三七总皂苷与莪术醇联用对抗...和HT29的效果及机制研究_孙成栋.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.博士论坛：基金项目：吴阶平医学基金会专项资助基金立项（）作者单位：北京积水潭医院感染疾病科，北京；山东大学附属威海市立医院眼科，山东 威海 通信作者：孙成栋，：三七总皂苷与莪术醇联用对抗结肠癌细胞株 和 的效果及机制研究孙成栋 高淑芳 刘佳 张坚 张雪梅【摘要】目的 探讨三七总皂苷、莪术醇联用对抗结肠癌细胞株 和 的效果及其可能的机制。方法 采用体外培养 及 结肠癌细胞系模型，分别给予三七总皂苷（）（三七总皂苷组）、莪术醇（）（莪术醇组）及联合用药（三七总皂苷 莪术醇）（联合组）进行处理，并将细胞培养 。以 为阳性对照设置阳性对照组，同时设置空白对照组（只加细胞和培养液）。体外培养、后，统计细胞抑制率、细胞凋亡及细胞周期情况，采用免疫细胞化学法检测 和 蛋白的表达。结果 人结肠癌细胞经三七总皂苷、莪术醇以及联合处理后，细胞生长受到不同程度的抑制，联合组对 和 的抑制率明显高于单药的应用，差异有统计学意义（），且抑制程度随着时间的增加而增强；联合组干预 后人结肠癌 和 细胞凋亡率明显高于各单用组，差异有统计学意义（）；联合组干预 后，、细胞发生变化，期细胞数增加，期细胞数明显减少，差异有统计学意义（）；联合组干预 后，和 细胞中 的表达水平明显降低，的表达水平则明显升高，差异有统计学意义（）。结论 三七总皂苷、莪术醇联用能显著增强抗结肠癌作用，其机制可能是通过抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡的双重作用。【关键词】三七总皂苷；莪术醇；结肠癌；细胞增殖；细胞凋亡【中图分类号】【文献标识码】，（，；，）【】（），（，）（），（），（），（）（），（）【】；结肠癌为全球第 位最常见的恶性肿瘤，也是第 位最常见的恶性肿瘤死亡原因，年全球范围内结直肠癌新发病例约 万，死亡数约 万，为社会带来了巨大疾病负担，已成为全球重大公共卫生问题。中医药在肿瘤患者的术后复康、减轻世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.放化疗的毒副作用等方面已呈现自身独特的优势。三七总皂苷（，）是五加科三七（）的主要有效活性成分，具有活血祛瘀、通脉活络的功效；莪术醇是从莪术 （）中分离得到的一种成分，主要功效为行气破血、消积止痛。近年来，种药物在抗肿瘤方面的作用得到了较多的关注和研究，但三七总皂苷 莪术醇配伍能否成为代表性的益气活血抗癌药对，目前研究 较 少。本 研 究 通 过 体 外 培 养 人 结 肠 癌、细胞为疾病模型，探讨联合用药对结肠癌、细胞增殖及凋亡的影响，为开拓我国中药成分的临床应用及拓宽结肠癌治疗手段提供实验依据。材料与方法 材 料 细胞株人结肠癌细胞株 和 细胞来源于中国医学科学院上海细胞生物学研究所。药 物三七总皂苷、莪术醇均购自中国食品药品检定研究院（批号：、，纯度）。试剂与仪器 培养基、胎牛血清（美国 公司）；试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；凋亡试剂盒（日本 公司）；试剂盒（上海优宁维生物科技有限公司）；胰酶、三氯乙酸（美国密苏里州，）。流式细胞仪（美国贝克曼库尔特，型号：）；酶标仪（北京凯奥，型号：）、培养箱（深圳瑞沃德，型号：）。方 法 细胞的处理与分组 及 细胞在含 的 培养基，、条件下培养，换液 次。用 胰蛋白酶 溶液收获指数生长期的贴壁依赖细胞，形成细胞混悬液。存活率超过 （台盼蓝染色法排除）的细胞用于实验。取对数生长期的 及 细胞接种在 孔板中，接种量为 孔，用三七总皂苷（）（三七总皂苷组）、莪术醇（）（莪术醇组）及联合用药（三七总皂苷 莪术醇）（联合组）进行处理，并将细胞培养 。