液相基本术语及操作备课讲稿.doc
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1、液相基本术语及操作精品资料 液相色谱检测1 仪器的基本常识及术语1.1 仪器结构:液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器;1.2 仪器分类:液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器;按照分为离机制,吸附、分配、离子交换、亲和色谱,体积排阻色谱;按照流动相与固定相的极性,分为正相色谱法和反相色谱法;1.2.2 高效液相色谱法的应用范围:高效液相色谱法适用于高沸点不易挥发、受热不稳定易分解、分子量大的,不同极性的有机化合物,生物活性物质和多种天然产物,合成的和天然的高分子化合物等。1.3 仪器检定:液相色谱仪检定周期为1年,在两次检定间期内进行一次期间核查,也可以根据情况增加核查次数;1.4 维护
2、保养:对于液相维护方式主要是周维护和日维护,其中周维护包括联机系统及中工作站软件维护、数据库整理备份、检测器自检、维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗等;日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉淀;1.5色谱法的常用基本术语基线:在色谱操作条件下,没有被测组分通过鉴定器时,记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线.死时间,保留时间及校正保留时间:从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间,以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间,以tr表示.保留时间与死时间之差称校正保留
3、时间.以Vd表示.死体积,保留体积与校正保留体积:死时间与载气平均流速的乘积称为死体积,以Vd表示,载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积,以Vr表示,Vr=trxFc峰面积:流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积,用A表示.拖尾因子:是反映峰对称性的指标,计算公式:拖尾因子 TW0.05h/2d1(其中W0.05h为5%峰高处的峰宽,d1为峰顶点至峰前沿之间的距离)。峰高与半峰宽:由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高,一般以h表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽,一般以 x1/2表示; 1.7 色谱检测的特性(1)灵敏度高
4、;(2)线性范围宽;(3)分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系:(4)分离度与柱效的平方根成正比,选择因子一定时,增加柱效;(5)分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数,随分离柱温度、柱压的改变而变化:一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温,可增大选择因子;(6)增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。对于液相色谱,改变流动相的组成,可以有效控制k;2 仪器的操作规程2.1 日立液相设备 L-2000/2400操作规程2.1.1 使用环境环境温度:455;相对湿度:小于95%RH。2.1.2 使用前准备检查所用溶液(如流动相,乙腈等)是否足够。检查线
5、路是否连接正常。2.1.3 设备操作方法具体操作如下:(1)依次开启泵开关,检测器开关,自动进样器开关,柱温箱开关;(2)打开软件,点击“i”按钮,出现联机界面,点击“Iinitialize” ini.laiz按钮,当文本框出现文字时,表示联机成功;(3)检查所用方法是否符合要求。如不符合,进行设置;(4)开泵。检测具体操作如下:(1)建立所需样品盒;(2)点击检测按钮,选择刚建立的样品盒;(3)首先进行走基线;(4)当基线走平时,点击系列样品检测按钮,进行标样,样品检测;(5)当标样检测结果出来时,打开结果窗口,选择所需标样结果,点击“Recalculateri:klkjuleit进行重新计
6、算,然后点击“Calibration” klibrein进行定标;(6)当样品结果出来时,打开结果窗口,选择所需样品结果,点击“Recalculate” ri:klkjuleit进行重新计算,然后点击“ModifyReport” mdifai, rip:t,出现结果报告,即可查看样品具体结果。2.1.4 更换流动相具体操作如下:(1)当流动相快不够时或异常时,及时更换流动相;(2)先把泵关闭,将流动相入口放入新流动相中;(3)将泵阀逆时针旋转,进行排气。大约3分钟后,关闭排气功能;(4)排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵; (5)走基线,当基线走平时,开始做标样,做样。2.1.5 关机具体
7、操作如下:(1)先把泵关闭,将流动相入口更换为超纯水;(2)将泵阀逆时针旋转,进行排气。大约3分钟后,关闭排气功能;(3)排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵;(4)用超纯水冲洗管路大约20分钟;(5)把泵关闭,将超纯水更换为100%甲醇或100%乙腈;(6)将泵阀逆时针旋转,进行排气。大约3分钟后,关闭排气功能;(7)排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵;(8)用100%甲醇或100%乙腈冲洗管路大约30分钟;(9)关泵,关液相软件,关泵开关,检测器开关,自动进样器开关,柱温箱开关。2.1.6 维护保养、注意事项(1)进行旬维护检查工作,主要检查事项:软件是否正常、温度、清洗、进样器、泵
