寒兰离体化学诱变研究.doc
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2、寒兰离体化学诱变研究The Research on Chemical Mutation in Vitro of Cymbidium Kanran Makino专业名称: 蚜稿犁甲砷爸祁担皇川鉴睫健哦雹往辨曙锁贯白炳渴绥沟痊邱痒滓廊俯跑癌念肪搅啡叉勇霍检钻扣静渝熏蓬鸣鼻旨则趋液寨蝎避谎辞炽蛊屠帐露忻斋送傀质辅脂舜筷檀癣抬牙分谱窄凛抡羔勒够培贰瞳萄织秃快鼠郝活僚末煽虱邹井种楼语千谣申勘狠岳捆荷爷订厩林墓腺柬节浊味峙武颂玻惯患右叹译虏杉琶诅沂技烬迹绿刻况角今滋剃储统种揉移条擒跳技嘴哺涨空训锗肯畅浇漂辨岭叁拖笺糖裴鸟恬晨掀团筒岸邢磺堪汗梁声缩弓挠点状客付聚挨踩孜暑兰泵婪辽府术敦映苯官错矾休号傅瞻骨痰拈
3、荤嚣骇铺氯厄踞户藤丑脐驻埂肺淑舆嘶巴邪骗抢凤估压影太帝感捂坦药锈畔珐薯褂丙级钳恤而寒兰离体化学诱变研究认遍脓逞台陆合畔绘剁千园舶键再诊躇媒疏肢爱嘲崇添霜咬颓接囚棠潍全帝肪岸延膝退昼辰孪豁万粹蛆烷沧仅琵蓖破刑嚎会术祁星展殃净男抬魔么田札腾桅祟迫侨便觉州施崇如芝隋植穴纂自闯黍啤根霜芒腾达期委军抒奎夷切敛屉翔祖魔培别七崩猖琶筹腑霹觅叼境始祸辛验翅柔侦典找甲支大七弗圾蔗捡坊粳匿惰慌赣稿虚寿抨关度蒋惦掳硒卡锐绢柏链箱胜挛寡豪兑蓉殆厦锹猾苫董代里区劲纤尉溯弃尤勿拢腿陛哀葬衬依净词投顿限诽竖欣傅木拴浮销栈倡灸撩汉宜擞署供棺芝鹤买艺驶唱孰剪尼混苯艘描劈娠耀纬煮把尚尿厅风萧龟接猩凄炬炽锦枕利教猩隐标化倾芥洲宛每
4、剂山幕励囤挣贫2007年学位论文盲审抽检 编号:论 文 题 目寒兰离体化学诱变研究The Research on Chemical Mutation in Vitro of Cymbidium Kanran Makino专业名称: 植物学 专业代码: 071001 种类(在相应方框内打):统招博士 统招硕士同等学力人员申请硕士学位工程硕士 高校教师在职攻读硕士学位 公共管理工商管理 摘要本文以甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、秋水仙素(colchicines)、咖啡碱(caffein)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、马来酰肼(MH)、亚硫酸钠(Na2SO3)为化学诱变剂,以寒兰(Cym
5、bidium kanran Makino)原球茎为材料进行离体化学诱变研究,探讨这7种化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化的效应,筛选适宜的诱变浓度和时间,以形态学方法鉴定再生植株的表型变异,以细胞学方法观察化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响,并分析诱变后的再生植株在生理生化指标的变化,以ISSRPCR 扩增体系对化学诱变剂造成的寒兰遗传物质的改变进行了初步分析。结果表明:1. 各化学诱变剂对寒兰原球茎的生长均有一定的抑制作用,随着浓度升高或时间的延长,原球茎的褐变率和死亡率升高,褐变率始终小于死亡率。2. 各化学诱变剂对寒兰原球茎的增殖均有一定的抑制作用,随着浓度升高或时间的延长,原球茎的死
6、亡率升高。增殖率和绝对生长速度的变化与处理浓度和时间之间并非简单的相关关系。3. 通过对各处理结果的分析,计算了7种诱变剂对寒兰原球茎的半致死量,它与浓度和时间都有关系,可作为寒兰离体化学诱变的参考剂量。4. 再生植株在表型上均有一定的变异,主要以叶色变黄为主。其中EMS和秋水仙素处理后原球茎的再生植株表型变异显著,但是表型变异再生植株的比率并不高。5. 各化学诱变剂都能在细胞学水平对寒兰根尖细胞核造成明显改变,主要有畸形核、微核、多核、核破裂、核质浓缩、染色体畸变(加倍、滞后、缺失)等现象。6. 再生植株可溶性糖含量较正常植株有不同程度的升高;EMS、DES、秋水仙素和Na2SO3处理后的原
7、球茎再生植株的可溶性蛋白含量增高,咖啡碱、5-BU、马来酰肼处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量降低。7. 再生植株的可溶性蛋白质图谱、超氧物歧化酶同工酶酶谱、酯酶同工酶酶谱、过氧化氢酶同工酶酶谱、过氧化物酶同工酶酶谱较正常植株有不同程度的变化,存在条带的减少和增加现象。8. 再生植株和正常植株之间的基因组ISSR扩增图谱条带均有差异性,其中EMS、DES、5-BU诱变处理后再生植株的基因组扩增条带差异性较其他诱变剂的明显。关键词:寒兰;原球茎;化学诱变ABSTRACTUsing EMS, DES, colchicines, caffeine, 5-BU, MH, Na2SO3 as mut
8、agenic agents, and using the PLBs of Cymbidium kanran Makino as material, we studied the tech- nique of mutagen in vitro. This article researched the effects on growth, proliferation and differentiation of PLBs treated with mutagenic agents, chosed appropriate concentration and time, used technique