以 为阳性对照设置阳性对照组，同时设置空白对照组（只加细胞和培养液）。观察指标 法检测细胞抑制率取对数生长期肿瘤细胞，胰酶消化后，调整细胞悬液浓度为 ，分别接种于 孔板中，每孔 。培养 后，待细胞完全贴壁，吸弃原培养液。加入不同组别的溶液，设置 个复孔，每孔。于 ，培养箱中分别培养 后，每孔加入 溶液，培养 ，吸弃上培养液。每孔加入 的二甲基亚砜溶液，低速振荡 ，充分溶解后，用酶标仪在 下测量每孔的 值，以空白对照组的 值为对照，计算细胞抑制率。每组重复 次取平均值。细胞抑制率（对照孔 实验孔）对照孔。流式细胞术检测细胞凋亡并分析细胞周期取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度为，加入含（终浓度为 ）的 漂洗 次，以离心半径，离心 ，吸弃上清液，乙醇固定，利用 凋亡检测试剂盒，碘化丙啶（）染色，振荡混匀，目尼龙网滤过，上机，计数 个细胞，在 图谱上对代表细胞凋亡的亚 期峰进行定量分析，计算出细胞凋亡率，并进行细胞周期分析。免疫细胞化学法检测蛋白的表达盖玻片用无水乙醇浸泡，过火后，放置于 孔板内备用。培养瓶内常规培养结肠癌系、细胞至 融合后，弃去原培养基，冲洗 次，胰蛋白酶液适度消化，取细胞悬液浓度为 。免疫细胞化学法步骤：（）双蒸水冲洗，浸泡 ；（）去离子水孵育 ，消除内源性过氧化物酶活性；（）滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育 ，倾去；（）滴加适当比例稀释的一抗液，孵育，浸洗，次；同法加入滴加生物素化二抗液和辣根酶标记链霉卵白素工作液；（）显色剂显色 ；（）苏木精复染核；（）梯度酒精脱水；（）二甲苯透明；（）中性树胶封片；（）镜下观察细胞情况。测定切片中 个视野的 和 蛋白阳性区的光密度值，取平均值。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.表 三七总皂苷、莪术醇以及联合应用对 和 的抑制作用比较（，）组 别 空白对照组阳性对照组 三七总皂苷组 莪术醇组 联合组 注：与空白对照组比较，；与联合组比较，；与阳性对照组比较，表 三七总皂苷、莪术醇联合应用对人结肠癌 和 细胞周期比较（）组 别 空白对照组 阳性对照组 三七总皂苷组 莪术醇组 联合组 注：与空白对照组比较，；与联合组比较，；与阳性对照组比较，表 三七总皂苷、莪术醇联合应用对人结肠癌 和 细胞 和 表达的影响（值，）组 别 空白对照组 阳性对照组 三七总皂苷组 莪术醇组 联合组 注：与空白对照组比较，；与联合组比较，；与阳性对照组比较，统计学方法采用 统计学软件分析数据，所有数据进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均值 标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用 检验分析；重复测量的资料采用重复测量的方差分析。以 为差异有统计学意义。结 果 三七总皂苷、莪术醇以及联合应用对 和 的抑制作用比较人结肠癌细胞经三七总皂苷、莪术醇以及联合处理后，细胞生长受到不同程度的抑制，联合组对 和 的抑制率明显高于单药的应用，差异有统计学意义（），且抑制程度随着时间的增加而增强。结果见表。三七总皂苷、莪术醇联合应用对人结肠癌细胞凋亡的影响采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果显示联合用药可有效诱导 和 细胞凋亡，结果见图；联合组 后人结肠癌 和 细胞凋亡率明显高于各单用组，差异有统计学意义（）。结果见表。