新型ABCA1、SR-BICLA-1表达上调剂的抗动脉粥样硬化活性及其作用靶标发现研究学习资料.docx
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1、此文档收集于网络,如有侵权请联系网站删除学校代码: 10023学号:$2012010013硕士学位论文新型ABCA 1、SRBICLA1表达上调剂的 抗动脉粥样硬化活性及其作用靶标发现研究所院:医药生物技术研究所 姓名:王潇指导教师:司书毅教授导师小组:司书毅教授许艳妮副研究员 学科专业:微生物与生化药学研究方向:心血管药理学 完成日期:201 5年5月万方数据此文档仅供学习和交流独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材
2、料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示谢意。学位论文作者签名:孑溺签字吼矽J岁年石月弓日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解j壁塞迹塑医堂陵有关保存、使用学位论文的 管理办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论 文被查阅和借阅。本人授权j量塞迹塑医堂院可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)一呓詹学位论文作者签名:叱7荫、导师签名:和L签字日期:渺年 易月日签字日期:沙疗r年 6月了 日学位论文作者毕业后去向:
3、工作单位:电话:通讯地址:邮编:万方数据目录中文摘要1ABSTRACT3前言日!J舌88实验材料11实验方法17实验结果33讨仑52结论55参考文献56文献综述61发表论文及参加会议70致射72万方数据北京协和医学院硕士学位论文中文摘要中文摘要心血管疾病在发达国家和大多数发展中国家是危害人类健康的主要杀手,而动 脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多种严重心血管疾病的病理基础。AS的病理生 理过程主要是血管内皮细胞的受损以及巨噬细胞、血管平滑肌细胞在血管壁的沉积 形成泡沫细胞,从而使动脉血管壁不断加厚,最终引起动脉粥样硬化。ATP结合盒 转运体A1(ATPbinding cas
4、sette transporter A1,ABCAl)和清道夫受体B型I (scavenger receptor class B type I,SRBI)是介导胆固醇逆转运的关键蛋白,在机体 清除多余脂质的过程中发挥着重要功能。人的高密度脂蛋白受体被称作CLA一1。 ABCAl和SRBICLA1被认为是预防或治疗动脉粥样硬化的潜在靶标。实验室前期在已有的ABCAl、CLA1表达上调剂筛选模型上得到了活性化合 物吴茱萸次碱(Rutaecarpine,RUT),进一步研究发现RUT在体内能通过上调 ABCAl、SR-BI起到抗AS的作用。RUT是瞬时受体电位香草醛亚家族1(Transient Re
5、ceptor Potemialcation channel subfamily V memberl,TV1)的激动剂。近些年有 研究表明,TRPVl与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病有着密切的关系。Ma等 的研究结果表明,激活TRPVl能够上调ABCAl的表达,减缓AS的发生发展。因 此,TRPVl可能是位于ABCAl、SR-BICLA1上游的作用靶标。鉴于ABCAl、SRBICLAl在动脉粥样硬化发生发展以及治疗中的重要作用, 我们进行f ABCAl、SRBICLA1表达上调剂的抗动脉粥样硬化活性研究,及其 上游作用靶标发现的机制研究。1ABCAl、CLA1表达上调剂的发现本论文首先以实验室
6、前期构建的ABCAl和CLAl表达上调剂筛选模型为基础, 进行了大规模的化合物筛选,以期发现能够提高ABCAl、CLA一1表达水平的活性 化合物。应用此模型对化合物库中的化合物进行了筛选,发现了活性化合物E0869; 针对合成的RUT衍生物进行了筛选,获得了活性化合物R20。2E0869体外抗动脉粥样硬化活性研究Western blot和RT-PCR实验表明,活性化合物E0869能上调肝细胞HepG2中 ABCAl、CLA1以及ABCGl的mRNA以及蛋白水平,但不影响FAS、SREBPlc万方数据北京协和医学院硕士学位论文 中文摘要的表达。E0869能上调巨噬细胞RAW2647中ABCAl、
7、SRBI以及ABCGl的mRNA 以及蛋白水平,但不影响CD36的表达。巨噬细胞泡沫化实验表明,E0869能使泡 沫化巨噬细胞RAW2647胞内脂滴量明显减少,胆固醇流出实验结果表明,E0869 能增加其胆固醇的流出。31120的抗动脉粥样硬化活性研究及其作用靶标研究Western blot和RT-PCR实验表明,R20能上调肝细胞HepG2中ABCAl、CLA1 以及ABCGl的mRNA以及蛋白水平,但不影响FAS、SREBPlc的表达。巨噬细胞泡沫化实验表明,R20能使泡沫化巨噬细胞RAW2647胞内脂滴量明显减少,胆 固醇流出实验结果表明,R20能增加其胆固醇的流出。R20是本实验室合成
8、的RUT的衍生物,RUT是TRPVl的激动剂,文献表明激 活TRPVl能够上调ABCAl的表达,与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病有着密 切的关系。所以,R20有可能是通过激活TRPVl来上调ABCAl的表达,从而发挥 其抗AS的作用。为了进行进一步的验证,我们构建了人TRPVl激动剂筛选模型, 以进行进一步的筛选和检测。通过检测我们发现R20在人TRPVl激动剂筛选模型 上表现出了良好的活性。同时,我们对R20进行了初步的体内活性研究,apoE4小鼠实验结果表明,R20 还能够显著降低小鼠血清中TC、TG以及LDLC的含量,对HDLC的含量有一定 的升高作用。此外,R20能够显著上调小鼠肝脏
9、中ABCAl、SRBI、ABCGl以及 LDLR的蛋白及mRNA水平,但对FAS、SREBP1c的表达有一定的抑制作用:R20 还能显著减轻肝脏中的脂质堆积。综上所述,本论文通过ABCAl、CLA1表达上调剂筛选模型进行筛选,获得 了两个活性化合物E0869和R20,我们进一步对E0869、R20在细胞水平确证了其 药效学活性。为了寻找ABCAl、CLA一1表达上调剂作用靶标,我们构建了人TIuVl 激动剂筛选模型,通过检测我们发现R20具有良好的激动活性。同时,我们对活性 较好的R20进行了初步的体内活性研究。本论文工作为寻找新型抗动脉粥样硬化药 物或其先导化合物奠定了基础,具有重要的理论和
10、实践意义。关键词:ABCAl;SR-BVCLA1:上调剂;TRPVl;激动剂;动脉粥样硬化2万方数据ABSTRACTCardiovascular disease is a major killer of the human health in developed countries and most developing countries,and atherosclerosis(AS)is the pathological basis of many serious cardiovascular diseaseThe pathophysiology of AS is the damage o
