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蛋白纯化 protocol 精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢2 诱导表达诱导表达 1、挑取含重组质粒的单菌落至ml LB（含抗性）培养基中 37过夜培养。2、按 1100 比例稀释过夜菌，一般将 l 菌接种到含ml LB（含抗性）培养基的 5 ml 试管中,37 震荡培养至 OD6000.40.8（最好 0.6，单抗大约需.5 hr，双抗大约需.hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在合适温度下震荡培养hr。4、分别取菌体 0.5 ml,离心 10000 g 1 min 收获沉淀，用 l 蛋白 loading buffer 重悬，混匀，煮沸min。5、离心 10000 g 5 min，取上清作为样品,可做 SDS-PAGE等分析。蛋白质纯化蛋白质纯化 亲和层析 一、样品准备 1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-20 或立即进行步骤2操作。2)用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢3 3)10000 g，4 离心2030 min。取上清，置于冰上备用或-20度保存。二、层析 1)将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。3)用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化 4)分别用25倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。待清楚纯化条件后，就可只使用2个咪唑梯度纯化。5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。三、柱材料处理 1）用大约 10 倍柱体积的 Strip Buffer洗，流速 1 mlmin。2）用大约 10 倍柱体积的 ddWater洗，流速 1 mlmin。3）用大约 10 倍柱体积的 Charge Buffer 上镍，流速 1 mlmin。4）用大约 5 倍柱体积的 ddWater洗，流速 1 mlmin。5）用大约 10 倍柱体积的 Binding Buffer 平衡，流速 1 mlmin。精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢4 四、附件：溶液配方 Binding Buffer 20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5 M NaCl,5 mM 咪唑 Elution Buffer 20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5 M NaCl,1 M 咪唑 Charge Buffer 50 mM NiSO4（Nicl2）Strip Buffer 20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5 M NaCl,100 mM EDTA 离子交换层析法 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。离子交换剂预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带 H+或 OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为 H+型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的 pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢5 提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。加样与洗脱 加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的 pH和离子强度，所选定的 pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的 1-5。洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的 pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变 pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变 pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同 pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱 pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图 16-6。两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定 pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同 pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢6 洗脱馏份的分析 按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、SDSPAGE等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。离子交换剂的再生与保存 离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用 2mol/:NaCl 淋洗柱，若有强吸附物则可用 0.1mol/L NaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。凝胶层析 凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是 sephadex型号很多，从G10 到 G200，它的主要应用范围是：分级分离各种抗原与抗体；去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；分析血清中的免疫复合物；分子量的测定。（一）原理 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢7 行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。（二）葡聚糖凝胶的种类与性能 葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以 SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的 10 倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。表 18 Sephadex1的种类与特性 型号 分离范围（分子量）吸水量（ml/g）最小溶胀时（h）2025 100 床体积（ml）/干凝胶（mg）G10 700 1.0 0.1 3 1 23 G15 1 500 1.5 0.2 3 1 2.53.5 G25 5 000 2.5 0.2 3 1 46 G50 150020 000 8.0 0.3 3 1 911 G75 3 00070 000 7.5 0.5 24 1 1215 G100 4 00015 000 10.0 1.0 72 1 1520 G150 5 000800 000 15.0 1.5 72 1 2030 G200 5 00030 0000 20.0 2.0 72 1 3040 G25、G50 有四种颗粒型号：粗（100 300）、中（50 150）、细（20 80）和超细（10 40）。G75G200精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢8 又有两种颗粒型号：中（40 120），超细（10 40）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。表 19 DEAE纤维素与 Sephadex1比较 项 目 DEAE纤维素 Sephadex 交换量 小 较大 非特异性吸附 较大 小 分离纯度 较好 好 分离时间 较粗 较长 应用范围 较窄 较宽 预处理 繁琐 方便（三）试验方法 1凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的 G28 或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200 多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。2凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定（见表 110）。表 110 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量 层析柱规格 凝胶的规格和用量（g）直径（cm）高（cm）容量（ml）G25 G50 G100 G200 0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3 0.9 30 19 5 2 1.2 0.6 0.9 60 38 10 4 2.5 1.2 1.6 20 40 10 4 2.5 1.2 1.6 40 80 20 8 5.0 2.4 1.6 70 140 35 14 9.0 4.4 1.6 100 200 50 20 12.5 6 精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢9 2.6 40 210 50 20 12 7 2.6 70 370 90 35 20 12 2.6 2.6 100 60 530 1 000 130 250 50 110 30 70 17 35 为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置 20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。3装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25100 倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的 410 倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为 15125；对于纯化蛋白质来说应为 1201100。4加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的 15%，最多不要超过 10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过 4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和 pH值。分离血清蛋白常用 0.020.1Mol/L pH 6.98.0 的 PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl 缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。5洗脱液收集 同离子交换层析。6凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢10 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3 或 0.002%洗必泰）或高压灭菌后 4保存。此法至少可以保存半年以上。用完后，以水冲洗，然后用 60%70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用 95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于 6080干燥后保存。蛋白质在纯化分离后，需要把纯化过程中引入的有害离子除去，或者更换缓冲液，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用需要的缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。1.透析袋处理：透析袋在缓冲液（10mM NaHCO3，1mM EDTA）中煮沸 1530 min。2.用 ddWater 清洗透析袋内部数次，然后装入要透析的蛋白，放在透析缓冲液里透析。处理后的透析袋不要用手直接触摸，要带手套操作。注意事项：注意事项：精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢11 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑 3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。一、原核蛋白表达及纯化 1、怎样提高 E.coli中 6His 标签蛋白的表达水平？6 His 标签蛋白的表达水平低原因可能为：目标蛋白有毒或不稳定，或者是细菌生长过程中不能维持表达结构。有时候，插入片段的 5端序列编码了干扰转录或翻译的元件（比如有反向重复序列而形成茎环结构，掩盖了 Shine-Dalgarno 序列），在这种情况下，有必要检查和修改表达序列。改变培养基和宿主菌也可能会有所帮助。外源性蛋白的表达会使宿主菌生长迟缓。高速的转录、翻译重组蛋白所需要的代谢消耗，导致宿主菌生长的缓慢。低浓度下即影响宿主菌生长的基因产物被认为有毒，这样的产物包括细胞膜蛋白或与 DNA相互作用或干扰电子传递的蛋白。为了降低有毒蛋白在被诱导前对宿主菌生长的影响，在无诱导的时候的基础转录水平越低越好，并且诱导前的细菌传代数要控制在最小范围。细菌生长过程中质粒的丢失有时候可以通过在培养基中加入高浓度的ampicillin(200ug/ml)或 carbenicillin(50ug/ml)得到解决。对于一些不稳定的表达结构，应当避免过夜培养起始菌。先从新鲜的培养基上挑选单克隆，少量培养后，2000 倍稀释大量培养。含有疏水基团的重组蛋白往往对宿主菌有毒性。因此，除非有特殊的意义，应当去精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢12 除插入片段中编码信号肽序列或穿膜区的序列。然而，也有少数包含信号肽的蛋白可以在膜间质少量的表达。这种情况下，建议诱导前培养温度降低为 25 度。有些蛋白，尤其是小于 10KDa的蛋白在 E.coli 中不稳定，可能很快被细菌中的蛋白酶降解。克服这种困难的方法包括：降低培养温度到 30度；使用一种或多种蛋白酶缺陷的宿主菌；如果是纯化过程中蛋白易降解，则可以在纯化试剂中加入甘油以及蛋白酶抑制剂，并且确保整个操作在 4 度完成。2、如何在 E.coli 中表达高度毒性的蛋白？在 E.coli 中表达高度毒性的蛋白往往是很困难的。毒性基因表达泄漏会杀死宿主菌，尤其在早期的生长或转化后，可以使含有突变的不表达质粒的细菌选择性生长。因此，要表达高毒性的蛋白，需要更高水平的 lac 抑制蛋白。3、如何提高 E.coli中可溶性蛋白的表达量？在 E.coli 中表达的蛋白有时候形成不可溶的包含体。原因可能包括疏水基团的相互作用，半胱氨酸在 E.coli 胞质还原性环境中不能正确形成二硫键。一个方法是调整表达环境使生成少量的可溶的天然构象的重组蛋白。即使形成了包含体，一些带 6His 标签的蛋白仍可以在胞质中，这些胞质中的可溶性蛋白可以在天然的非变性的条件下被纯化。如果需要更多的可溶性蛋白，诱导后降低培养温度会有所帮精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢13 助。培养温度常常直接影响蛋白表达水平和可溶性，降低温度可以降低表达水平从而使可溶性蛋白量增加。另外，也可以在诱导前让培养物达到更高的细胞密度而表达期控制在最短时间。IPTG的浓度也可以降低，使表达水平降低 90%以上。并且，改变宿主菌也可能有效，因为某些菌比其它菌对某些蛋白的耐受性更好，可以生成更高浓度的可溶性蛋白。另外还能利用促进二硫键形成的各种载体标签。最后，很多蛋白需要金属协同因子才能够保持其可溶状态，因此在培养物中加入金属盐可能会有帮助。如果不知道蛋白所需的金属协同因子，则有必要测试不同的添加物。需要注意的是一些二价的阳离子会影响蛋白与 Ni-NTA的结合。4.目的蛋白为何在透析时沉淀?可能是蛋白疏水性太强，建议提高盐离子浓度，加入甘油。5、如何在使用 Ni-NTA纯化蛋白过程中去除富含组氨酸的杂蛋白？在结合试剂与洗脱试剂中加入 20mM的咪唑（即使在变性条件下），可以抑制杂蛋白的结合。实验中逐步提高咪唑的浓度，以确定最佳的去除杂蛋白的浓度。过量使用 Ni-NTA也会导致非特异性的结合。因此，对应于预期的表达蛋白量来确定合适的结合体系，可以减少非特异蛋白的结合。很多杂蛋白可能是由于非特异的离子作用引起的，因此纯化过程中确保在试剂中加入至少 300mM的 NaCl。精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢14 杂蛋白与 6His标签蛋白的非特异性结合也可能是通过疏水作用产生。在洗脱液中加入以下物质可以减少因此而产生的非特异性：非离子洗涤剂（Trion X-100 或 Tween 20）;30%的乙醇或甘油。注意，不同的蛋白纯化所需加入的最佳浓度不同，需要试验摸索。杂蛋白也可能是截断的标签蛋白。这样的杂蛋白可以用 Western Blot 技术很容易的识别。通过质粒测序，检查出内部的翻译起始位点或成熟前的终止子。6、Ni-NTA 是否能用于纯化含有内部 His 标签的蛋白？是的。Ni-NTA 可以与 His标签结合，无论标签位于蛋白的 N端、C端或是内部。需要注意的是，在非变性条件下纯化时，His 标签必须充分暴露在蛋白表面以利于充分的纯化。蛋白保存 使用强终止密码子 TAA TAA