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蜂蜜检测精品资料蜂蜜掺假技术的研究进展摘要：蜂蜜掺假是蜂蜜质量安全管理和消费者普遍关心的问题，也影响到蜂蜜产品的出口贸易。本文介绍了蜂蜜掺假的基本特点和几种鉴别蜂蜜掺假的检测技术，分析认为-淀粉酶检测法、 近红外光谱技术、碳-4同位素鉴定分析法、差示扫描量热法、色谱分析法和蛋白差异鉴定法具有不同的检测特点和适用范围。基于一种方法难以确证蜂蜜掺假的问题，提出加强多种方法联合检测技术、混合蜂蜜确证技术以保障蜂密产品的质量安全。关键词：蜂蜜；掺假；鉴别Research Progress in the Detection of Honey AdulterationAbstract ：The adulteration of honey is generally concerned by consumers and management departments of safety and quality.The adulteration of honey also affects the export of honey trade. In this paper, some basic characteristics and detection methods of honey adulteration has been reviewed.Alpha amylase technology,near-infrared spectroscopy,carbon isotopic ratio technology,differential scanning calorimetry, Chromatography Analysis and protein characterization analysis were discussed based on their specialties and application ranges.Combinatorial detection methods for honey adulteration were proposed to identify the mixture of honey and set up a traceability system,which may be important to ensure safety and quality of honey.Key words：honey；adulteration；detection technology随着生活水平的提高，人们的保健意识也越来越强。蜂蜜是一种极好的食品和医疗保健品，是蜜蜂采集周边蜜源植物的花蜜并贮存在蜂巢中，与自身特殊物质结合，消化而成的天然甜味物质。蜂蜜主要由碳水化合物(约占总量的3/4)和水分(约占总量的1/4)组成，此外蜂蜜还含有转化酶、过氧化氢酶、淀粉酶、脂酶等蛋白质(酶)、有机酸、芳香物质、挥发油、蜡、色素及一些胶状物等1。糖类物质尤其是单糖(葡萄糖和果糖)占碳水化合物的85%-90%，形成了高糖分的饱和溶液。20082009年，我国蜂蜜歉收，蜂蜜销售应当表现紧俏。按理说，蜂蜜市场应当越做越大。但是，实际情况恰恰相反，假货充斥市场，真蜜却越来越难卖。当前，造假方式千变万化，手段也越来越“高明”。首当其冲的是果葡糖浆对市场的冲击，各种各样打着“蜜浆”、“蜜露”、“蜜膏”的产品，其实大部分都掺有果葡糖浆。消费者不明就里，误以为这就是蜂蜜，从而上当受骗。另外，由于果葡糖浆的生产成本比蜂蜜要低得多，只为蜂蜜的1/51/6。一些厂商为了降低成本，也在蜂蜜中掺人果葡糖浆。有的干脆就用果葡糖浆代替浅色蜜，冠以“洋槐蜜”等名称。经验丰富的养蜂工作者可以凭经验较为准确地判断出掺假蜂蜜，但是，普通消费者和商家就很难识别出它们。这些假蜂蜜产品的感官指标和部分理化指标上与天然蜂蜜产品的极为相似,即使是新颁布实施的蜂蜜国家标准(GB/T18796-2002)2蜜中碳-4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比例法国家标准(GB/T18932.1-2002)3难以辨别其真假。说明我国现行国家标准在鉴别蜂蜜掺假方面存在着很大的缺陷。