。
整板黄板现象也许是由于错加其他试剂导致，如同步操作两对半试剂时，测 HbsAb板用于测HBsAg等；
试验前检查试剂组分及批号，确认所有组分均属于对应试剂盒。不一样试剂盒或不一样批号试剂不能混用。
酶标对吸头污染以及对盛放显色剂容器污染都易导致黄板现象；
防止试剂组分间交叉污染，保证吸头、容器洁净。
显色剂在光照条件下放置过久，试验前已变蓝
显色剂 A、B未使用前避光保留
孵育温度过高或孵育时间过长；
孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照阐明书操作。
未按规定洗板。尤其是洗涤时每孔未注满洗液，易导致花板黄板现象
严格按阐明书规定洗板。
花板，一般是由于临床标本搜集、处理和保留措施不妥导致
放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。
出现随机性花板、跳孔现象
样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；
充足离心， 3000rpm6分钟以上。
加样时交叉污染；
加标本时尽量 防止交叉污染。如盛标本试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。
手工洗板导致交叉污染
手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染
洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，导致 花板、跳孔
疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。
拍板时交叉污染
洗板完毕拍板时用合适吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。
假阳性
假阳性现象是一种综合现象，可参照上文 “敏捷度过高、板底高、高背景” 中分析。这里只列举常见原因及对策。
计算 Cutoff值时使用公式不对，导致计算得出CutOff值过低，从而导致出现假阳性
CutOff值计算公式应严格参照所属产品阐明书，应注意各个酶免产品Cutoff值计算公式不尽相似。
洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够， 洗涤不充足，样品中有其他成分残留 导致花板、跳孔，假阳性增多
严格按阐明书规定洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示液量与实际液量并不相符，应根据实际状况调整至每孔注满。
血清标本处理不妥，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其他干扰物可出现孔底由变蓝跳孔现象，此标本反复试验成果往往是阴性；
放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。
厂家试剂质量变化导致；
国标规定提高敏捷度时，厂家试剂敏捷度也对应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受。
水责问题；
防止蒸馏水污染。
加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多；
加酶前检查移液器调整量与否精确，稀释酶时思想要集中。
培养箱温度超过 37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过；
放入板此前要检查培养箱温度，精确定期。
底物配制时间过长、或底物污染；
底物应在酶反应完毕即将洗涤前 5分钟配制，注意避光。
该批样品放置时间过长，样品污染；
样品应保持新鲜，或低温保留，防止污染。
移液嘴反复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物；
移液嘴尽量一次性使用。
反复性差

1、样品数量不一，加样时间长短不一；
反复某同样品时，加样时间尽量与第一次靠近。
2、样品加入后未混匀；
加样后在混匀器上充足混匀。
3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对；
TMB显色用450/630波长.
4、酶标仪测定反复性差；
校对酶标仪。
5、洗涤不对；
洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物（可多甩几次），在洁净、无或少尘吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充足。
6、温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱）
恒温箱温育较水浴显色深， OD值高出0.1-0.15,最佳均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。
7、不慎多加或少加酶或显色剂；
多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。
8、阈值附近时阴时阳；
同同样品做三个复孔，以二个（含二个以上相似成果为准）
9、加样量局限性、保温时间、洗涤条件一致；
尽量使用同一移液器和装紧吸嘴反复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。