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生物化学实验试题与答案

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一、理论考核题
1盐析和盐溶（3分） 2电泳（3分） 3层析（色谱）（3分） 4酶的活力单位（3分）5比活力（3分） 6分子筛效应（3分） 7电泳的原理（4分）
8离子交换层析的原理（4分） 9亲和层析的原理（4分）
10凝胶过滤层析的原理（4分）
11吸附层析的原理（4分）
12透析技术的基本原理及其应用（4分）
13聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要优点及用途（6分）
14按层析过程的机理，层析法分哪四类？按操作形式不同又分哪三类？（7分）
15普通离心机的使用注意事项？（6分）
16可见分光光度计的使用注意事项？（6分）
17蛋白质含量测定的常用方法有那些？（6分）
18粗脂肪的提取和含量测定的基本原理（6分）
19索氏提取器是由哪几部分组成的？（6分）
20粗脂肪的提取和含量测定的简要操作步骤（6分）
21粗脂肪的提取实验中如何减少误差？（6分）
22凯氏定氮法测定总氮量的基本原理（6分）
23凯氏定氮实验中用到的主要器材有哪些？（6分）
24核酸的含量测定常用的方法有哪些？（6分）
25双倒数法测定米氏常数的基本原理（6分）
26双倒数法测定米氏常数的实验中，决定实验成败的因素有哪些？关键因素是什么？（7分）
27生物细胞的破碎的常用方法有哪些？（6分）
28酶的制备及提取过程中常注意哪些事项？（6分）
29蛋白质的分离常用的方法有哪些？（6分）
30甲醛滴定法测定氨基酸的基本原理（6分）
31为什么SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定未知蛋白质的相对分子质量？（6分）
32连续聚丙烯酰胺凝胶电泳与不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么不同？（6分）
33聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点？（6分）
34琼脂糖凝胶电泳的优点？（6分）
35提取某种植物组织中的总DNA时，使用的细胞提取液中的主要试剂成分是什么？各有什么作用？（7分）
36如何证明提取到的某种核酸是DNA还是RNA？（6分）
37聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH＝8.3，那么样品应点在哪端？为什么？（6分）
二、技能或实验操作考核题
38说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质? 列出纸层析和柱层析的一般操作步骤。（10分）
39凝胶电泳的一般操作步骤（11分）
40普通离心机的使用操作（示范）（10分）
41可见分光光度计的使用操作（示范）（10分）
42如果要105摄氏度干燥某种物质，如何使用干燥箱（示范）? （10分）
43要称取某种药品2.0g，如何使用天平（示范）？（10分）
44要配制500ml 0.01mol/L的NaOH溶液应如何配制？（10分）
45配制1L 0.01mol/L的HCl溶液应如何配制（已知浓盐酸比重是1.19g/L，重量百分比浓度为36.5％）？（11分）
46分别配制出10µg/ml，5µg/ml，2µg/ml，1µg/ml的DNA标准溶液，应如何配制？（尽可能节约）（10分）

答案：
1、盐析和盐溶：盐析：在蛋白质溶液中加入一定量的高浓度中性盐(如硫酸氨),使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。盐溶：加入少量中性盐可增加蛋白质的溶解度,即盐溶现象。
2、电泳：带电粒子在直流电场中向着 所带电性相反的电极移动的现象。
3、层析（色谱）：用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，使混合物各组分以不同速度移动，从而达到分离的一种物理方法。
4、酶的活力单位：是指在特定条件下(25℃、最适的pH值和底物浓度),每分钟可催化1微摩尔(10-6摩尔)底物转化所需要的酶量。
5、比活力：代表酶制剂的纯度。根据国际酶学委员会规定比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。
6、分子筛效应：凝胶本身具有三维网状结构,大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大,小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队,凝胶表现分子筛效应。
7、电泳的原理：电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
8、离子交换层析的原理：离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
9、亲和层析的原理：亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。
10、凝胶过滤层析的原理：一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。凝胶过滤层析具有分子筛效应。
11、吸附层析的原理：组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂,各能力不同而进行分离的方法。
12、透析技术的基本原理及其应用：
13、聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要优点及用途：①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有 格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物 质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双 丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。
14、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类？：根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。
15、普通离心机的使用注意事项？：
(1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。
(2).使用前应检查套环是否平衡(台称)。
(3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡(台称)。
(4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子的对称位置。
(5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。
(6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要2~3min)。
(7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间(10min)。
(8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。
(9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。
16、可见分光光度计的使用注意事项？：（1） 使用过程中比色皿的四个面在槽中保持一定的位置,取用比色皿时手应该捏住四个棱而不能碰到面。比色皿应该避免磨损透光面。
（2） 使用过程中不得打开盖子，保持仪器清洁,为避免溶液洒落对仪器造成的腐蚀，所有溶液的配置、倾倒都不要在仪器附近操作。比色皿放进样品池之前必须把外表面擦干。
（3）当（仅当）操作者错误操作或其他干扰引起微机错误时，应该立即关断主机电源，重新启动，但无须关断灯源电源。
（4）光学器件和仪器运行环境需保护清洁。清洁仪器外表时 ,请勿使用乙醇乙醚等
有机溶剂,请勿在工作中清洁,不使用时请加防尘罩。
17、蛋白质含量测定的常用方法有那些？：（1）微量凯式定氮法。（2）双缩脲法。（3）folin－酚试剂法。（4）紫外分光光度法。（5）考马斯亮蓝染色法。
18、粗脂肪的提取和含量测定的基本原理。：脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物, 能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30ºC -60 ºC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。
19、索氏提取器是由哪几部分组成的？：提取瓶，提取管和冷凝管三部分组成。
20、粗脂肪的提取和含量测定的简要操作步骤（6分）：1.抽提瓶在105℃±2℃烘箱中烘至恒重，材料干燥至恒重。
2.称取干燥后的材料1-2g,放入研钵中研磨(越细越好)将研磨好的材料用脱脂滤纸包住,用少许脱脂棉擦拭研钵壁上粘的材料及油脂,也一并放入滤纸包. 用棉线拴住滤纸包,将滤纸包放入抽提管，在抽提瓶中加入2/3体积的无水乙醚在70-75℃的水浴上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次，或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。
3 取出试样，仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶全部吸完，擦净瓶外壁，将抽提瓶放入105℃±2℃烘箱中烘干至恒重。
21、粗脂肪的提取实验中如何减少误差？（6分）：（1）材料和提取瓶充分干燥。（2）材料尽可能的不损失。(3)提取充分完全。（4）提取后瓶子还要充分的干燥。
22、凯氏定氮法测定总氮量的基本原理（6分）：样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液 被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨酸为例:
1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4
反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]
R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3
NH3
R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O
2NH3+H2SO4==(NH4)2SO4
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。
反应式为: 2NH4++OH-==NH3+H2O
NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-
3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
23、凯氏定氮实验中用到的主要器材有哪些？（6分）：凯氏烧瓶 ，容量瓶
凯氏定氮装置 移液管 酸式滴定管 分析天平 电炉 烘箱
24、核酸的含量测定常用的方法有哪些？（6分）（1）紫外分光光度法；
　（2）定磷法：钼蓝比色法
　（3）定糖法：
　    　 RNA+盐酸——糠醛+地衣酚——Ａ670，鲜绿色；
　     　DNA+二苯胺——Ａ595,蓝色化合物
（4）琼脂糖凝胶电泳法
25、双倒数法测定米氏常数的基本原理（6分）：　Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式：

