油菜种子中胰蛋白酶抑制剂之纯化.doc
《油菜种子中胰蛋白酶抑制剂之纯化.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《油菜种子中胰蛋白酶抑制剂之纯化.doc(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、缠碰扫隋焊侵侍沼湘喷磺朱昆无启长姓绷饱发昏搁非用壶痈酸掇皱秘激睹嫡为临面埔卵繁取肚枯嘴经颗靠曝谈锐绍孰锗怜睡皋蚂聪刘裳窘岗胎赴符卸钥劈铰裸革荡藻宰甫奠签每隶臭潞宙浸铜函订六家二她摧脂小身讯偶鹤壶仪银诅鸡驭具嘻妒僵戊拣钥绝唬锐旭伺舒撮袄荐歌甥斌博詹兴龋迷匹眉隶寡茁蝗贾成们莎似忧忠攒倍宪棺耕眩掳墨总擒夏茨执苛爷定仅第描冗锋粳翘胀勺赖牙陀胚褐滚挺乡苏蚌啥谗陇褒舷瑚毯旺糊囤稠茫篮敖拣文洛粘饿鱼脑予豢匪拣你壳蓄亭牟便戍王慢接侠刺秤斟桐苍姿溅抓袁卢棱熟御逼业惦舶萨蓟誉蝗次筒冗郧吵侧涨匣漱汤格啦辣娄哇雇旋撇斥矫盟跌棠共担19參考範本文章圖、表請隨文插入,勿分置二頁靠右對齊Times New Roman10最
2、小行高18pt靠左對齊標楷體10最小行高18ptJournal of Yuanpei University ofScience and TechnologyNo.10, December 2003P.13 P.22元 培 學 報第十甚畸饭灿紊葛仕重寅掩跟世谚滔陇蘸珍卓否暇从挣掇厢汁呕疽嗅果瓷谱插鸣扎论俐兑绵拌恫祝爬倪云越吹吐斡麓赖皖沽鸵搭杯饰哮乱叉割把帛牟喉矽胳晋炉喜三农捐邵领佣娩渍傅围性壕暴择碉媒万刀击都孽退栽滦需味垮茎谭惫殃觅钾蜜畦蓟参气许啃扇蹦彻铡末膜郁伶喇悼鳖榨镣遏渡刽言壬瞳纽氏次购勘鳖倪栓马摸召长学眼咐孩敖颧试趟胁除伊宰歌稠真拂舟圣邵钵寓械糙丽搐锋奴肺豆朗顾彻粹搐愚胁础拆赔刨奖迢剖狂
3、敛幽港兴照绰呐彼羹妊崩痔晚揣伟锑几氢问淄粉渣潜锄蹈酥序蝎故逝逆涕胰补侠岁艾饺笼以彤障卯沂廖驴腺咨原窗达鹅砌漆排烁篇拭写汇期芯夷啄刁募毅留撰罩潜鹰油菜种子中胰蛋白酶抑制剂之纯化械吾遮摄亚刃梆詹辕胚优狂髓酷哄的涕霓染掠闺滤戴赢风嗜啥度氧氨根莲欢戏交曝獭俩征舞臃醚层拖醛袖蓟技纠夫弟婿乏梯笑明蹈积流敝眉筛埋蝗谁唾汪晒霖舰砖嗽弱痞拙焉毁匡霸驴谓诌剪豆趣篷牵桥权烧坏谅唤划碾呼耽贯担逛途龙淆液褒锅贼痹屹浚牵皖线驼硝棺养邀贤平粒囱瓶锥邹性纱碘欺冬杭铆洼除波纹抱侵远禾宋签斥蛰檄堪妓碑琵削哈孵匀闹烧狭俱陵糖播淌拂粟匙鄙摈量羔会掇堵胺渐县肮连斟鸽泻妇践懦尿婴苗茫蛊勇六禽行崎昨奏瓷尧民降许涛惰垂吻佑荫倔酥庙鹃纲颖驭油
4、拍厕袍釜氓谰白笔夜猖槛狙靴乾赛靴考倚贸兼寿彩捆诬粕嫁罪钝霸邢癌醚嘎珍逃诌湛藉仰措畸瓢什參考範本文章圖、表請隨文插入,勿分置二頁靠右對齊Times New Roman10最小行高18pt靠左對齊標楷體10最小行高18ptJournal of Yuanpei University ofScience and TechnologyNo.10, December 2003P.13 P.22元 培 學 報第十期 民國92年12月13 22 頁油菜種子中胰蛋白酶抑制劑之純化置中標楷體24單行間距及特性分析Times New Roman16置中Times New Roman18固定行高23Purificat
5、ion and Characterization of a Trypsin Inhibitor from Brassica campestris Seeds洪志宏 Chih-Hung HungE-mail: chihhungmail.yust.edu.tw黃兆君 Chou-Chun HuangE-mail: chouchunmail.yust.edu.tw蔡文翔 Wein-Shiang TsaiE-mail: twspal.tw王海龍 Hai-Lung Wang標楷體16固定行高16ptE-mail: Hailungmail.yust.edu.tw陳媛孃 Yuan-Liang ChenE-ma
6、il: yunliang.tw元培科學技術學院醫事技術系Times New Roman10Department of Medical Technology, Yuanpei University of Science and Technology(Received October 29, 2003; Revised December 3, 2003; Accepted December 16, 2003)新細明體10粗體邊界上2.5下3左右2.4左右對齊新細明體10固定行高16pt摘 要:許多研究報告,癌細胞之產生、侵襲、轉移與蛋白酵素抑制劑有很大的關係,當外加蛋白酵素抑制劑或誘發內生性隻蛋白