8、单元;(2)每次测量前进行标样检测,斜率达到99.99%要求才能检测样品,测完样品及时清理。(3)按要求进行每天2个小时以上的清洗。2.2 Waters高效液相色谱-2695/24892.2.1开机自检具体操作如下:(1)打开Alliancelains 2695和2489 的电源开关至 ON (1) 的位置,仪器开始进行自检;(2)仪器将进行大约5分钟的自检过程,待仪器自我测试完毕后,出现以下画面,画面上方的状态显示区会出现“Idle” aidl状态,表示开机测试正常。2.2.2 流动相有机溶剂要求用色谱纯(进口名牌最好),水或缓冲盐溶液要用超纯水(电阻率:18.2M),每48小时制备新鲜的水
9、相流动相,尤其是100% 含水流动相使用时间不超过两天。6根管子都在液面以下。溶剂的位置必须高于溶剂混合阀(Gradient Proportioning Valve)。greidint prp:ni vlv清洗柱塞密封垫(Seal Wash) si:l w 的溶液:含5%10%甲醇的超纯水。洗针液(Needle Wash) ni:dl w:50%甲醇:50%水(该比例仅适用于反相试验)。注: 以上溶剂或溶液均需用0.45m的膜过滤并超声脱气1分钟,用洁净的玻璃容器盛放,避免污染,同时玻璃容器应用超纯水来清洗而不能用自来水。2.2.3灌注柱塞密封清洗清洗操作步骤:(1)回到Menumenju:
10、画面,选择Diag;(2)确定Seal Washsi:l w的管路放在正确的位置;(3)按Prime Seal Wash praim si:l w,再按Start,直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管,按Halt;h:lt(4)按Close。注意:密封圈清洗(Seal wash) si:l w溶剂,在反相液相色谱中可使用Water/ MeOHmethyl alcohol 甲醇 =90/10或Water/Acetonitrile situnaitril乙腈 =95/5(根据实际需要使用不同溶剂)。2.2.4 灌注针头清洗操作步骤:回到Mainmein的画面,选择Diag,选择Primepraim
11、 Ndl Wash。设定值为30 秒,若想要多清洗几次时,请按Start Again。清洗溶剂:50%的甲醇溶液注意:若上述清洗溶剂无法避免进样时的交叉污染,使用较强的溶剂系统来进行清洗操作。2.2.5 打开真空脱气机如液相仪管路干,可进行使用,如管路不干则按照以下步骤进行操作:按“Menu/Status” steits键,进入Status (1)画面;利用方向键将光标移至“Degasser” di:gs位置,按Enter;利用上下键选择模式为ON。注意:在开启除气装置时,要确认所有溶剂管路都充满溶剂;若没有溶剂时请执行溶剂的Dry Primedrai praim操作。2.2.6 执行干灌注确
12、定流动相溶剂的管子放在正确的位置,检测器(Detector ditekt)废液管及定量环(Sample Loop lu:p)的废液管是否放置于适当的废液容器中。摇动溶剂瓶内的过滤器(Solvent Filter) slvnt filt,防止气泡附着在过滤器的外表面。将空的针筒插入抽液阀(Prime/Vent value)中,以逆时针的方向旋转3圈。按“Menu/Status” steits键,进入Status(1)画面,按“Direct Function” direkt fkn功能键,选择Dry Prime,按Enter。按下面使用的溶剂开启阀门(例如:Open A),然后将针筒向外拉,抽出5
13、10mL溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡,完成后关闭Prime/Vent阀门。在“Enter a duration” djurein中输入3分钟,按“Continue” 键,泵即以3.0mL/min的流速进行清洗(Purge)。可重复上两个步骤,将所要使用的流动相溶剂Dry Prime。2.2.7 执行湿灌注按“Menu/Status”键,进入Status(1)画面,利用方向键将光标移至“Composition” kmpzin字段,将欲Wet Prime 的溶剂输入100%。按“Direct Function” direkt fkn 功能键,选择Wet Prime,按Enter。Wet Prim
14、e的原设定值,一般为Flow Rate:7.5mL/min,Time: 3.0min,然后按下“OK”键,泵即开始进行Wet Prime操作。重复上述的步骤直到所有溶剂Wet Prime进行完毕。2.2.8 设定流动相平衡色谱柱按“Menu/Status” 键,进入Status (1)画面,利用方向键将光标移至“Composition” kmpzin字段,利用仪器面板右侧的数字键设置试验要求的溶剂组成比例,此时会在原溶剂比例表的下方出现新编辑溶剂比例表(New Composition)。设定好新的溶剂组成比例后,按“Change Comp” teind kmp功能键(改变溶剂组成比例chang
15、e composition),此设定的溶剂组成比例即为当前的比例。利用方向键将光标移至“Flow” flu字段,利用仪器面板右侧的数字键设定流速,此时仪器即设定的溶剂组成比例和流速来平衡色谱柱。特别提示:对于常规的反相色谱试验至少要用30倍柱体积来平衡,而对于离子对色谱的平衡可能需要多达500柱体积的流动相来平衡。2.2.9 冲洗进样器溶剂管理系统的前处理( Prime the solvent management system)要求如下:(1)改变溶剂;(2)发现注射针头内有气泡;(3)每天开机的时候。冲洗进样器执行步骤:(1)按“Menu/Status”键,进入Status(1)画面,在设
