细胞培养过程中的注意事项及试剂配制.doc
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细胞培养过程中的注意事项及试剂配制 一.常用设备 准备室的设备: 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品规(放置消毒过的物品)、包装台。 配液室的设备: 扭力天平和电子天平(称量药品)、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。 培养室的设备: 液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80℃)、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。必须放在无菌间的设备:离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱(放置serum和培养用液)。 二.无菌操作 无菌室的灭菌: 1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱(培养箱)灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射 3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟 4.实验后灭菌:用75%酒精(3‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 实验人员的无菌准备: 1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 3.用75%酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示: 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。 三.器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消: (1)新的玻璃器皿的洗消: 1.自来水刷洗,除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。 5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。 6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。 7.高压消毒后烘干 (2)旧的玻璃器皿的洗消: 1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。 2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液),12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。 3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上) 5.烘干备用:由于高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。 金属器械洗消: 金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压(30分钟)消毒,再烘干备用。 橡胶和塑料: 橡胶和制品通常解决方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的解决程序: 1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。注旨在超净台内取出使用时应当立即将螺旋旋紧。 2. 胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水解决30分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。 3. 胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(牢记时间不能过长),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。 4. 胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶,培养板,冻存管: 6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20230—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最佳。 为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现笔迹,从而可以鉴定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻(CoC12·6H2o)2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。 注意事项: 1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多由于其将使空气流畅受阻,会减少高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。 3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。 四.细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂: 干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。 具体环节: (1)水的制备: 细胞培养用水必须非常纯净,不具有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水. (2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制): 1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4·H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充足溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准拟定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 (3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒: 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反映不同样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度导致细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克减少胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用品有血清培养液或者胰酶克制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。 (4)青、链霉素溶液的配制于消毒 1. 所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完毕。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。 3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克? (5).RPMI1640的制备与消毒: 1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充足搅拌至粉剂所有溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。 2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。 (6)血清的灭活: 细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后,再通过抽滤方可加入培养基中使用。 (7)HEPES溶液: HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达成缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下: 准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。 注意:由于现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。 (8)谷氨酰胺: 合成培养基中都具有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺少要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应当补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入本来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充足搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 (9)肝素溶液的配制: 具有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。由于现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为 ℃ 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。 (10) Ⅰ型胶原酶: 0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶同样配制和消毒灭菌。注意:由于Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。 (11).明胶溶液: 由于明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。另一方面要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充足摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。 (12)其他培养用液的配制: 20ug/ml内皮生长因子, 注意事项: 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。 2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制RPMI1640培养基时由于还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。 五.细胞传代培养(消化法) 具体操作: (1) 传代前准备: 1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75%酒精擦拭通过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.对的摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作并且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观测细胞。 8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 (2)胰蛋白酶消化; 1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最佳,最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观测细胞:倒置显微镜下观测消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表白此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 (3)吹打分散细胞: 1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 (4)分装稀释细胞: 1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观测细胞:倒置显微镜下观测细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应当不低于5×105/ml。最后要做好标记。 (5)继续培养: 用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。 传代细胞培养注意事项: 1.严格的无菌操作 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应当注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方: EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g, 葡萄糖 2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。 六.细胞的复苏 细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞导致损害。 具体操作 (1) 实验前准备: 1.将水浴锅预热至37℃ 2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按顺序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 (2).取出冻存管: 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。 (3).迅速解冻: 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。 (4)平衡离心: 用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3min (5)制备细胞悬液: 1.吸弃上清液。 2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。 (6)细胞计数: 细胞浓度以5×105/ml为宜。 (7)培养细胞 将复合细胞计数规定的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误: 1水浴锅未预热或者未预热到37℃。 2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。 3.离心前忘掉平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。 4.一次复苏细胞过多,忘掉更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。 七.细胞计数 实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作: (1)准备工作: 取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。 (2)细胞悬液制备: 细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。 (3)细胞计数: 1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边沿缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。 4.记录四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观测,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格具有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度: (细胞悬液的细胞数)/ml= ( 四个大格子细胞数/4) ×2×104 说明:公式中除以4由于计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2由于细胞悬液于染液是1:1稀释。 公式中乘以104由于计数板中每一个大格的体积为: 1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3 (4)细胞计数要点: 1.进行细胞计数时,规定悬液中细胞数目不低于104个/ml,假如细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中; 2.规定细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。 3.取样计数前,应充足混匀细胞悬液,特别时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确; 4. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。假如细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。 5. 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。 (5)初学者易犯的错误: 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。 (6)本实验特殊试剂的配制: 4%台盼蓝母液:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。 使用液:使用时,用PBS稀释母液至0.4%即可。 八.细胞的冻存 1.先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。 2.接着置于-20℃冰箱,约30-60min。 3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。 5同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 注意事项: 1.使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它自身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构,以至于减少冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时最佳戴上手套操作。 2.不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤重要发生在这一温度区内,是“危险温区”。 3.注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。 细胞冻存、解冻方法与细胞计数 细胞冻存、解冻方法与细胞计数 一、细胞冷冻保存 1.材料: 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法: (1)传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,导致细胞大量死亡,亦可跳过此环节直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微减少一些。 (2)程序降温:运用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。合用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、环节: (1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处在指数生长期。 (2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。 (3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 (4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: (1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 (2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。 (3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在启动后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可减少细胞受损。DMSO也许引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。 (4)冷冻保存之细胞浓度: ①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml ②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。 ③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml ④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml。 (5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不拟定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。 (6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有助于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。 二、冷冻细胞活化 1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞导致伤害,导致细胞之死亡。 2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 3、材料 37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 4、环节: (1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管也许爆裂之伤害。 (2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。 (3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。 (4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内所有融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。 (5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。 (6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入具有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。 (7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。 三、细胞计数与存活测试 1、原理: (1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。 (2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。 (3)存活测试之环节为dyeexclusion,运用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,假如细胞不易吸取trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完毕,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;由于台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。 2、材料: 0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。 3、环节: (1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。 (2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观测,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。 (3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml 计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。 5、范例: T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。 活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243 平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2; 细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106; 细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106 存活率:225/243﹦92.6%- 配套讲稿:
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