蜂业科学工作者的职责要求我们，尽快找出快捷、简易的检测方法，以维护蜂蜜市场的正常秩序和保障蜂业生产的健康发展。1 蜂蜜掺假的方式及鉴别手段的发展方向蜂蜜中主要含有葡萄糖和果糖，含量在6 5% 以上，其中果糖含量30.91%44.26%，葡萄糖含量在22.89%40.75%，果糖与葡萄糖比在0.761.86，如此大的变化范围，给鉴别和检测蜂蜜掺假问题带来一定的困难4。最初蜂蜜掺假原料主要是水、蔗糖、转化糖、饴糖、羧甲基纤维素、糊精或淀粉类物质。简单地掺入上述物质到蜂蜜之中可以达到以次充好、提高产量的目的。现今这些原材料已经很少大量使用,取而代之的是葡萄糖、葡萄糖浆、果葡糖浆等，辅助添加色素、蜂蜜香精等进行造假。由于葡萄糖、果糖是天然蜂蜜的主要成分,因此掺入这些糖分后的蜂蜜风味不但没有被破坏,而且有些理化指标还得到强化。而蜂蜜香精的出现更使得假蜂蜜几乎可以乱真。其假蜂蜜产品的技术指标完全可以达到蜂蜜国家标准的技术要求,这样就更增加了蜂蜜检测的难度。但是假蜂蜜尽管在技术指标上符合国家标准，但它不具天然蜂蜜的全部营养成分，更不具有天然蜂蜜独特的保健功能。目前，蜂蜜掺假、造假技术水平越来越高，手段越来越多样化，传统的鉴别方法已不再适应蜂蜜真假鉴别，而理化指标的鉴别不仅费时，而且鉴别结果也存在很多的不确定性，应用现代分析技术鉴别蜂蜜真假已成为一种必然的选择。蜂蜜掺假鉴别的理想技术应是快速、廉价、无需样品预处理，自动取样且提供与天然蜂蜜相关的特征信息。2 -淀粉酶在检验真假蜂蜜中的应用淀粉酶活性值是评定蜂蜜质量的一项重要指标,酶值的高低反映了蜂蜜的新鲜程度及其营养值,新鲜的蜂蜜具有酶值高营养价值好的特点。但往往由于蜂蜜加工不当, 储存不良而破坏酶的活性或因人为的掺假等降低了酶的活性, 致使蜂蜜品质下降。这样我们就可以通过比较蜂蜜中淀粉酶和耐高温-淀粉酶的蛋白质含量和淀粉酶的活性来判定蜂蜜的真假。有研究表明天然蜂蜜中的淀粉酶来源于蜂蜜，而不是花粉或者花蜜5，6，说明蜂蜜的淀粉酶是一种动物源淀粉酶，是其特有的成分。而像一些葡萄糖、葡萄糖浆和果糖糖浆等物质在生产的过程中是不会产生淀粉酶的，它们中的淀粉酶是后经人工添加进去的，虽然这样可以达到甚至超过国家标准的要求，但是其中淀粉酶的性质与天然蜂蜜中的淀粉酶的性质完全的不同。一般来说，蜂蜜中的淀粉酶稳定性比较差，其活性很容易受到外界温度的影响。而加蜂蜜中一般添加的是价格低廉、高效稳定的耐高温工业淀粉酶。这种酶来源于细菌，不仅耐高温而且活力高。因此可以通过测定不同的贮存条件下淀粉酶值来跟踪检测蜂蜜的产品质量和为真假蜂蜜的鉴别提供相关的依据。例如：在贮存过程中，新鲜天然的蜂蜜样品中的淀粉酶值明显受到贮存温度及时间的影响。在低温情况下，蜂蜜中的淀粉酶活性相对保持稳定，但是随着贮存温度的提高，贮存时间的延长，淀粉酶值迅速降低，提高温度可使得淀粉酶值迅速降低。与天然蜂蜜相反，温度对人工添加的淀粉酶活性影响甚小。但是现有的蜂蜜国家标准中关于酶的检测只有淀粉酶值这一项，但生物学功能不可能只有单种成分就能完成，而必须有多种物质的协同作用，在具有营养保健功能的蜂蜜中，淀粉酶值不能代表全部酶的生物活性。因此，为有效控制蜂蜜的质量，在测定淀粉酶活性的同时测定其他其他酶的活性是必要的。限于目前蜂蜜中其他酶的检验方法比较繁琐，且重复性差，未被列入检测指标，因此，简单易行的淀粉酶检测方法也是未来蜂蜜研究方向之一。3 近红外光谱技术的应用近年来，近红外光谱技术结合多元统计分析在区分不同产地、不同品种蜂蜜以及鉴定掺假蜂蜜等方面的研究也不断深入，为蜂蜜的品质和来源鉴定提供了一个良好的技术平台7。近红外(Near Infrared , NIR)光是指波长介于可见区与中红外区之间的电磁波，其波长范围约为780nm2500nm。近红外光谱主要是有机分子的倍频和合频吸收光谱，在该谱区产生吸收的官能团主要是含氢基团X- H键(x为C,O,N,S等)的特征信息，根据这些基团的近红外吸收频谱出现的位置、吸收强度等信息特征，结合数理统计对该成分作定性和定量分析。近红外光谱分析是从复杂、重叠、变动的背景中提取弱信息。与常规分析相比，该项技术需要更多的化学计量学算法与软件技术8。利用近红外光谱分析食品主要分4个步骤进行。