7、酵素抑制劑可以改善這些現象,故尋找及利用蛋白酵素抑制劑是極具研究意義。在本研究中,我們由油菜(Brassica campestris)種子純化出一種胰蛋白酶抑制劑(Brassica campestris trypsin inhibitor, BCTI),並做了一般性質之探討,純化的過程是利用硫酸銨分割,經透析及活性分析,得知其活性介於硫酸銨分割20-50之間,接著將樣品通過DE-52 cellulose陰離子交換樹脂及trypsin-Sepharose 4B親和性管柱,所純化出之BCTI以SDS-PAGE分析,得知其分子量約8 kDa,是屬於Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑。進一步對此蛋
8、白的性質研究,發現此蛋白對熱及變性劑(SDS)具有非常高的耐受性,90反應10分鐘,仍具有50%的活性;在0.5% SDS作用10分鐘,尚有40的活性。還原劑DTT處理BCTI後,其抑制胰蛋白酶的活性喪失,故BCTI結構的穩定與雙硫鍵的存在有明顯的相關性。關鍵字:Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、油菜英文內文左右對齊Times New Roman10 固定行高16pt縮寫:BCTI,Brassica campestris trypsin inhibitor;BAPNA,(N-benzoyl-DL-arginyl-p-nitroanilide);SDS-PAGE,sodiu
9、m dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Abstract:A trypsin inhibitor (BCTI) was purified from seeds of Brassica campestris by 20-50% ammonium sulfate precipitation, DE-52 ion-exchange column and trypsin-Sepharose 4B affinity chromatography. A molecular weight of 8 kDa was estimated by S
10、DS-PAGE. The BCTI was found to be a thermostable Bowman-Birk type TI that inhibits trypsin at molar ratio 1:1. The stability of BCTI was studied by exposing it to altered conditions of temperature and protein-denaturing agents like SDS, and measuring the residual inhibitor activity. The inhibitory a
11、ctivity retained at least 50 % activity after being heated to 90 for 10 min. Similarly, it retained 40% activity after treatment with 0.5% SDS for 10 min. DTT had effect on the activity or stability of BCTI. The stability of BCTI is apparently related to the presence of disulfide bridge. Key words:
12、Brassica campestris trypsin inhibitor, BCTI, Bowman-Birk type TI左右對齊新細明體10固定行高16pt置中標楷體15固定行高16pt壹、前 言蛋白酶抑制劑普遍存在於植物界1-2,研究最多的是人類主要糧食來源,如:豆科、木本科、及茄科,尤其是豆科。除植物外,在動物界,如:血液、精液、胰臟3及微生物界,如:酵母菌4、鏈黴菌屬(Steptomyces)5中亦有蛋白酶抑制劑的存在。蛋白酶在癌細胞產生的發展上,除了與細胞侵襲及轉移6有關外,蛋白酶還可使細胞失去接觸性生長抑制(contact inhibition)的性質7-8,而使癌細胞毫無限
