细胞培养过程中的注意事项及试剂配制.doc
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1、细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备 准备室的设备: 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品规(放置消毒过的物品)、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平(称量药品)、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。培养室的设备:液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80)、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。必须放在无菌间的设备:离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱(放置serum和培养用液)。二.无菌操作 无菌室的灭
2、菌: 1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱(培养箱)灭菌:先用3新洁尔灭擦拭,然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸,再用紫外灯照射3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌:用75酒精(3新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备:1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示: 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠
3、近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。三.器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消: (1)新的玻璃器皿的洗消: 1.自来水刷洗,除去灰尘。2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸
4、缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干(2)旧的玻璃器皿的洗消: 1刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液),12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装:
5、洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)5.烘干备用:由于高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消: 金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压(30分
6、钟)消毒,再烘干备用。橡胶和塑料: 橡胶和制品通常解决方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的解决程序: 1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。注旨在超净台内取出使用时应当立即将螺旋旋紧。 2. 胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水解决30分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高
7、压消毒,烘干备用。 3. 胶帽,离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(牢记时间不能过长),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。 4. 胶头可用75酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶,培养板,冻存管: 6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。用20230100000rad的r射线消毒塑料制品效果最佳。 为了防止
8、清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现笔迹,从而可以鉴定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻(CoC126H2o)2g,30盐酸10m1,蒸馏水88m1。 注意事项: 1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多由于其将使空气流畅受阻,会减少高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手
9、套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。四.细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂: 干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体环节: (1)水的制备: 细胞培养用水必须非常纯净,不具有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.(2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制): 1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有
10、双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充足溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准拟定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 (3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒: 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反映不同样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度导致细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋
11、白质克减少胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用品有血清培养液或者胰酶克制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。 (4)青、链霉素溶液的配制于消毒 1. 所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完毕
12、。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。 3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位1微克?(5).RPMI1640的制备与消毒: 1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充足搅拌至粉剂所有溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml
13、,摇匀。 2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。 5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4时两周有效)。 (6)血清的灭活: 细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56水浴中灭火30分钟后,再通过抽滤方可加入培养基中使用。 (7)HEPES溶液: HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethane
14、sulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达成缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下: 准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4保存。 注意:由于现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2m
15、l即可。 (8)谷氨酰胺: 合成培养基中都具有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺少要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应当补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4下放置1周可分解50,故应单独配制,置于-20冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时,应重新加入本来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充足搅拌溶解后,过滤除菌,分
16、装小瓶,-20保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 (9)肝素溶液的配制: 具有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。由于现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。 (10) 型胶原酶: 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶同样配制和消毒灭菌。注意:由于型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。 (11).明胶溶液: 由于明胶
17、难于过滤,所以配制0.1明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)即解决无菌分装药品的问题。另一方面要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充足摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4保存。 (12)其他培养用液的配制: 20ug/ml内皮生长因子, 注意事项: 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。 2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制RPMI1640培养基时由于还要加入小牛血清,而小牛
18、血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。 五.细胞传代培养(消化法) 具体操作: (1)传代前准备: 1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。2.用75酒精擦拭通过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.对的摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作并且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶
19、盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观测细胞。 8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。(2)胰蛋白酶消化; 1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最佳,最佳消化温度是37。 2. 显微镜下观测细胞:倒置显微镜下观测消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表白此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 (3)吹打分散细胞: 1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:
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