首先，选取有真实性和代表性的待测样品，用标准方法测定其化学值，然后，根据近红外谱图信息与组分及其含量的相关性，通过化学计量学方法建立校正模型（如用判别分析、偏最小二乘法、主成分回归等多元校正方法建模）；第三，用已知化学值的验证样品对校正模型（模型质量的好坏采用残差、相关系数、校正集样本和预测集样本的标准偏差等指标判定进行评价，预测结果应与实际结果有良好的一致性；第四，当预测结果在误差范围内，可用已建立的模型预测未知同类样品。虽然近红外光谱技术在蜂蜜的定性定量分析中的应用越来越广泛，但是还有一些难题需要解决。由于近红外光谱仪不适于微量成分分析，而反应蜂蜜品种差别的特征性成分含量少，以及不同品种蜂蜜之间所含的主要成分如糖(约占60 %70 %)，水分(约18 %20 %)含量差异不明显，水由于含有氢键，对其他成分的近红外吸收影响很大等因素，因此还需进一步改善分析方法和数据处理技术，提高准确度和精确度，协调并验证该方法是否适用于所有商品蜜种类的鉴定。4 碳-4同位素鉴定分析法1971年，Smith等人首先报道高等植物由于不同光合作用途径而在碳稳定性同位素固定上具有显著的生物歧视效应,其13C/ 12C 比值在不同类别植物中明显不同。在根据植物不同的碳转化途径，可将现有植物分为3类:通过Calvin-Benson光合作用循环的碳-3植物，如水稻、小麦、棉花、大豆等大多数植物，其13C值变化在-2.2%-3.3%；通过Hatch- Slack光合作用循环的碳-4植物，如甘蔗、玉米、高梁等，其13C值变化在-1.0%-2.0%；而某些肉质或半肉质植物，其碳同位素组成介于碳-3与碳-4之间。大多数蜜源植物属于碳-3植物，而碳-4植物基本上不是蜜源植物，而用于蜂蜜掺假的糖和糖浆一般都是通过玉米、甘蔗等碳-4植物淀粉转化而来，因此，通过测定蜂蜜中稳定碳同位素率就能鉴别蜂蜜是否掺入碳-4植物糖9。 但对于掺入的转化糖分(人造甜味剂等)或者C3植物的糖分就很难区分开来。但是目前绝大多数的葡萄糖粉、葡萄糖浆、果葡糖浆等都是通过玉米等碳-4植物淀粉转化而来,因此通过碳同位素组成鉴定就非常容易鉴定蜂蜜产品中是否掺入碳-4植物糖10。以蜂蜜蛋白质的13C值作为内参标准,将样品的蜂蜜13C值与其蛋白质的13C值进行比较, 根据其差值计算出蜂蜜的掺假程度。这种鉴别蜂蜜掺假的方法只是对天然蜂蜜掺入碳-4植物糖有效。如果天然蜂蜜掺入利用水稻、小麦、大豆等碳-3植物淀粉制备的葡萄糖粉、葡萄糖浆、果葡糖浆等替代成分,或利用水稻、小麦、大豆等碳23 植物淀粉制备的葡萄糖粉、葡萄糖浆、果葡糖浆等替代成分与少量碳-3植物蛋白质(包括淀粉酶) 配制全假蜂蜜产品,则无法辨别其真伪。5 差示扫描量热法(DSC)11差示扫描量热法(DSC)是在程序控制温度下，测量输给物质和参比物的功率差与温度关系的一种技术。DSC可以测量物质的热力学参数，如玻璃化温度(Tg)、熔化焓(H)、比热容(cp)等。蜂蜜和糖浆具有不同的热学性质，在DSC曲线图中即表现出不同的振幅和位置，因此可以依此对掺假蜂蜜进行鉴别。它具有快速、样品需要量少的优点。Cordella等人首先对纯蜂蜜和纯糖浆进行DSC实验，得到它们的热学性质，比较发现蜂蜜和糖浆的1O，这个明显差距表明可以用来区别蜂蜜和糖浆。另外，糖浆具有相当高的熔化焓(H)，也可以用来识别糖浆。然后，研究人员对掺假蜂蜜进行DSC实验，发现掺加甜菜和甘蔗糖浆的蜂蜜的DSC图中，Tg值振幅的位置发生明显变化，而且H3(糖类的熔化焓，包括单糖、二糖、三糖和低聚糖)也有很大的增幅；但掺入糖类代用物的蜂蜜没有明显的变化。但是研究人员并没有用H3作为鉴别参数，原因是H3的振幅出现在较高温度(100)，对于糖浆和蜂蜜，高温会带来坩埚爆炸的危险。所以仅对H2(水糖淀粉复合物的熔化焓或由糖的同质异像体引起的焓变)和Tg进行分析，发现它们均与糖浆的掺加比例有良好的线性关系。H2与糖浆浓度的线性方程的灵敏度可达到510。6 色谱分析法色谱分析法是针对蜂蜜中的不同糖组分和掺假组分进行分离检测，可以是单组分检测也可以是多组分的指纹图谱分析。其中高效液相色谱曾经广泛用于蜂蜜掺假的检测，但是这种方法不能检测到低浓度掺假以及掺入与蜂蜜成分相似的糖浆。