森林茶园古茶树大理茶叶绿体...密码子偏好性及系统发育研究_佟岩.pdf

茶叶科学 2023，43（3）：297309 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2023-02-13 修订日期：2023-04-14 基金项目：第二次青藏高原科学考察研究（2019QZKK050203）、云南臻字号茶业有限责任公司技术开发项目（E2552812C1）作者简介：佟岩，女，助理研究员，主要从事分子生物学方面研究。*通信作者： 森林茶园古茶树大理茶叶绿体基因组密码子 偏好性及系统发育研究 佟岩1，黄荟1,2，王雨华1*1.中国科学院昆明植物研究所，资源植物与生物技术重点实验室，云南省野生资源植物研发重点实验室，云南 昆明 650201；2.怀化学院生物与食品工程学院，湖南 怀化 418000 摘要：大理茶（Camellia taliensis）是古茶林森林茶园的重要茶种之一，参与了大叶茶的起源驯化。为了解大理茶叶绿体基因组密码子偏好性，探讨影响密码子偏好性形成的因素，对其进行了中性绘图分析、ENC-plot、PR2-plot 分析，并寻找最优密码子。结果表明，大理茶叶绿体 54 条编码序列（CDS）的 GC 含量为 37.68%，GC1、GC2的含量分别为 46.44%、39.77%，高于 GC3（27.67%），说明其叶绿体基因组密码子末位碱基偏好以 A、U 结尾；有效密码子数 ENC 范围为 35.6456.67，平均值为 46.1，表明其密码子偏好性较弱；中性绘图分析、ENC-plot 分析和 PR2-plot 偏倚分析表明，影响大理茶叶绿体密码子偏好性的主要因素是自然选择；有 11 个密码子被确定为最优密码子。虽然基于 matK 基因和 CDS 序列构建的茶组植物系统发育树显示的拓扑结构有所不同，但所有树型均显示大理茶与秃房茶聚为一支，且是栽培茶的近缘种。本研究为解析大理茶的遗传进化，系统发育提供了基础，为大理茶重要农艺性状改良提供了科学依据。关键词：大理茶；森林茶园；叶绿体基因组；密码子偏好性；系统发育 中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2023)03-297-13 Analysis of Codon Usage Bias and Phylogenesis in the Chloroplast Genome of Ancient Tea Tree Camellia taliensis in Forest-tea Garden TONG Yan1,HUANG Hui1,2,WANG Yuhua1*1.Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology,Yunnan Key Laboratory for Wild Plant Resources,Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650201,China;2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province,College of Biological and Food Engineering,Huaihua University,Huaihua 418000,China Abstract:Camellia taliensis is one of the important tea plants which is often grown in forest-tea gardens,which participated in the origin and domestication of C.sinensis var.assamica.To determine the codon usage bias pattern and its main influencing factors in the chloroplast genome of C.taliensis,neutral plotting,ENC-plot,PR2-plot analyses were performed and the optimal codons were found.The results show that the GC content of 54 CDS sequences was 37.68%,while GC1 and GC2 content were 46.44%and 39.77%,higher than GC3(27.67%),indicating that the third base of the codon preferred to end in A/U.The effective codon number(ENC)ranged from 35.64 to 56.67,with an average value of 46.1,demonstrating