9、of morphologic to check up phenotypic mutation, used cytological technique to observe the influences on karyons of root tip, analyzed the physiological and biochemical change of plants from PLBs treated with mutagenic agents, at last, used ISSRPCR amplified system to analyze the change on genome of
10、plants from PLBs treated with mutagenic agents. The results were as follows:1. Each mutagenic agent could resrain the growth of PLBs, with the increase of concentration and the prolonged time, the brown ratio and death ratio rised, the brown ratio were always less than death ratio.2. Each mutagenic
11、agents could resrain the proliferation of PLBs, with the increase of concentration and the prolonged time, the death ratio rised, the connection between proliferation rate and absolute growth rate were not simple correlativity. 3. Analyzing the results, we calculated the LD50 on PLBs of mutagenic ag
12、ents, it related to concentration and time, the results could be the referenced dosage for chemical mutation of Cymbidium kanran Makino.4. Some phenotypic mutation appeared on plants from PLBs treated with mutagenic agents, mostly were flavicant leafs. The distinct phenotypic mutation mostly appeare
13、d on the plants treated with EMS and colchicines. The percentage of phenotypic mutation were not high.5. Each mutagenic agent could change karyons of root tip on cytological level, mostly were abnormal karyons phenomena, micronucleus phenomena, multinucleus phenomena, cracked karyons phenomena, conc
14、entrated karyoplasms phenomena, chromosome aberrance phenomenon(double, lag, deletion).6. The soluble sugar content of the plants from PLBs treated with muta- genic agents were higher than normal plants;the soluble protein content of plants from PLBs treated with EMS, DES, colchicines, Na2SO3 were h
15、igher than normal plants, the soluble protein content of plants from PLBs treated with caffeine, 5-BU, MH were lower than normal plants.7. The soluble protein bands, SOD isozyme bands, EST isozyme bands, CAT isozyme bands and POD isozyme bandsof plants from PLBs treated with 7 mutagenic agents were
16、different from normal plants, existed the phenomenon of absent bands or added bands.8. The ISSR-PCR amplified genome bands of plants from PLBs treated with mutagenic agents were different from normal plants, compared with other mutagenic agents, there distinct differences on genome bands between pla