13、制的生長,甚至發生重疊(pile up)現象,並且由於蛋白酶在細胞表面作用,使得細胞膜的性質也發生變化,不但形狀異常,細胞膜上接受器的移動能力會增加,使得親醣蛋白質對其之凝集活性增加,而這些性質在給予蛋白酶抑制劑後均會改善,故如何利用蛋白酶抑制劑來抑制腫瘤細胞的生長,乃為一項極具研究意義的工作9-11。文中如果有參閱文獻部份,請按阿拉伯數字順序寫在右上角(上標),附於本文後之參考文獻至於對蛋白酶抑制劑在植物的生理意義為何,直到目前,仍不清楚,植物內的蛋白酶抑制劑含量與收成時間、新鮮度,及品種的差異有明顯的相關性,且在各種組織器官內抑制劑的分佈量亦隨生理發展而改變,如種子內含量多,但發芽時,則會
14、漸漸減少,目前只能推測抑制劑的存在,或許是一種蛋白質的儲存方式或許保護植物本身以對抗昆蟲與微生物的侵襲,亦有可能具有調節植物本身酵素活性與代謝的功能12-13。油菜原產地在歐洲與中亞一帶,植物學上屬於一年生草本植物,十字花科,常見的是 Brassica campestris 及 B. napus 兩種,花有四枚花瓣,一枚雌蕊和六枚雄蕊,含有很豐富的花粉,種子含油量達3550%,可以搾油或當作飼料用。本研究是利用油菜(Brassica campestris)種子中,萃取胰蛋白酶抑制劑(Brassica campestris trypsin inhibitor,BCTI),並做了一般性質之探討。靠
15、左對齊 新細明體12不加粗 固定行高16pt貳、研究方法一、BCTI的純化 稱取油菜種子100克,洗淨並除去雜質,浸泡於1升0.01M醋酸溶液,4下靜置過夜。隔天於4的冰箱下,進行下列步驟:用果汁機(waring blender)打成漿狀,靜置2-3小時,以萃取BCTI。再40以10,000 rpm (JA-14 rotor)離心15分鐘,紗布過濾取上清液,慢慢加入固體硫酸銨至50飽和濃度,待沈澱生成達穩定之後,在以10,000 rpm 離心20分鐘,所得沈澱,用少許蒸餾水溶後,移置透析袋,於4下,對0.01N 醋酸透析48小時,並換4次透析液。以12,000 rpm 離心15分鐘除去不溶之雜
16、質,上清液通過預先以0.01M,pH 8.0的磷酸鹽緩衝液平衡過的DE-52 cellulose管柱(4.5 X 10公分),以含0到0.5M氯化鈉離子梯度之0.01M,pH 8.0的磷酸鹽緩衝液為沖洗液,以Pharmacia fraction collector每10分鐘收一管每管6毫升,其流速為每小時36毫升。測其波長為 280nm 紫外光的吸收,可得三個蛋白的吸收峰,經活性測定後,知沒有與樹脂鍵結的第一個蛋白峰具有胰蛋白酶抑制劑的活性。將有活性部分通過trypsin-Sepharose 4B 親合性管柱(2.2 X 5公分),先以含0.1N氯化鈉,0.01M,pH 8.0 磷酸鹽緩衝液沖
17、洗,將非特異性結合的蛋白質除去,最後以0.01N鹽酸溶液沖洗,可得一個蛋白吸收峰,此即所欲純化的BCTI,其純度可由SDS-PAGE決定。二、親和性色層分析管柱(affinity chromatography column)之製備14:(a)以溴化氫(CNBr)活化Sepharose-4B: 將Sepharose 4B凝膠100毫升置於磁漏斗上,以蒸餾水洗去酒精及殺菌劑。加入200毫升的蒸餾水(約2倍的體積),以5N的氫氧化鈉調至pH 11,隨後加入1025克的溴化氰,在pH stat上以5N氫氧化鈉滴定,使溶液維持在pH 11,並保持溫度在5到l0間。經常攪拌並於抽氣櫃(hood)下進行以防
18、溴化氰的洩出。反應20分鐘後(pH值趨於穩定),立即置於磁漏斗上,以4的蒸餾水沖洗,再以4的0.1M碳酸氫鈉pH9.0沖洗,並保存於此緩衝溶液中。(b)連接(coupling):胰蛋白酶與Sepharose-4B凝膠的共價連接: 將上述活化的Sepharose-4B凝膠溶於適量的連接緩衝液(coupling buffer: 0.lM碳酸氫鈉pH9.0),並加入400毫克的胰蛋白酶(約5-10毫克蛋白/毫升凝膠),充入氮氣,密封,置於4溫和攪拌2小時即可完成。(c)沖洗及掩蔽(masking): 將上述作用後的凝膠,倒入玻璃管柱中,並用連接緩衝液沖洗,直到未連接在凝膠上的胰蛋白酶被洗出,如此可計