weak codon usage bias in chloroplast genome of C.taliensis.Neutral plotting,DOI:10.13305/ki.jts.2023.03.010298 茶 叶 科 学 43 卷 ENC-plot,PR2-plot analyses show that the main factor affecting the codon usage bias of the C.taliensis chloroplast genome was natural selection.In total,11 optimal codons were identified in the chloroplast genome of C.taliensis.Although phylogenetic trees constructed by matK gene and CDS sequence display different topological structures,all trees show that C.taliensis and C.gymnogyna are clustered into one branch and are closely related to cultivated tea plant.This study provided the basis for analyses of genetic evolution,phylogeny and improved agronomic traits of C.taliensis.Keywords:Camellia taliensis,forest-tea garden,chloroplast genome,codon usage bias,phylogenetic analysis 古茶树多指百年左右、树体高大的自然生长或栽培的茶树，主要为茶组植物的野生型、半野生型或栽培型等各类茶树资源，云南是世界上古茶树和野生大茶树资源最为丰富的地方，至今仍保留有较大面积的古茶林1。古茶树是重要的茶树种质资源基因库，在研究茶树的起源、进化、生物多样性、品种改良等方面都具有重要的价值2。裴盛基等3从民族植物学视角提出，以产出生态茶叶为目标，按传统方式管理，符合绿色、有机种植标准，面积在0.5 hm2以上，伴生有高于 5 m 以上至少 1 种形成林冠的其他野生或栽培的木本植物，覆盖度在 10%以上的栽培山茶科山茶属茶组植物群落称为森林茶园，一般古茶林都能达到森林茶园的标准，称为古茶林森林茶园。古茶林森林茶园是我国二三千年的茶叶栽培史中，劳动人民通过各种传统农业耕作模式遗留下来的，既保留了天然林的主要特征和功能，又能在人为调控作用下获得最大利用价值的茶园模式，具有重要的生态、经济和文化意义3-4。茶组植物大理茶（Camellia taliensis）是云南古茶树资源中分布广泛、面积大、适应性强的一种茶树资源，也是古茶林森林茶园的重要物种，其群落为物种多样性丰富的原生自然植被，调查发现白莺山古茶园、镇源千家寨等古茶林森林茶园的主要建群物种即为大理茶，其是典型的森林茶园古茶树物种5-6。前人基于分子标记研究发现，大叶茶可能是由栽培的大理茶与小叶茶进行杂交后再驯化而来7-8。此外，大理茶也是迄今发现与栽培茶化学成分最为相近，以及富含咖啡碱和茶多酚的近缘茶组植物，自古以来就被当地少数民族利用作为茶饮，有名的“大理感通茶”“银生茶”“野生乔木茶”等均来源于大理茶5,9。大理茶分布于云南西南部山区，横断山脉澜沧江中段至伊洛瓦底江流域，海拔1 5002 400 m的南亚热带山地的中山地带，野生大理茶为国家二级保护树种，群落物种多样性极为丰富10。茶叶品质的季节性变化及地区性差异主要是由于光、温度等环境因子对茶树多酚类、咖啡碱及茶氨酸等主要成分合成与代谢的影响导致11。在茶树种植中多用遮阴覆盖等农业措施调节茶树的光合作用，从而提升茶品质11-12。叶绿体是植物体中进行光合作用的重要器官，拥有独立于细胞核的半自主遗传系统13。叶绿体基因组 DNA（Chloroplast genome DNA，cpDNA）具有分子量小、单倍性、单亲遗传的特点，其基因含量和基因组高度保守，基因类型与位置分布较为保守、遗传特性稳定，有些进 化 速 率 较 快 的 基 因 如 matK（Maturase kinase）等兼具较高的基因同源性和大量的变异位点，多态性高，在物种鉴定、系统发育关系和物种起源等方面应用广泛13-14。matK 基因位于叶绿体 trnK 基因的内含子中，编码一种参与叶绿体型内含子剪切的成熟酶 K，是叶绿体行使正常功能的关键基因之一15。聂传朋等16对茶树 DNA条形码引物进行了初步筛选，认为 matK、rcbL 可作为茶树品种间分类的备选序列。目前，matK 作为植物 DNA 条形码的标准序列之一，不仅能够用于植物种及变种之间的鉴别，还能够有效地对属间及属以上级别进行鉴定，对近缘种也有较好的分辨力。