表 三七总皂苷、莪术醇联合应用对人结肠癌 和 细胞凋亡的影响（，）组 别空白对照组 阳性对照组 三七总皂苷组 莪术醇组 联合组 注：与空白对照组比较，；与联合组比较，；与阳性对照组比较，三七总皂苷、莪术醇联合应用对人结肠癌 和 细胞周期比较三七总皂苷、莪术醇联用处理、细胞 后，采用流式细胞术评估不同药物处理对细胞周期分布的影响，结果显示，经处理，、细胞发生变化，期细胞数增加，期细胞数明显减少，差异有统计学意义（）。结果见表。三七总皂苷、莪术醇联合应用对人结肠癌 和 细胞 和 表达的影响不用药物处理 和 细胞 后，进一步检测细胞周期蛋白的表达变化，结果显示，世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.图 流式细胞术检测不同药物处理后对 和 细胞凋亡的影响联合组 和 细胞中 的表达水平明显降低，的表达水平则明显升高，差异有统计学意义（）。结果见表。讨 论我国结直肠癌的发病率与病死率均高于世界的平均水平，且呈逐年上升的趋势，其中结肠癌构成比也逐年增加。数据显示，年我国结直肠癌新发病例约 万，结直肠癌导致的死亡数约 万例，因此提高结肠癌的治疗效果对于改善患者的生活质量至关重要。结直肠癌的一般治疗方法包括药物治疗、化疗及手术等，但术后易发生转移及复发，预后较差。此外，化疗往往带来一系列副反应，如疲劳、腹泻和便秘等。因此，目前亟待探寻结直肠癌治疗新的有效方法及手段。中药作为天然药物经济易得，不良反应少。大量研究表明，中医药在肿瘤的辅助治疗方面效果明显。有报道表明，三七总皂苷具有抗肿瘤多靶点活性，在抗肿瘤治疗中可以直接杀伤肿瘤细胞，阻止肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞的分化等，并且可抑制结肠癌细胞的迁移和黏附，通过调节 轴抑制肺癌细胞的生长；据报道，莪术醇中的莪术油具有抑制胃癌、肺癌以及肝癌中肿瘤细胞增殖的作用。莪术的主要药效成分为莪术醇，在抗肿瘤、抗氧化、抗血栓形成等方面作用明显。资料显示，莪术醇可以降低鼻咽癌 细胞中 蛋白水平的表达起到抑制肿瘤的作用；还可以下调 中蛋白表达水 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.平，降低 的活性来发挥抑制肿瘤血管生成的作用；此外，有研究显示莪术醇通过上调 的表达抑制结直肠癌 细胞的增殖和侵袭迁移。虽然有多项研究报道三七总皂苷、莪术醇可用于结直肠癌的治疗，但这两种中药的联合应用在结直肠癌治疗中并不常见。由于不同中药之间复杂的相互作用，联合应用的效果仍不确定。本研究通过建立体外结肠癌细胞模型，对三七总皂苷、莪术醇两者联用的抗肿瘤效果及其可能的机制进行了初步探讨。研究结果表明，三七总皂苷、莪术醇联用能显著抑制 和 细胞的增殖，这一抑制作用均优于单独应用某一种药物，提示两者联用具有显著的协同抗肿瘤效果。机制分析如下：（）三七活血祛瘀、通脉活络，增强莪术的散瘀之效，改善血瘀；（）莪术得益三七的甘，增强其扶正之功，补益正气，养荣血脉，提高机体免疫力；（）三七得益莪术的补，有益行气化瘀，破瘀生新，两者联合能显著诱导 和 细胞 期细胞周期阻滞，并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的重要特征之一是细胞周期进程不受控制，因此阻断这一进程被认为是癌症治疗的一个靶点。细胞周期进程受细胞周期蛋白 细胞周期蛋白依赖激酶复合物的激活和表达调节。之前研究结果表明，莪术醇可以通过产生活性氧和抑制 途径来抑制结肠癌细胞 周期。本研究发现三七总皂苷、莪术醇联合应用可引起肿瘤细胞 期阻滞，此外，机制研究表明，两者联用可明显下调 的蛋白表达，同时上调 的蛋白表达。是细胞周期蛋白家族中的重要成员，可促进细胞周期从 期进入 期，加速细胞周期进程，与包括结肠癌在内的多种癌症的发生发展密切相关，是 期限制点的负性调控因子，为抑癌基因，这些结果提示两者联用可通过对细胞周期相关基因的表达调控，抑制细胞增殖，从而发挥抗肿瘤作用。