新嗜热菌Thermoanarobacter-sp.YS13基因组序列以及生长和发酵性质的分析说课材料.docx
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1、此文档收集于网络,如有侵权请联系网站删除华中农业大学2016届博士研究生学位论文213主要仪器18215溶液1922方法2122I YSl3菌株的纯化和保藏21222 YSl3菌株的分子生物学鉴定21223 YSl3菌株在指定碳源中的生长和代谢23224不同培养温度下YSl3菌株的生长和代谢模式24225不同pH条件下YSl3菌株的生长和代谢模式25226 YSl3菌株可利用碳源的筛选25227 YSl3菌株发酵产物的测定和分析25228 YSl3基因组序列的测定27229比较基因组分析2831 YSl3菌株的分子生物学鉴定2932 YSl3菌株的碳源利用谱3233 YSl3菌株在不同碳源条件
2、下的代谢模式3434影响Thermoanaerobacter spYSl3生长和代谢模式的条件40341温度对Thermoanaerobacter spYSl3生长和代谢产物合成的影响40342初始pH对Thermoanaerobacter spYS 1 3生长和代谢模式的影响4235 Thermoanaerobacter spYSl3基因组特征4636 Thermoanaerobacter菌株全基因组比较分析。4637 Thermoanaerobacter菌株基因组排列。5 1II万方数据此文档仅供学习和交流新曙热菌Thermoanarobacter spYSl3基因组序列以及生长祀发酵性质
3、的分析38 Thermoanaerobacter菌株中同源基因和共享基因。5739 Thermoanaerobacter基因组中OHs分布57310 Thermoanaerobacter菌株的ABC碳水化合物转运体。5831 1 Thermoanaerobacter基因组碳水化合物代谢途径61致谢85附录86III万方数据新嗜热菌Thermoanarobacter spYSl3基因组序列以及生长和发酵性质的分析摘要全球人口的持续增长,环境问题的日益严重,以及传统化石燃料价格的大幅度 波动,导致了对生物新能源的需求与日俱增,特别是目前越来越多的科学研究旨在 寻找能合成生物能源的木质纤维素嗜热菌。
4、Thermoanaerobacter属菌株含有多种专 性厌氧嗜热菌,甚至其中一些菌株是颇具发展前景的高产乙醇菌株并己进行了广泛 的性质研究。一方面,Thermoanaerobacter属菌株的生长和发酵产物的合成与培养 温度、培养基初始pH以及碳源类型都具有一定的相关性。另一方面,基因组序列 的测定,有利于从基因组学的角度剖析菌株的碳源利用能力和发酵产物的合成能力。本研究中,加拿大湖首大学Lew Christopher教授从美国黄石公园的一处地热温 泉中分离得到一株专性厌氧嗜热菌YSl3。基于16S rRNA基因序列和cpn60 uT序 列的系统进化分析鉴定该菌株为Thermoanaeroba
5、cter属中一株新的嗜热菌并命名为Thermoaanerobacter spYSl3。纤维二糖或木糖作为碳源条件下,Thermoaanerobacter spYSl3能在4570 oC,初始pH 5O9O条件下较好生长,最适生长条件为65。C, pH 7075。YSl3菌株在1191培养基中以葡萄糖、纤维二糖或木糖为生长底物,其 代谢产物均为H2、C02、乙醇、乙酸和乳酸。YSl3菌株在葡萄糖或纤维二糖为碳源 条件下生长时,乳酸的合成占主导地位,而在以木糖为生长底物的1 191培养基中, H2和乙酸的合成量超过其他发酵终产物。当纤维二糖作为生长底物时,培养温度由 45。C升至70 oC,导致代
6、谢平衡由乙醇转向H2、乙酸和乳酸。当木糖作为生长底物 时,随着温度由45 oC升至65。C,代谢平衡由乳酸的合成转移至H2、C02和乙酸的 合成,而培养温度升至70。C,代谢平衡又由乙醇和C02的合成转移至H2、乙酸和 乳酸的合成。YSl3菌株无论以己糖还是戊糖为碳源条件下,当培养基初始pH由70 降至50时,其发酵代谢平衡分别由H2、乙酸和乙酸的合成转移至乳酸的合成。进一步地,由加拿大麦吉尔大学和魁北克基因创新中心对Thermoanaerobacter spYSl3基因组进行测序。YSl3菌株的基因组草图由5个contigs(2,638 bp)组 成,总的基因组大小为2,713,030 bp
7、,G+C含量为3405,含有2,779个基因,其 中2,707个为蛋白质序列编码基因,59个为tRNA,12个为rRNA。该基因组序列己存放于DDJBEMBLGenBank,其编号为J00100000000。万方数据华中农业大学2016届博士研究生学位论文由Thermoanaerobacter spYSl3和其它16个已测序的Thermoanaerobacter菌株 基因组进行的比较分析结果显示,尽管17个Thermoanaerobacter菌株来源不同的区 域和环境,但是他们的基因组大小和G+C含量具有高度相似性。但是,不同 Thermoanaerobacter菌株基因组中潜在的侧向位移基因
8、的数量和组成呈现明显的差异性。Thermoanaerobacter spYSl3基因组含有最多的侧向位移基因,并且其中大 分部为潜在的功能性蛋白质序列编码基因,而其它Thermoanaerobacter菌株基因组 中或者含有较少量的侧向位移基因或者所含侧向位移基因多为假定性基因。另外, YSl3菌株与Z uzonensis全基因组序列比较分析呈现最高的分享基因百分比和核酸 同一性值,这与前面以16R rRNA基因序列和cpn60 UT序列为基础的系统进化分析结果具有一致性。YSl3菌株与Z wiegelii Rt8B1有最相似的基因组排列,而与Thermoanaerobacter spX5 1
9、 3、Thermoanaerobacter spX5 1 4,Z siderophilus SR4和 Z pesudethanolicus 39E在基因组排列上显示较大的差异性。有趣的是, Thermoanaerobacter spYSl3与Zuzonensis的基因组相似性是低于 Thermoanaerobacter spYSl3与Z wiegelii Rt8B1相似性的,尽管它们在进化分析中 表现为最相近的关系。Thermoanaerobacter基因组中潜在的糖苷水解酶基因的多样 性与已进行性质研究的Thermoanaerobacter菌株多样的生物质水解表现型相关联。 由17个Ther
10、moanaerobacter菌株基因组组成的泛基因组中包含7,041核心和独特基因。通过对泛基因组进行分析,鉴定了28组来源于Thermoanaerobacte,菌株的ATP 结合盒(ABC)转运体基因。值得注意的是,Thermoanaerobacter spYS 1 3菌株含 有4个独特的ABC转运体蛋白编码基因,这些基因处于泛基因组中 Thermoanaerobacter spYSl3菌株的独特区域,而且这些可能转运蛋白基因大多数 源于基因的侧向位移。糖酵解代谢途径在所有Thermoanaerobacter菌株高度保守, 不过,可能的糖代谢编码基因因菌株不同而呈现分布的多样性。尽管在所有分