遗传信息从 mRNA 翻译成蛋白质时，由3 期 佟岩，等：森林茶园古茶树大理茶叶绿体基因组密码子偏好性及系统发育研究 299 于密码子的简并性而对同义密码子的使用频率出现差异的现象称为密码子使用偏好性（Codon usage bias，CUB）17。不同物种、不同基因的密码子偏好性不同，是物种长期进化过程中受到自然选择、突变压力和随机遗传漂变等多种因素影响而形成的，密码子偏好性的存在可降低外源基因在宿主中的表达量，从而维持物种的稳定遗传18-19。本研究通过对大理茶叶绿体基因组的密码子使用与基因的表达情况、CDS 区的碱基组成等密码子使用偏好特征及其偏好性的影响因素进行系统分析，筛选最优密码子，为提高大理茶外源基因的表达转化效率提供基础。1 材料与方法材料与方法 1.1 大理茶叶绿体基因组序列的获取 大理茶（C.taliensis）叶绿体基因组参照Yang 等20报道，基因组序列（NC_022264.1）及注释文件均从 NCBI 数据库中下载，获得的大理茶叶绿体基因组序列长度为 156 974 bp，共包含 89 条编码序列（Coding sequence，CDS）。移除基因编码序列中长度小于 300 bp的序列与基因重复序列，最终获得 54 条符合条件的大理茶 CDS 序列用于后续分析。同时从 NCBI 数据库中下载小叶茶（C.sinensis var.sinensis，NC_020019.1）、大叶茶云抗 10 号（C.sinensis var.assamica cv.Yunkang10，MH019307.1）、白毛茶（C.sinensis var.pubilimba，NC_038198.1）、德宏茶（C.sinensis var.dehungensis，KJ806279.1）、大苞茶（C.grandibracteata，NC_024659.1）、秃房茶（C.gymnogyna，NC_039626.1）、大厂茶（C.tachangensis cv.Xingyi6，NC_056149.1）、毛叶茶（C.ptilophylla，NC_038198.1）、突肋茶（C.costata，NC_061904.1）9 个茶组植物，以及木荷（Schima superba，NC_035545.1）和紫茎（Stewartia sinensis，NC_035640.1）2 个外类群山茶科木荷属、紫茎属植物的叶绿体基因组序列。采用上述方法分别获取这 11 个物种的符合条件的 CDS 序列用于后续茶组植物系统发育分析。1.2 密码子偏好性相关参数计算 用CodonW v1.4.2软件对大理茶叶绿体基因组 54 条 CDS 序列的编码氨基酸长度（Laa）、有效密码子数（Effective number of codon，ENC）、相对同义密码子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、密码子适应指数（Codon adaptation index，CAI）、同义密码子中 GC 含量和密码子第 3 位上 A、T、C、G 的含量（分别以 A3s、T3s、C3s、G3s表示）进行分析。再使用 CUSP（http:/imed.med.ucm.es/EMBOSS）在线软件计算 GC 总含量（GCall）及密码子第 1、第 2、第 3 位碱基组成中的 GC 含量（分别以 GC1、GC2和 GC3表示），去除编码蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）单密码子和 3 个终止密码子（UAA、UAG、UGA）。用 R 语言的 ggplot2 软件包基于筛选到的 59 个密码子的 RSCU 值绘制堆积柱形图（Stacked barplot）展示密码子偏向性。利用SPSS 18.0 软件的 Pearson 相关系数法对大理茶叶绿体基因组密码子偏好性相关参数进行相关性分析。1.3 中性绘图分析 计算大理茶叶绿体各 CDS 序列中密码子GC1和 GC2的平均值 GC12，以 GC3和 GC12为横纵坐标绘图散点图，分析 GC3和 GC12的相关性。若 GC3与 GC12显著相关，则表明 3 个位置上碱基组成差异不显著，突变是密码子使用的主要影响因素；若相关性不显著，则表明密码子使用的偏好性受自然选择影响较大21。1.4 ENC-plot 分析 以 GC3为横坐标，ENC 为纵坐标，绘制ENC-plot 散点图，同时绘制标准曲线（标准曲线绘制公式：ENC期望=2+GC3s+29/GC3s2+(1-GC3s)2)22。通过基因散点分布的位置判断影响密码子偏好性的原因，若基因分布在标300 茶 叶 科 学 43 卷 准曲线上或附近，则密码子偏好性主要受突变影响；若基因位于标准曲线下方较远的位置，则密码子偏好性受到自然选择和其他因素的影响较大23。1.5 PR2-plot 分析 以 G3/(G3+C3)为横坐标，A3/(A3+T3)值为纵坐标，进行 PR2-plot 绘图，中心点为 A=T且 C=G 时的值，表示密码子无使用偏好性，只受到突变的影响，其余点和中心点的距离则表示偏倚的程度和方向24。