11、f endothelial cells,and the deposition of macrophage cells or vascular smooth muscle cells in the vessel wall leading to the formation of foam cellsThis makes the arterial wall thickening constantly,and ultimately causes atherosclerosisATPbinding cassette transporter A 1(ABCA 1)and scavenger recepto
12、r class B type I(SRBI)are the keyproteins in reverse cholesterol transport(RCT),and they play an important role in in theprocess of removing the excess lipidsHuman laJ【gh-density lipoprotein receptors arecalled CLA1ABCAl and SRBICLA一1 is considered to be the potential targets toprevent or treat athe
13、rosclerosisWe have got the active compound Rutaecarpine(RUT)by a cellbased HTS method for upregulators of ABCAl and CLA一1and further study have shown that RUT suppresses atherosclerosis through up-regulating ABCAl and SRB1 within RCTRUT isthe agonist of the transient receptor potential cation channe
14、l subfamily V memberl(TRPVl)Recent studies have shown that the transient receptor potential cation channel subfamily V memberl(TRPVl)is closely associated with cardiovascular diseases such as atherosclerosishypertension and SO onActivating TRPV l causes the influx of calcium and a series of intracel
15、lular signaling,to play its role in cardiovascular protectionMa and others found that activation of TRPV 1 can upregulate the expression of ABCA 1,and it iS related with atherosclerosisBecause ABCAl and SR-BICLA一1 play important roles in AS,we aimed at the two receptors to progress the following ant
16、iatherosclerosis researches and its upstream target mechanism researches1The discovery of the upregulators ofABCAl and CLA一1Firstly,we screened the compound library to search for active compounds that Canincrease ABCA 1 and CLA1 expressing level by a cellbased HTS method for万方数据北京协和医学院硕士学位论文 ABSTRAC
17、Tup-regulators of ABCA 1 and CLA1Among the compounds screened,E0869 and R20were found as the positive hit2The antiatherosclerotic activity of compound E0869 in vitroE0869 could upregulate the mRNA and protein levels ofABCA 1、SRBIJCLA1 and ABCG 1 genes in HepG2 and RAW2647 cells by RealTime Quantitat
18、ive PCR and Western blotting analysis,but could not influence the expression of FAS、SREBP1 c and CD36Foam cell assay showed that E0869 could inhibit lipids accumulation in mouse peritoneal macrophages RAW2647Cholesterol efflux assay showed that E0869 could induce HDLmediated cholesterol efflux in mo
19、use peritoneal macrophages RAW26473The anti-atherosclerotic activity and mechanism research of compound R20The active compound R20 was studied on cell level,and the results show that the active compound R20 could upregulate the mRNA and protein levels ofABCAl、CLA一1 and ABCG 1 genes in HepG2,but coul
20、d not influence the expression of FAS and SREBPl cR20 could inhibit lipids accumulation and induce HDLmediated cholesterol effiuxR20 is the derivative of the RUT,and RUT is the activator of TRPV 1Recent studies shows that activation of TRPVl can upregulate the expression of ABCAl and it is closely r
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