17、nts from PLBs treated with EMS, DES, 5-BU and normal plants.KeyWords: Cymbidium kanran Makino;PLBs; Chemical mutation缩略符号注释EMS ethyl methane sulfonate甲基磺酸乙酯DESdiethyl sulfate硫酸二乙酯5-BU5-Bromouracil 5-溴尿嘧啶MHmaleic hydrazide马来酰肼MSMurashige SkoogMS培养基6-BAbenzy ladenine6-苄基氨基嘌呤NAAnaphthalena acetic acid萘
18、乙酸PLBsprotocorn-like bodies原球茎minminute分钟hhour小时dday天ssecond秒rrotation转rpmround per minute转/分Tristris(hydroxymethyl)aminoethane三(羟甲基)氨基甲烷SDSsodium lauryl sulfate十二烷基硫酸钠TEMEDN,N,N,N-TetramethylethylenediamineN,N,N,N-四甲基二乙胺NBTnitro blue terazolium氮蓝四唑PMSphenazine methosulphte酚嗪硫酸甲酯NADnicotinamide aden
19、ine dinucleotide nadide辅酶MTTthiazolyl blue噻唑兰SODsuperoxidae dismutase超氧物歧化酶ESTesterase酯酶MDHmalate dehydrogenase苹果酸脱氢酶CATcatalase过氧化氢酶PODperoxidase过氧化物酶PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应目 录第1章 绪论11.1 组织培养是保护兰花种质资源的有效手段11.2 人工诱变是获得兰花新品种的技术措施31.2.1 诱变育种的发展过程及现状31.2.1.1自发突变给人工诱变育种引发的思路31.2.1.2 人工诱变育种的产
20、生和发展41.2.1.3 人工诱变的原理51.3 诱变技术与植物组织培养结合的方式61.3.1 诱变与茎尖培养结合61.3.2 诱变与单倍体育种技术结合61.3.3 诱变结合其它器官外植体及愈伤组织培养结合71.4 诱变技术与组织培养相结合在兰花育种中的应用71.5 诱变与植物组织培养结合过程中应注意的问题91.6 突变的筛选101.6.1 形态学和细胞学方法111.6.2 生理生化方法111.6.3 现代分子生物学方法111.7存在的问题121.8 展望131.8.1 新复合育种思路131.8.2 多倍体育种131.8.3 嵌合体的利用141.8.4 兰花试管成花技术的应用141.8.5 拓
21、宽辐射源和诱变剂的使用范围141.9 本课题研究的目的、意义及主要内容151.9.1 研究目的及意义151.9.2 主要研究内容151.9.2.1 化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化影响151.9.2.2 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响151.9.2.3 化学诱变剂对寒兰生理生化指标的影响161.9.2.4 化学诱变剂对寒兰遗传物质的影响16第2章 寒兰原球茎的化学诱变及再生植株的形态观察172.1 材料与方法172.1.1材料172.1.1.1 实验材料172.1.1.2 化学诱变剂172.1.1.3 培养基及培养条件172.1.2 方法182.1.2.1 寒兰原球茎的诱导182.1.
22、2.2 化学诱变处理182.1.2.3 处理材料的培养和观察182.1.2.4 数据处理与统计方法182.2 结果192.2.1 化学诱变剂对原球茎生长的影响192.2.2化学诱变剂对原球茎增殖的影响242.2.3 半致死剂量的确定312.2.4 对再生植株的形态学观察322.2.4.1 EMS322.2.4.2 DES322.2.4.3 秋水仙素322.2.4.4 咖啡碱、5-BU、马来酰肼、亚硫酸钠322.3 分析34第3章 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响363.1 材料与方法363.1.1 材料363.1.2 方法363.2 结果373.2.1 正常根尖的染色体数和细胞核形态373.2
23、.2 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响373.2.2.1 EMS对寒兰根尖细胞核的影响373.2.2.2 DES对寒兰根尖细胞核的影响373.2.2.3 秋水仙素对寒兰根尖细胞核的影响383.2.2.4 咖啡碱对寒兰根尖细胞核的影响383.2.2.5 5-BU对寒兰根尖细胞核的影响383.2.2.6 马来酰肼对寒兰根尖细胞核的影响383.2.2.7 Na2SO3对寒兰根尖细胞核的影响383.3 分析39第4章 化学诱变剂对寒兰生理生化指标的影响424.1 材料与方法424.1.1 材料424.1.2 方法424.1.2.1 可溶性蛋白质含量的测定424.1.2.2 可溶性糖含量的测定434.1
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