1.6 最优密码子分析 根据 ENC 大小进行排序，选取前后各10%的基因构建高偏好性和低偏好性库。计算2 个库各密码子的 RSCU 值和 RSCU 值，去除蛋氨酸、色氨酸及终止密码子 UAA、UAG、UGA，将同时满足 RSCU1 和 RSCU0.08的密码子确定为最优密码子25。1.7 系统发育分析 利用 10 个茶组植物和 2 个山茶科外类群物种的叶绿体基因组CDS和matK基因分别进行系统进化分析。用 CLUSTALW 软件对所有序列进行多序列的比对，利用 MEGA-X 软件的系统邻接法（Nerghbor-joining，NJ），设置1 000 次的 Bootstrap 检验各分支的置信度，其他参数均为默认值，对 12 个物种构建系统进化树，用 EvolView（http:/evolgenius.info/#/）软件对进化树进行美化作图。2 结果与分析结果与分析 2.1 大理茶叶绿体密码子相关偏性指数分析 大理茶叶绿体基因组全长 156 974 bp，去除小于 300 bp 的 CDS 及重复序列后，共筛选出 54 条蛋白编码基因，全长 64 809 bp，占基因组全长的 41%，基因编码氨基酸序列长度范围为 1002 282，平均长度为 399。对这些基因的密码子组成和偏好性进行统计分析，结果如表 1 所示，蛋白编码序列平均 GC 含量为37.68%，其中 GC1GC2GC3，显示 GC 在密码子 3 个位置上的分布并不均匀，GC 含量均小于 50%，表明大理茶叶绿体基因组密码子偏好使用 A/U 碱基，且偏好以 A/U 碱基结尾。有效密码子数用于揭示密码子的偏好程度，ENC 的取值范围为 2160，ENC 值的大小与密码子偏好程度呈现负相关，当 ENC 值小于 45 时，意味着密码子存在偏好性。大理茶叶绿体基因组的 ENC 值介于 35.6456.67，平均值为 46.1，ENC 值大于 45 的基因有 36条，表明大理茶叶绿体大部分蛋白编码基因序列密码子的使用偏好性较弱。大理茶叶绿体基因组密码子各参数之间的相关性分析结果显示（表 2），GC1与 GC2呈极显著相关（P0.01），但 GC1与 GC3及GC2与 GC3之间均无相关性，表明密码子第1、2 位碱基组成情况高度相似，而第 3 位上的碱基组成随机性比较大，与 1、2 位碱基组成有较大差异。ENC 与 GC3呈显著正相关（P0.05），表明密码子第 3 位上碱基组成的变化对密码子的使用偏好性影响最大。2.2 整体密码子偏好分析 RSCU 指某一特定的密码子在其同义密码子中出现的概率，可直观反映密码子的使用情况。结果显示（图 1），大理茶叶绿体基因组中共有 33 个高频密码子，其中以 A、U、C、G 结尾的分别有 14、16、0、3 个。此外，大理茶叶绿体基因组中还出现了偏好性极强的密码子（RSCU 值2），为编码亮氨酸（Leu）的 UUA。说明大理茶叶绿体基因组偏好 A/U结尾的密码子。2.3 最优密码子的确定 根据 ENC 值的大小，选出 5 个高表达基因和 5 个低表达基因建立基因库。通过计算得出 RSCU 值0.08 的密码子有 28 个（表 3），为高表达优越密码子。将同时满足 RSCU1、RSCU0.08 的密码子确定为最优密码子，最终得到大理茶叶绿体 11 个最优密码子，分3 期 佟岩，等：森林茶园古茶树大理茶叶绿体基因组密码子偏好性及系统发育研究 301 别为 AUU、AUC、UCA、CCA、ACA、GCA、AAU、GAU、AGA、GGA 和 GGG，其中 2个以 C、G 结尾，其余均为 A、U 结尾。2.4 中性绘图分析 大理茶叶绿体基因组 54 个基因的中性绘图分析结果显示（图 2），GC3和 GC12的相关 系数为 0.007 8，回归系数为 0.116 8，表示突变压力的贡献率为 11.68%，而自然选择压力的贡献率为 88.32%，说明 GC3与 GC12之间的相关性不强，突变压力对密码子偏好性的影响不大，表明大理茶叶绿体基因组密码子同时受到自然选择和突变压力的影响，但自然选择起到了更大的作用。表 1 大理茶叶绿体基因密码子的 GC 含量及 ENC 值 Table 1 GC contents and ENC values in chloroplast genome of C.taliensis 基因 Gene GC1/%GC2/%GC3/%GCall/%ENC Laa 基因 Gene GC1/%GC2/%GC3/%GCall/%ENC Laa rps12 51.61 48.39 27.42 42.47 45.75123 rpl20 38.98 43.22 25.42 35.88 48.70 117 psbA 49.72 43.5 32.49 41.9 40.6 353 clpP 55.35 37.21 26.98 39.84 49.85 214 matK 39.00 32.00 27.60 32.87 46.38499 psbB 54.81 46.17 31.24 44.07 47.57 508 atpA 55.51 40.16 23.82 39.83 43.02507 petB 