病毒中和抗体检测讲课稿.doc

病毒中和抗体检测

精品文档
病毒中和抗体检测
1. 病毒TCID50检测
TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度； 2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。
首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10x.x。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10xxTCID50/ml。也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。
TCID50=10^5.64/0.1ml。即：将病毒悬液作10^5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。（将病毒悬液作10^5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml或者100TCID50/0.05ml）
本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用枪头吸出细胞生长液时,容易出现污染;
使用本方法时的注意事项:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换枪头,减少浓度误差;
②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;
维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;
②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.

1） 细胞准备
1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗
1.2 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞
1.3 放平培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落
1.4 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中
1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min）
1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数
1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml
1.8 在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于?×10^4细胞/孔
1.9 在37℃ 5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定

2） 病毒制备

3） 病毒稀释
3.1 取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。（于1.5ML EP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！）
3.2 做10倍稀释
3.3 在另一新1.5ML EP管中加入100μl第一管稀释病毒液（1/10），按10的比例进行倍比稀释，再加入900μl稀释液，将混合液充分吹打振荡。以此类推共稀释至10^13倍。
此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）

4） 病毒接种：
4.1  取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。
4.2  于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。 (病毒稀释度的选择10^3—10^12或者10^4—10^13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10^6—10^13)
4.3  第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。

3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CON
CON
A

B

C

D

E

F

G

H

4.4 37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续于37℃，5% CO2培养5--10天；
4.5  逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CPE（cytopathic effects，CPEs）的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；
4.6  如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效；
4.7  计算每一列中出现阳性的孔数；
4.8  用Reed-Muench法计算病毒TCID50/ml。
(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）
(2)计算阳性和阴性孔的累积数。
阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4）
(3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100
(4)计算
距离比例（PD）=（大于50%的阳性百分比－50）/（大于50%的阳性百分比－小于50%的阳性百分比）
TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数的对数
（稀释系数的对数 1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7）

举例计算：TCID50的测定和计算（Reed-Muench法）

病毒液稀释度
细胞管观察结果
累计细胞官数
细胞管总数
出现CPE的细胞管所占的％
出现CPE管
不出现CPE管
出现CPE管
不出现CPE管
10-1
8
0
27
0
27
100（27/27）
10-2
8
0
19
0
19
100(19/19)
10-3
7
1
11
1
12
91.6(11/12)
10-4
3
5
4
6
10
40(4/10)
10-5
1
7
1
13
14
0.7(1/14)
10-6
0
8
0
21
21
0(0/21)
出现细胞病变（CPE）以及血凝素等的细胞管数分别列于表14-2的第二和第三列,它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向）,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。可见该病毒株的TCID50在10-3（91.6％）和10-4（40％）之间,其确切稀释倍数可按下列公式计算：
91.6（高于50％的百分数）-50
91.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）
＝41.6/51.6＝0.8
将由上式获得0.8加在高于50%死亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID50应是0.1ml 10-3.8稀释的病毒液。查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml等于1个TCID50。

2. 中和实验
1） 细胞准备
1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗
1.2 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞
1.3 放平培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落
1.4 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中
1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min）
1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数
1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml
1.8 在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于?×10^4细胞/孔
1.9 在37℃ 5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定

2）待测血清准备
2.1 动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。
2.2 取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280稀释，每个稀释度做3-4个平行孔。

3) 加入病毒,感作
3.1 以VGM将病毒稀释到100 TCID50/50μl (200 TCID50/100μ)
3.2 除细胞对照孔外每孔中加入与血清量相等的病毒液，在细胞对照孔中加入与血清量相等的VGM
3.3 轻混病毒－血清混和物，37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h

4）接种细胞
4.1准备用于接种的刚达到完全融合的细胞的培养板，吸掉培养液，加入350μl无血清D-MEM培养液以洗掉剩下的FBS
4.2 病毒－血清混和物孵育2h结束后，各取100μl中和液到细胞培养板相应的孔中
4.3 37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h
4.4 吸掉中和液，加250μl D-MEM 洗涤
4.5 加200μl D-MEM 在37℃ 5％CO2培养箱中孵育3－4d，检测培养液中血凝活性，以能保护50％细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。
在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO2 37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14D终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。

5）对照组
  对照的设定：包括细胞对照（培养液中仅含细胞，不含病毒和血清），阴性对照（培养液中含有l00TCID50病毒、细胞及阴性血清）和空白对照（培养基中含有100TCID50病毒及细胞，不含血清），各设3个平行孔。
为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。
阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。
病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆，先将病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。 0.1TCID TCID50应不引起细胞病变，而且100TCID TCID50必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。
血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度）。
正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。

6) 结果判定和计算　
当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。
举例计算：用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，固定病毒－稀释血清法中和抗体效价计算 如表2-26
血清稀释   CPE数  无   积累CPE   积累无CPE CPE比率  百分数
1:4(10-0.6)   0/4   0   4   0    12   0/12   0
1:8(10-0.9)   0/4   0   4   0   8   0/8   0
1:16(101.2)   1/4   1   3   1   4   1/5   20
1:32(10-1.5)   3/4   3   1   4   1   4/5   80
1:64(101.8)   4/4   4   0   8   0    8/8   100

80%－50%
距离比例＝──────＝0.5
80%－20%
Ig TCID50=高于50％血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数
Ig TCID50＝－1.5－0.5×（－0.3）＝－1.35
（稀释系数的对数 1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7）
则TCID50＝10-1.36，50μl
因10-1.35=1/22，即1:22的血清可保护50％细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。

影响中和试验的因素：
(1) 病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中，一般使用100-500 TCID50。
(2) 用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。
(3) 细胞量度的多少与试验有密切关系，细胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。
(4) 毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符

收集于网络，如有侵权请联系管理员删除