张存洁等12利用高效液相色谱法(HPLC)测定蜂蜜中高果糖浆(HFS)，该法根据蜂蜜和HFS 中高寡糖不同，通过活性炭- 硅藻土层析柱分离、浓缩后，采用HPLC 示差检测器测定，C3植物的HFS(大米和甘薯)最低检测限可以达到2.5%，线性范围在2.5%30%，弥补了传统AOAC 法只能测定掺假10% 的C4 植物HFS 的不足。Cordella等13采用高效离子交换色谱- 脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)分析植物源蜂蜜的糖分特征，改变了以往采用单一组分分析，采用新的化学计量法同时分析主要和次要糖分，以及每种蜂蜜中糖分的总色谱图，来描述不同植物源蜂蜜(槐花蜜、薰衣草花蜜、迷迭香蜜、枞树蜜、栗子蜜和TTF多花蜜)的指纹图谱。7 蛋白差异鉴定法 天然蜂蜜的组成成分非常复杂，包括糖、花粉、蛋白、氨基酸和矿物质等等。其中最重要的一种鉴别假蜂蜜方法就是通过分析不同产地蜂蜜蛋白质的组成成分和蛋白质的分子质量的差异来进行鉴别，来自于不同的植物中的至少19种蛋白可以用跑聚丙烯酰胺胶，然后硝酸银染色的方法区分开来。蜂蜜中的蛋白组分的质量都比较小，其中包括几种重的的酶：-葡萄糖苷酶、-葡萄糖苷酶、淀粉酶和葡萄糖氧化酶。Baroni, Chiabrando,Costa,and Wunderlin(2002)曾经报道过来自不同植物的花粉可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶的方法来鉴别，也就是说不同植物花蜜中的花粉蛋白是一种其特有的化学标记，这样就能区分不同产地的蜂蜜并且判定其真伪。Se-Ra Won,Deug-Chan Lee,Seuk Hyun Ko,Jang-Won Kim,Hae-Ik Rhee通过研究分析向日葵蜂蜜中的花粉中的两种蛋白：33kDa蛋白和36kDa蛋白，发现其可以作为向日葵花粉的特定蛋白来进行向日葵蜂蜜的溯源和真假鉴别。通过他们的研究，这两种蛋白不受温度和储存时间的影响，只有密封的种类不同才会产生不同的蛋白，因此，可以当做蜂蜜掺假的一种标志。8 鉴别蜂蜜真伪方法的发展前景 蜂蜜掺杂造假在世界范围内都是一个难题，国外从上世纪70年代开始研究，到目前仍然没有一个绝对可靠的方法来检测掺杂造假。除了上述在用的检测方法外，还有一些文献方法报道了通过拉曼光谱、红外光谱等方法进行掺杂造假的检测。还有针对果葡糖浆在加工过程中产生的物质进行检测，但这些方法在技术上存在一定的难度，而且积累的数据还不够充分。很难通过单一的检测技术来保证检测结果的准确性，例如单纯依靠检测蜂蜜中13C和蜂蜜与蛋白质间的13C很难判断蜂蜜是否掺假，应该开展多组分间的13C检测，甚至考虑是否引入其他稳定性同位素如1 5N、18O、2H等；将色谱技术与碳同位素检测、近红外光谱分析技术联合，构建多组分分析的13C范围和近红外光谱特征库。除此之外我们还可以加强对不同蜂蜜混合的鉴别技术研究。如采用显微镜检法快速确定蜂蜜中的花粉特征，再结合感官评价和主成分分析来区分不同植物源花蜜。再次，高新科技鉴别方法是快速检测发展的一个方向，例如检测-呋喃果糖苷酶方法：-呋喃果糖苷酶又称蔗糖酶或转化酶，可以催化水解-D-果糖苷键，将蔗糖直接转化成葡萄糖和果糖。天然蜂蜜含有-葡萄糖苷转化酶，该转化酶虽然在一定条件下会保持相对长时间的稳定性，但是研究证明即使在蜂蜜中有很高的活性也不可能让大量的蔗糖在短时间内水解。因此，如果在加入蔗糖的同时又加入了-呋喃果糖苷酶，就可将蔗糖直接转化成葡萄糖和果糖，由于这两种单糖在天然蜂蜜中占了蜂蜜糖的90%以上，以至于混合后各种糖的含量未发生明显的变化，在这种情况下掺杂糖浆和白砂糖的蜂蜜有可能借助于HPLC也检验不出来。日后的蜂蜜掺假检测技术将会越来越客观、公正、准确和及时。参考文献1China Health Care Food,2002, 15(6):182The Peoples Republic of China,C B/ T 18796 -20023The Peoples Republic of China,CB/ T 18932. 1 -20024 Zhu Qing,Wang Bi-ni,Liang Yan.Apiculture of China, 2008, 59(10): 35-37.5Bonvehi. 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