48.42 41.18 30.77 40.12 44.35 220 atpF 45.50 35.45 35.45 38.80 42.58188 petD 48.88 40.45 29.21 39.51 45.28 177 atpI 37.90 49.19 37.90 26.61 44.59247 rpoA 44.64 32.14 25.30 34.03 48.57 335 rps2 43.88 42.19 28.27 38.12 47.74236 rps11 52.52 57.55 20.86 43.65 47.92 138 rpoC2 45.68 37.84 28.61 37.38 49.311376rps8 41.91 41.91 27.21 37.01 40.88 135 rpoC1 50.07 37.70 28.38 38.72 50.20686 rpl14 56.10 36.59 26.02 39.57 44.48 122 rpoB 50.42 37.91 27.92 38.75 48.441070rpl16 50.36 51.82 20.44 40.88 36.65 136 psbD 51.69 43.22 31.36 42.09 43.19353 rps3 46.58 31.51 22.37 33.49 47.11 218 psbC 53.38 46.41 31.65 43.81 43.77473 rpl22 41.03 37.18 25.00 34.40 43.00 155 rps14 43.56 47.52 31.68 40.92 37.46100 rpl2 50.00 47.83 32.25 43.36 53.76 275 psaB 48.84 42.99 30.75 40.86 47.80734 ycf2 41.66 34.43 37.06 37.71 53.37 2282 psaA 52.20 43.54 31.69 42.48 49.11750 ndhB 41.68 38.36 31.12 37.05 46.73 510 ycf3 47.93 38.46 28.99 38.46 56.67168 rps7 51.92 45.51 23.08 40.17 45.81 155 rps4 50.00 37.13 25.74 37.62 47.88201 ndhF 36.85 35.91 22.83 31.86 41.68 748 ndhJ 50.31 37.74 31.45 39.83 51.41158 ccsA 33.85 36.96 24.53 31.78 47.17 321 ndhK 44.25 43.36 23.45 37.02 47.45225 ndhD 40.20 37.62 26.14 34.65 45.71 504 ndhC 46.28 33.88 25.62 35.26 46.35120 ndhE 39.22 33.33 24.51 32.35 41.09 101 atpE 50.75 38.06 27.61 38.81 47.78133 ndhG 42.94 32.77 22.03 32.58 43.00 176 atpB 56.91 41.48 28.46 42.28 45.04498 ndhI 42.26 37.50 27.98 35.91 49.81 167 rbcL 58.61 43.70 30.04 44.12 47.96475 ndhA 42.03 39.01 20.60 33.88 41.23 363 accD 40.27 35.41 28.99 34.89 47.76513 orf188 44.44 40.74 20.63 35.27 43.77 188 ycf4 44.86 41.08 29.73 38.56 47.08184 ndhH 50.76 36.04 24.62 37.14 46.57 393 cemA 38.36 26.72 31.47 32.18 49.65231 ycf1 35.13 29.14 24.92 29.73 46.16 1869 petA 52.34 37.07 28.04 39.15 48.56320 平均值 Average 46.44 39.77 27.67 37.68 46.10 399.06rps18 35.29 43.14 26.47 34.97 35.64101 表 2 密码子主要参数的相关性分析 Table 2 Correlation analysis between the indexes of codon use 参数 Index GC1 GC2 GC3 GCall ENC GC1 1.000 GC2 0.380*1.000 GC3 0.074 0.072 1.000 GCall 0.831*0.591*0.229 1.000 ENC 0.184 0.209 0.269*0.113 1.000 注：*表示显著相关（P0.05），*表示极显著相关（P0.01）Note:*indicates significant