26、双倒数法测定米氏常数的实验中，决定实验成败的因素有哪些？关键因素是什么？（7分）：
27、生物细胞的破碎的常用方法有哪些？（6分）：机械法：研磨，高速捣碎机；物理法：反复冻溶，超声波破碎，压榨法；化学雨生物化学法：自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。
28、酶的制备及提取过程中常注意哪些事项？（6分）：
29、蛋白质的分离常用的方法有哪些？（6分）：1、前处理：选择适当的破碎细胞的方法破碎细胞，组织细胞破碎后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。2、粗分离：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这种方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
3、细分离：也就是样品的进一步提纯，一般使用层析法，包括凝胶过滤层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可以选择电泳法。
30、甲醛滴定法测定氨基酸的基本原理（6分）：
31、为什么SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定未知蛋白质的相对分子质量？（6分）：在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质－SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：
㏒10Mr = －b·mR + K
32、连续聚丙烯酰胺凝胶电泳与不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么不同？（6分）：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
33、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点？（6分）：①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有 格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物 质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双 丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝 胶。
34、琼脂糖凝胶电泳的优点？（6分）：（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3） 电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5） 区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。 琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。 　　琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过 高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结 晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。
35、提取某种植物组织中的总DNA时，使用的细胞提取液中的主要试剂成分是什么？各有什么作用？（7分）：
36、如何证明提取到的某种核酸是DNA还是RNA？（6分）：（1）用定糖法检测。（2）用紫外分光光度计检测。（3）用琼脂糖凝胶电泳检测。等
37、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH＝8.3，那么样品应点在哪端？为什么？（6分）：样品应点在负极端，因为电泳缓冲液PH＝8.3，在这样的环境中，血清蛋白的几种蛋白质电离后都带上负电荷，所以只有点样在负极端，外加电压后，才能向正极移动，彼此才能分开。
38、说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质? 列出纸层析和柱层析的一般操作步骤。（10分）
纸层析是分配层析，利用分配系数不同，即氨基酸在两相中的溶解能力不同。离子交换层析利用氨基酸是两性物质，在一定pH下不同氨基酸带电性质和带电量不同，因此交换能力不同。
纸层析步骤：滤纸准备、样品处理、点样、平衡、展开、显色和定性定量分析。柱层析步骤：固定相准备、装柱、上柱、洗脱和收集、定性定量分析。
39、试述凝胶层析原理，说明凝胶层析的应用并列出常用凝胶名称（10分）。
凝胶层析柱装有多孔凝胶，当含有各组分的混合液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动。一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶微孔，只能分布于凝胶颗粒的间歇中以较快速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶微孔，不断进出一个个颗粒的微孔内外，因此流动速度较慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子量由大到小顺序先后流出层析柱得到分离。
应用：不同分子量蛋白质分离、蛋白质分子量测定、蛋白质脱盐等。
常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
39、凝胶电泳的一般操作步骤（11分）：制胶，加入电泳缓冲液，加样，电泳，剥胶，染色，脱色。
40、普通离心机的使用操作（示范）（10分）
41、可见分光光度计的使用操作（示范）（10分）
42、如果要105摄氏度干燥某种物质，如何使用干燥箱（示范）? （10分）
43、要称取某种药品2.0g，如何使用天平（示范）？（10分）
44、要配制500ml 0.01mol/L的NaOH溶液应如何配制？（10分）：准确称量0.2gNaOH用少量蒸馏水溶解，然后转入500ml的容量瓶中，再用蒸馏水少量多次（至少3次）洗涤烧杯，都转入容量瓶中，最后定容至刻度线，盖好容量瓶后混匀即可。
45、配制1L 0.01mol/L的HCl溶液应如何配制（已知浓盐酸比重是1.19g/L，重量百分比浓度为36.5％）？（11分）：
46、分别配制出10µg/ml，5µg/ml，2µg/ml，1µg/ml的DNA标准溶液，应如何配制？（尽可能节约）（10分）

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