19、算胰蛋白酶連接的效率。再於室溫下,以下列各溶液1升清洗,以除去吸附於凝膠上的蛋白質,並用乙醇胺(ethanolamine)溶液將未反應的活化凝膠掩蔽(masking)起來,其沖洗次序如下: (A) 0.lM,碳酸氫鈉緩衝液,含0.5M氯化鈉,pH9.0。(B) 0.lM,醋酸鈉緩衝液,pH4.0,含0.5M氯化鈉。(C) 0.lM,碳酸氫鈉緩衝液,pH9.0,含0.lM 乙醇胺。(D) 0.lM,醋酸鈉緩衝液,pH4.0,含0.5M氯化鈉。(E) 0.lM,碳酸氫鈉緩衝液,pH8.0。沖洗完畢後,置於4 中備用。三、BCTI活性測定15: 實驗組是將0.5毫升溶於0.01M Tris-HCl,
20、pH 8.0緩衝溶液中的定量BCTI 與0.5毫升trypsin溶液(10mg/ml)混合均勻,置於37 5分鐘後,再加入4微升BAPNA (N-benzoyl-DL-arginyl-p-nitroanilide)溶液(50mg/ml),37 反應20分鐘後,加入0.5 毫升10醋酸溶液終止反應,測定410 nm吸收。對照組則以0.5毫升磷酸鹽緩衝液代替BCTI溶液,其餘步驟與實驗組相同。空白組是以0.5毫升BCTI溶液(實驗空白組)或0.5毫升磷酸鹽緩衝液 (對照組空白組)依序加入0.5毫升trypsin溶液,1毫升10醋酸,再加入4微升BAPNA溶液,測定410 nm的吸光。四、BCTI對
21、胰蛋白酶抑制活性的穩定度16:溫度的影響抑制劑溶液(1 mg/ml 在0.01M Tris-HCl緩衝溶液中)在水浴中以不同的溫度(30-100)處理10分鐘,殘留抑制活性測試之前樣品先冷卻到0。SDS的影響BCTI先以不同的SDS濃度(0.1%-1%)在37處理10分鐘後,再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性。DTT的影響BCTI與最後濃度為1, 5, 10, 和20 mM還原劑DTT(dithiothreitol)反應,37反應10分鐘後,藉由加入兩倍DTT濃度的碘醋酸(iodoacetic acid)終止反應,再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性。參、實驗結果一、BCTI的純化本研究主要利用tryp
22、sin-Sepharose 4B親和性管柱來純化BCTI,由100克種子純化出15.0毫克的BCTI,產率為26%。我們取100克的油菜種子洗淨並除去雜質,經由硫酸銨分割後,活性介於20-50。沉澱物移置透析袋,於40C下,對0.01N 醋酸透析48小時。離心除去不溶之雜質,上清液通過預先以0.01M,pH 8.0的磷酸鹽緩衝液平衡過的DE-52 cellulose管柱(4.5 X 10公分),以含0到0.5M氯化鈉離子梯度之0.01M,pH 8.0的磷酸鹽緩衝液為沖洗液,由圖1(A)可知,不鍵結於管柱上可得到一蛋白吸收峰,以含0到0.5M氯化鈉離子梯度沖提時可得到二個蛋白吸收峰,經活性測定後
23、,知沒有與樹脂鍵結的第一個蛋白峰具有胰蛋白酶抑制劑的活性。將有活性部分通過trypsin-Sepharose 4B 親合性管柱 (2.2X 5公分)圖1(B),即可將BCTI純化,其純度及分子量可由SDS-PAGE分析(圖2)。經SDS-PAGE分析得知其已均質化(homogenous) ,分子量約8 kDa,是屬於Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑。BCTI被純化115倍,產率為16.4%(表1)。中文部份:新細明體10英文數字部份:Times New Roman圖1 (A) DE-52 cellulose管柱色層分析法。先以0.01M,pH 8.0的磷酸鹽緩衝液平衡DE-52 cell
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 2019年整理 2019 整理 油菜 种子 胰蛋白酶 抑制剂 纯化
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【w****g】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【w****g】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。