correlation(P0.05),*indicates highly significant correlation(P0.01)302 茶 叶 科 学 43 卷表 3 大理茶叶绿体基因组最优密码子确定 Table 3 Preferred codon in chloroplast genome of C.taliensis 氨基酸 Amino acid 密码子 Codon 高表达基因 High expressed genes 低表达基因 Low expressed genes RSCU氨基酸 Amino acid 密码子Codon 高表达基因 High expressed genes 低表达基因 Low expressed genes RSCU 数目 RSCU 数目 RSCU 数目 RSCU 数目 RSCU 亮氨酸 Leu UUA 65 1.11 18 1.59 0.48 酪氨酸 Tyr UAU 110 1.49 17 1.48 0.01 UUG 79 1.35 18 1.59 0.24 UAC 38 0.51 6 0.52 0.01 CUU 66 1.13 18 1.59 0.46 异亮氨酸 Ile AUU124 1.00 33 1.32 0.32 CUC 37 0.63 0 0.00 0.63 AUC129 1.04 21 0.84 0.20 CUA 70 1.19 13 1.15 0.04 AUA 120 0.97 21 0.84 0.13 CUG 35 0.60 1 0.09 0.51 组氨酸 His CAU 54 1.27 14 1.47 0.20 丙氨酸 Ala GCU 29 1.21 37 2.51 1.30 CAC 31 0.73 5 0.53 0.20 GCC 22 0.92 3 0.20 0.72 谷氨酰胺 Gln CAA 72 1.26 19 1.73 0.47 GCA35 1.46 17 1.15 0.31 CAG 42 0.74 3 0.27 0.47 GCG 10 0.42 2 0.14 0.28 天冬酰胺 Asn AAU113 1.43 22 1.07 0.36 缬氨酸 Val GUU 58 1.33 19 1.95 0.62 AAC 45 0.57 19 0.93 0.36 GUC 29 0.66 0 0.00 0.66 赖氨酸 Lys AAA 127 1.29 32 1.73 0.44 GUA 50 1.14 18 1.85 0.71 AAG 70 0.71 5 0.27 0.44 GUG 38 0.87 2 0.21 0.66 天冬氨酸 Asp GAU87 1.60 10 1.11 0.49 丝氨酸 Ser UCU 66 1.45 23 2.00 0.55 GAC 22 0.40 8 0.89 0.49 UCC 46 1.01 11 0.96 0.05 谷氨酸 Glu GAA 111 1.41 33 1.53 0.12 UCA65 1.43 7 0.61 0.82 GAG 46 0.59 10 0.47 0.12 UCG 41 0.90 5 0.43 0.47 半胱氨酸 Gys UGU 42 1.35 6 2.00 0.65 AGU 36 0.79 18 1.57 0.78 UGC 20 0.65 0 0.00 0.65 AGC 19 0.42 5 0.43 0.01 精氨酸 Arg CGU 21 0.49 20 1.41 0.92 脯氨酸 Pro CCU 47 1.16 15 1.76 0.60 CGC 15 0.35 3 0.21 0.14 CCC 33 0.81 4 0.47 0.34 CGA 60 1.40 26 1.84 0.44 CCA55 1.36 9 1.06 0.30 CGG 31 0.72 3 0.21 0.51 CCG 27 0.67 6 0.71 0.04 AGA98 2.28 23 1.62 0.66 苏氨酸 Thr ACU 40 1.10 20 1.95 0.85 AGG 33 0.77 10 0.71 0.06 ACC 29 0.80 11 1.07 0.27 甘氨酸 Gly GGU 39 0.81 30 1.88 1.07 ACA 53 1.46 10 0.98 0.48 GGC 29 0.60 9 0.56 0.04 ACG 23 0.63 0 0.00 0.63 GGA 70 1.45 19 1.19 0.26 苯丙氨酸 Phe UUU 100 1.01 20 1.00 0.01 GGG 55 1.14 6 0.38 0.76 UUC 98 0.99 20 1.00 0.01 3 期 佟岩，等：森林茶园古茶树大理茶叶绿体基因组密码子偏好性及系统发育研究 303 2.5 ENC-plot 分析 ENC-plot 分析结果显示（图 3），大多数大理茶叶绿体基因都偏离了基因预测值的标准曲线，表明除由碱基突变引发的差异影响该基因组密码子偏性外，影响更多来自选择效应。ENC 值相对较小的基因位于预测曲线之下，并偏离曲线，说明这种类型偏好使用特定密码子，偏好性也较大，这部分基因的密码子偏好性更多受到自然选择等的影响。