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FlowJo软件的简单介绍和基本应用

FlowJo是九十年代美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室研发的一款流式数据分析软件。这款分析软件功能强大，操作简单，易学易用，可在Windows或者Mac系统下安装使用。它简单直观的操作平台，已被领域内的科学家、实验室广泛使用。同时，他也是各期刊杂志引用最多的流式数据分析软件。
一、 FlowJo电脑配置及安装环境
PC: 操作系统：Vista、Windows7
内存：512MB RAM及以上
MAC: 操作系统：OSX 10.3 或更高版本
内存：512MB RAM及以上
安装环境：避免阳光直射，水平放置，远离水源、热源
二、 FlowJo基本功能介绍
1.阶梯式设门：
将细胞群之间的逻辑关系用简单、递进的阶梯式去呈现，一改传统复杂的逻辑门设置。并可以自定义细胞群名称，进而直观的显示细胞群统计值，让分析结果一目了然。如图

2.多种图像显示方法及显示类型：
显示方法：它可以呈现为一维的直方图，二维图及三维立体图。如图
一维图 二维图 三维图

显示类型:除了传统使用的散点图外，还有密度图，等高图，伪色图，斑马图等。如图

3..多种设门工具：
设门是流式数据分析中界定细胞目标群的必要手段，不管检测的目标细胞群是规则分布还是不规则分布的，是小概率事件还是集体事件，都可以很方便的界定各种细胞群。如图

蜘蛛门 四分门 矩形门、椭圆门、自动门

4.多种分析平台及工具：
特殊的分析平台：细胞周期，细胞增殖，钙离子流量，反向设门等。
独特的分析工具：门的批处理，样品的荧光补偿。
5.灵活方便的数据导出：
无论是图形数据还是表格数据都可以用Ofice软件、Powerpoint或直接打印，输出的表格数据可保存为HTML，SQL等格式。
三、 FlowJo的基本应用：
1.单标样本的分析方法：
双击桌面Flowjo软件图标，进入软件工作台。软件工作台由菜单栏、工具栏、组空间和样本空间组成（见图1）。将要分析的数据组拖至组空间中，单击选中分析组（3 color comp），此时在样本空间里便会显示分析组里的所有样本。然后双击样本空间中的样品（Cy5PE.fcs），出现图形窗口（以二维点图的形式，见图二）。

图一 图二

X轴选择SSC（侧向散射），Y轴选择FSC（前向散射），然后选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中任一种。如图三，用椭圆门选中要分析的细胞群。在图形窗口中双击选中的细胞群，生成新的图形窗口。在X轴选择CD4，Y轴选择Histogram ，选择设门工具（区域门、双分门）中任意一个，在单参数直方图中设门。双分门设门如图四，左边区域为CD4阴性细胞，右边为CD4阳性细胞（见图五）。

图三 图四 图五

2.图形的输出和保存：
a.在单参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以吧图片粘贴到Word、Excel、PPT中。
b.在图形分析窗口菜单栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、命名文件名称以及文件保存类型。
c.在Flowjo工作台单击打开布局编辑器，在样本空间中把CD4细胞的节点拖入布局编辑器中，在布局编辑器中点击保存按钮，在弹出的对话框中选择保存的路径，名称及图片格式。如图六、七所示：
图形布局编辑器

图六 图七

3.多色样本的分析方法：
打开分析软件，将要分析的数据拖至工作台。在样本空间中双击要分析的样本，出现图形窗口，显示为二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具，在点图中选中要分析的细胞群(如图八)，双击门出现图形窗口，X轴选择CD3，Y轴选择FSC。使用矩形门选中CD3阳性细胞群，并命名为T细胞。双击T细胞门，出现图形窗口，在X轴选择CD4，Y轴选择CD8，使用十字门设门（如图九），其中Q1区域为:CD8+，Q2区域为: CD8+/ CD4+，Q3区域为: CD4+，Q4区域为：CD8-/ CD4-，见图十。

图八 图九 图十

4.双指数转换：
如下图，图中所设的门范围很小，但却显示里面的细胞比例高达35.1%，这说明有很多细胞压在了坐标轴上。这时可以在X轴和Y轴点击坐标轴边上的T按钮，在弹出的下拉列表中选择“用双指数转换”，如图十一、十二所示：

图十一 图十二

注：双指数转换只是更改了数据呈现的方式，不会对数据本身做任何更改。

5.批处理功能：
a.样品的批处理： 将一组数据重的标准品Sample 1分析完成后，按住ALT键，在工作台中单击样品Sample 1下的节点，将其拖到组空间的Titration Data组上,这样就对该组中的所有样本都进行了与Sample 1样本中一样的设门和数据的统计。如图十三、十四：

图十三 图十四

b.图片的批处理：打开工作台常用工具栏中的布局编辑器将工作台中，将工作台中Sample 1样本下的分析节点拖入布局编辑器，点击布局编辑器右上角的批处理按钮“Batch”，如下图，便能得到图片的批处理结果。

图十五 图十六

四、 注意事项：
1.二维点图的设门原则
二维点图常用四分门来设门，四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设置阴性、阳性细胞的分群处。
2.多色标记分析说明
多色样本分析在实验室中具有重要的地位，只要把多色的分析简化为单标记和双标记的分析，问题就会迎刃而解。
例如：检测treg需要标记CD4/CD25/FOXP3，可以用SSC vs CD4的二维点图，把CD4+的细胞圈出来。然后用CD25 vs FOXP3的二维点图，把CD25+/ FOXP3+的细胞表示出来。这样就可以把CD4+/CD25+/FOXP3+的treg细胞辨别出来。上面的实例（多色样本分析方法）就是把三标的样本转化为两个二维点图进行分析的。