16、定溶剂的画面中设定适当的流速与溶剂比例;(2)按“Direct Function” direkt fkn键,选择Purge Injectorp:d indekt,按Enter;(3)输入Sample Loop体积清洗的倍数(原定值为6 倍),按Enter;(4)压缩测试(Compression Check)请先不需要测试,设定完成后按OK。2.2.10 放入样品盘打开计算机,运行Empowerimpau软件,选择存放数据文件的Project,运行Run Samples;按Develop Methodsdivelp med按钮,建立方法;按Monitormnit按钮,观察基线,待基线平稳,可准备
17、进样。2.2.11 关机首先关闭检测器电源;在2695溶剂槽中换上适当的清洗溶剂,清洗系统约60分钟(针对离子对试验,建议50%乙腈:50%水1mL/min流速冲洗色谱柱2小时以上);按2695面板Diag键,选择Prime SealWash,清洗泵头约1分钟;再选择Prime NdlWash,清洗进样针12次;按Menu/Status键进入手动控制模式,按Direct Function direkt fkn键,选择Purge Injectorp:d indekt,冲洗进样器(针对离子对试验,建议设定50%乙腈:50%水的溶剂来冲洗进样器);降低流速至0,待系统压力回零后,关闭2695电源,关
18、闭计算机及显示器电源。2.3岛津LC-20AT液相色谱仪操作规程2.3.1准备工作在开机之前,根据所做样品的方法要求,准备好所用流动相,标样及样品。流动相抽滤后超声脱气15分钟,标样和样品0.45um膜过滤。打开LC-20A2SETS,CTO-10ASvp,SPD-M20A(或RF-10AXL)电源,待自检通过。打开SCL-10Avp电源,检查开机屏幕应显示各单元,如果某单元没有显示,则不能控制该单元,需按f2键取消屏幕Fixed标志即可显示并控制该单元。否则检查通讯设置。打开计算机电源或重新启动计算机,待正常进入WINXP操作系统。 排空操作:打开LC-20AT泵排空阀(逆时针180度以上)
19、,按Purge键,泵开始排空运行。检查流动相入口Teflon管路没有气泡后,再按Purge键停止排空。 压力调零:如果purge时,压力不为零,需要进行压力调零,按LC-20ATvp泵Func键选择CONTROL 项,按FUNC键直至屏幕显示 *ml ZERO ADJ项,按Enter键,再按CE键,即完成调零。然后关紧排空阀(顺时针旋紧)。在计算机中双击LC SOLUTION图标,进入工作站。 再双击OperationAnalysis 14进入实时分析窗口(根据不同的检测器选择)。在开机画面中,User ID选中Admin,不需输入Password,点击OK(可听到峰鸣一声),在下面操作中AB
20、表示在A菜单下选择B,以此类推。选中表示在中打号。在左侧助手栏给出了引导顺序操作的图标,自上而下顺序执行即可(可以跳过执行):(1)System configuration系统配置(第一次安装或更换检测器时配置,通常跳过不操作);(2)System Check编辑仪器检查参数:并且RUN运行检查。通常不操作(跳过);(3)点击Data acquisition进入采集数据编辑方法界面点击Instrument Parameter进入仪器参数设置界面:选中Normal(通用简单)或Advanced(高级详细)项,分别设定Pumps泵参数,Oven柱箱参数,Detecter检测器参数,Controll
21、er系统控制器参数,Time Program时间程序参数等。仪器配置不同,控制单元项的数目多少不同;Pumps泵参数:Mode控制方式,Flow流速,B,C,DConc各项浓度,P Max最大压力;Oven柱箱参数:Oven设定温度,T Max最大保护温度;Detecter检测器参数:Cell设定池温。Wavelength设定波长;Controller系统控制器参数;Data acquisition选中Acquisition Time后,设置分析时间,等等;LC Time Prog时间程序参数:编辑泵梯度洗脱程序,也可以控制柱箱,检测器等等;(4)点击MethodData Analysis P
22、arameter编辑积分参数:设置 Width峰宽,Slope斜率,Min Area最小峰面积等等。新建方法推荐使缺省值,待分析完样品后再设置此项参数,得到优化的色谱数据结果后,将参数保存在当前方法中;(5)保存方法:点击FileSave Method as如图:起文件名*保存后,该方法即作为当前运行的方法;(6)下载方法:点击Down Load 键,向仪器传送参数。2.3.2运行方法点击如图图标(Instrument On/Off 系统 开/关)系统开始运行,检查各单元参数应与方法设定一致。等待系统平衡。一般情况下,由于流动相不同,交换平衡时间不定。可以观察Detecter检测器吸收变化,如
23、果吸收值稳定不变,即认为接近平衡,可以调零等待,确认不变后,准备进样分析。可以通过改变衰减或予览基线观察基线变化,待基线平稳(初始化显示时与横轴平行),准备进样操作。2.3.4进样分析如下:(1)单针进样分析:如图点击Single Start图标:出现如下采样对话框;(2)编辑样品参数:Sample ID样品信息,Method Name 方法文件名,Data Path 数据存储路径,Data Name 数据文件名,Vial样品瓶号(无),Tray#架号(无),Injection进样量等;(3)点击OK后,开始进样操作(重复单针进样,重复执行第7步骤即可);(4)每个样到时间分析结束,根据方法中
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