为检验基因与标准曲线的距离，统计了各基因 ENC 与期望值的比值，结果显示（表 4），55.6%的基因 ENC 比值分布在 00.1 范围，7.4%分布在 0.10.2 及0.20.3 范围，表明 ENC 的实际值与期望值相差较大。进一步说明其整体密码子偏好性主要受自然选择的正向影响，这种影响使基因拥有更低的 ENC 值，从而获得更高的表达效率。图 1 大理茶叶绿体基因组 CDS 密码子 RSCU 直方图 Fig.1 Analysis of relative synonymous codon usage(RSCU)in the chloroplast genome of C.taliensis 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6GC12 0.60.50.40.30.20.10GC3y=0.116 8x+0.398 9R2=0.007 8 图 2 大理茶叶绿体基因组中性绘图分析 Fig.2 Neutrality plot analysis of C.taliensis chloroplast genome 304 茶 叶 科 学 43 卷 2.6 PR2-plot 分析 通过绘制 PR2-plot 图进一步分析大理茶叶绿体基因组密码子偏好性的影响因素。由图4 可知，大理茶叶绿体基因组编码基因并不是均匀地分布于 4 个区域中，在右上区域分布很少。如果密码子偏好性仅受基因突变的影响，在 PR2-plot 绘图分析中，4 种碱基的使用频率将相等。PR2-plot 分析显示大理茶叶绿体基因组种大部分基因受到自然选择或其他因素的影响。表 4 ENC 比值频数分布 Table 4 Distribution of ENC ration 组限 Class boundary 组中值 Class mid value 频数 Frequency number 频率/%Frequency 0.10 0.05 16 29.6 00.1 0.05 30 55.6 0.10.2 0.15 4 7.4 0.20.3 0.25 4 7.4 合计 54 100 0 0.25 0.50 0.75 1.00ENC 6040200GC3图 3 大理茶叶绿体基因组 ENC-plot 绘图分析 Fig.3 ENC-plot analysis of C.taliensis chloroplast genome 0 0.5 1.0 A3/(A3+T3)1.00.50G3/(G3+C3)图 4 大理茶叶绿体基因组 PR2-plot 绘图分析 Fig.4 PR2 bias plot analysis of C.taliensis chloroplast genome 3 期 佟岩，等：森林茶园古茶树大理茶叶绿体基因组密码子偏好性及系统发育研究 305 2.7 系统进化分析 茶组植物是异花授粉植物，种间甚至组间的杂交比较普遍，经过长期的自然杂交和人工选育，其种间的界限比较模糊，传统的形态分类基于心皮或子房室的数目，花梗、萼片、花瓣和果实的发育状况及叶片特征等，以及细胞学、化学和数量分类学等，很难得到公认的茶组植物分类系统26-32。目前，基于测序技术、分子生物学和分子系统学，在 DNA 水平上利用合适的分子标记解决物种间系统关系及分类是有效的方法33-41。对 10 种茶组植物和 2 种山茶科植物共 12种植物分别基于叶绿体基因组 matK 基因序列 和蛋白编码序列构建系统发育树（图 5），结果显示，2 种系统发育的拓扑结构相似，均将白毛茶、小叶茶、大苞茶、德宏茶和大叶茶云抗 10 号聚为一大类群，大理茶和秃房茶聚为一支，白毛茶和小叶茶聚为一支，两个外类群物种木荷和紫茎聚为一支，突肋茶和大厂茶分别位于单独的分支。3 讨论讨论 密码子受自然选择、基因突变、蛋白质结构等多因素的共同影响逐渐形成一定的偏好性，与基因的 GC 含量、长度、翻译效率、表达水平及 tRNA 丰度等因素有关25,42-45。本研 图 5 大理茶及茶组植物叶绿体系统发育树 Fig.5 Phylogenetic tree of C.taliensis chloroplast genome 958795777864 9795100白毛茶 C.sinensis var.pubilimba(matK)小叶茶 C.sinensis var.sinensis(matK)大苞茶 C.grandibracteata(matK)大叶茶云抗 10 号 C.sinensis var.assamica cv.Yunkang10(matK)德宏茶 C.sinensis var.dehungensis(matK)毛叶茶 C.ptilophylla(matK)大厂茶 C.tachangensis cv.Xingyi6(matK)大理茶 C.taliensis(matK)秃房茶 C.gymnogyna(matK)突肋茶 C.costata(matK)木荷 Schima superba(matK)紫茎 Stewartia sinensis(matK)基于叶绿体 matK