细胞凋亡对组织稳态至关重要，而细胞凋亡失衡则会导致癌细胞的过度增殖。本研究结果显示三七总皂苷、莪术醇两者联用能显著诱导 和 细胞凋亡，提示加速肿瘤细胞凋亡也是两者联用的抗肿瘤作用机制之一。本研究尚存在以下不足：（）本研究未探索这两种药物中的几种特定成分的作用，如三七皂苷 等，未来的研究尚需进一步阐明具体哪些成分发挥了抗癌作用，并对可能的分子信号通路进行研究。（）需进一步开展体内实验和临床试验，以提供更为有力的证据。综上所述，三七总皂苷、莪术醇联合使用比单一药物组对抗结肠癌细胞增殖和凋亡效果明显，这一作用可能是通过对细胞周期的调控以及诱导细胞凋亡的双重机制实现的，本研究三七总皂苷、莪术醇联合用于结肠癌治疗提供了实验基础。参 考 文 献，：，（）：王露尧，张鹭鹭 中国结直肠癌发病和死亡情况及防控策略解放军医院管理杂志，（）：中国医师协会外科医师分会，中华医学会外科学分会胃肠外科学组，中华医学会外科学分会结直肠外科学组，等 中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南（版）中华消化外科杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：邓晰文，张康，赵静静，等 中医药诱导肿瘤细胞铁死亡的研究进展 右江医学，（）：许晶，董石，董青，等 中医药防治肿瘤相关性贫血的优势与特色 北京中医药大学学报，（）：翟亚荣，吴瑶，裘雪莹，等 基于“脾为之卫”探讨中医药调节免疫系统对肿瘤的影响 世界中医药，（）：公为亮，庄海涛 三七总皂苷抗肿瘤作用的研究进展 药学研究，（）：，：，：，（）：，（）（下转第 页）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.调和气血，通则不痛。大便困难，加生大黄泻热通腑。三诊尿路症状消失，去牛膝、土茯苓，减轻祛湿毒之力。加桂枝、炙甘草通阳补中，扶正以善后。全方补中有泻，升中有降，虚实兼顾，温不留滞，散不伤正，共奏补中益气、降糖利水之效，切中病机，故获良效。反复尿路感染易感难愈，是诸多慢性病愈的关键因素。魏子孝教授师古而不泥古，重视调理气血阴阳，治疗时聚焦主症，溯本求源，谨守理法方药的一贯性，注重正气健复，鼓动气化，每获奇效，值得借鉴。参 考 文 献尿路感染诊断与治疗中国专家共识编写组 尿路感染诊断与治疗中国专家共识（版）尿路感染抗菌药物选择策略及特殊类型尿路感染的治疗建议 中华泌尿外科杂志，（）：，：（），（）：魏子孝 学用中医体会录 北京：人民卫生出版社，：，清李用粹 证治汇补 竹剑平，王英，胡森，等，整理 北京：人民卫生出版社，：明李中梓 医宗必读 王卫，张艳军，徐立，等，点校 天津：天津科学技术出版社，：明戴元礼 秘传证治要诀及类方 才维秋，赵艳，胡海波，校注 北京：中国中医药出版社，：金刘完素 素问玄机原病式 丁侃，校注 北京：中国医药科技出版社，：黄灿玲，韩双双，赵晓山，等 中医气虚体质相关影响因素的探讨 世界科学技术 中医药现代化，（）：金李东垣 脾胃论 北京：中国中医药出版社，：清吴谦 医宗金鉴 余灜鳌，林菁，田思胜，等，点校 沈阳：辽宁科学技术出版社，：黄进，赵长鹰 肾病与湿热证关系的探讨 四川中医，（）：清黄元御 素问悬解灵枢悬解难经悬解 太原：山西科学技术出版社，：清薛雪，叶桂 湿热论 张志斌，整理 北京：人民卫生出版社，：张山雷 本草正义 程东旗，点校 福州：福建科学技术出版社，：程双，彭财英，潘玲玲，等 中药土茯苓的现代研究进展 江西中医药，（）：梁陶弘景 名医别录 尚志钧，辑校 北京：人民卫生出版社，：张泽鑫，黄志凯，曾慕煌，等 龙胆泻肝汤方的药理研究进展 国医论坛，（）：清黄宫绣 本草求真 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