11、析的 Thermoanaerobacter基因组中均含有不同数量的乙醇合成相关基因,但是这些基因 大多数都是功能性质不确定的。关键词:厌氧嗜热菌,生物能源发酵,基因组测序和注释,基因组比较分析万方数据新嗜热菌z托瑚凇加蚰c据r spYSl3基因组序列以及生长和发酵性质的分析AbstractIncreasing research has been dedicated to the exploration of lignocellulytic thermophilic bacteria for biofuelThe genus Thermoanaerobacter contains a diver
12、se group of strictly anaerobic,thermophilica bacteria,and even,some of them have beenwell characterized鹤promising ethanologensCell growth and fermentation end-productssynthesis were aSsociated with incubation temperatures,initial pH of medium,and the type of carbon SOUCeOn the other hand,the compara
13、tive analysis on genome sequence for related strains was carried in order to identify putative genes encoding key metabolicenzymes,document the similar and difference on genome features,metabolic pathway,and end-products synthesisIn this study,a strictly anaerobic,thermophilic bacterium,designated s
14、train YSl3,Was isolated from a geothermal hot spring in YeUowestone National Park by DrLew Christopher in the University of LakeheadPhylogenefic analysis using the 1 6S dNAand cpn60 UT sequences suggested strain YS 13 as a species of Thermoanaerobacter Using cellobiose or xylose as carbon source,YS
15、1 3 Was able to grow over a wide-range oftemperatures(4570 oC),and pHs QH 509O),with optimum growth at 65 oC and pH7075Metabolic profiling on eellobiose,glucose,or xylose in 1 191 medium showedmat H2,C02,ethanol,acetate,and lactate were the major metabolitesLactate was the predominant end-product fr
16、om glucose or eellobiose fermentations,whereaS H2 and acetate were the dominant end-products from xylose fermentationnle metabolic balance shifted away from ethanol to H2,acetate,and lactate when YS 1 3 Was grown on cellobiose as temperatures increased from 45 oC to 70 oChen YS 13 was grown on xylos
17、e,a metabolic shift from 1actate to H2,C02,and acetate was observed in cultures as thetemperature of incubation increased from 45 to 65 oC,whereaS a shiR from ethanol and C02 to H2,acetate,and Iaerate WaS observed in cultures incubated at 70。CBetween cellobiose and xylose,the variation in pH from 70
18、 to 50 resulted in a shift from H2, acetate,and ethanol to lactateFuture,the genome of strain YS 1 3 WaS sequenced at the McGill University Genome Quebec Innovation CentreThe draft of genome consists of 5 eontigs(size2638 bp) with a total size of 2,71 3,030 bp,and a G+C content of 3405nle draft geno
19、me WaS submitted to the Joint Genome InstituteS(JGI)Integrated Microbial Genomes-ExpertReview(IMGER)platform and annotated using their annotation pipelineThe annotatediii万方数据华中农业大学2016届博士研究生学位论文genome sequence of Thermoanaerobacter spYS 1 3 is estimated to have a total of 2,779 genes,including 2,707
20、 protein coding genes,59 tRNAs,and 12 rRNAs。The genome of strain YS 1 3 has been deposited at DDJBEMBLGenBank under the accession number J00100000000Comparative genomic analysis of between strain YS 1 3 and 1 6 other sequenced Thermoanaerobacter strains was conducmdIn spite of 17 Thermoanaerobacter
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