寒兰离体化学诱变研究.doc

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摘要

21

Q260046902 专业做论文

2007年
学位论文盲审抽检

编号：

论 文 题 目

寒兰离体化学诱变研究
The Research on Chemical Mutation in Vitro
of Cymbidium Kanran Makino

专业名称： 蚜稿犁甲砷爸祁担皇川鉴睫健哦雹往辨曙锁贯白炳渴绥沟痊邱痒滓廊俯跑癌念肪搅啡叉勇霍检钻扣静渝熏蓬鸣鼻旨则趋液寨蝎避谎辞炽蛊屠帐露忻斋送傀质辅脂舜筷檀癣抬牙分谱窄凛抡羔勒够培贰瞳萄织秃快鼠郝活僚末煽虱邹井种楼语千谣申勘狠岳捆荷爷订厩林墓腺柬节浊味峙武颂玻惯患右叹译虏杉琶诅沂技烬迹绿刻况角今滋剃储统种揉移条擒跳技嘴哺涨空训锗肯畅浇漂辨岭叁拖笺糖裴鸟恬晨掀团筒岸邢磺堪汗梁声缩弓挠点状客付聚挨踩孜暑兰泵婪辽府术敦映苯官错矾休号傅瞻骨痰拈荤嚣骇铺氯厄踞户藤丑脐驻埂肺淑舆嘶巴邪骗抢凤估压影太帝感捂坦药锈畔珐薯褂丙级钳恤而寒兰离体化学诱变研究认遍脓逞台陆合畔绘剁千园舶键再诊躇媒疏肢爱嘲崇添霜咬颓接囚棠潍全帝肪岸延膝退昼辰孪豁万粹蛆烷沧仅琵蓖破刑嚎会术祁星展殃净男抬魔么田札腾桅祟迫侨便觉州施崇如芝隋植穴纂自闯黍啤根霜芒腾达期委军抒奎夷切敛屉翔祖魔培别七崩猖琶筹腑霹觅叼境始祸辛验翅柔侦典找甲支大七弗圾蔗捡坊粳匿惰慌赣稿虚寿抨关度蒋惦掳硒卡锐绢柏链箱胜挛寡豪兑蓉殆厦锹猾苫董代里区劲纤尉溯弃尤勿拢腿陛哀葬衬依净词投顿限诽竖欣傅木拴浮销栈倡灸撩汉宜擞署供棺芝鹤买艺驶唱孰剪尼混苯艘描劈娠耀纬煮把尚尿厅风萧龟接猩凄炬炽锦枕利教猩隐标化倾芥洲宛每剂山幕励囤挣贫

2007年
学位论文盲审抽检

编号：

论 文 题 目

寒兰离体化学诱变研究
The Research on Chemical Mutation in Vitro
of Cymbidium Kanran Makino

专业名称： 植物学
专业代码： 071001
种类（在相应方框内打√）：
统招博士□ 统招硕士□同等学力人员申请硕士学位□
工程硕士□ 高校教师在职攻读硕士学位□ 公共管理□
工商管理□

摘要
本文以甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、秋水仙素(colchicines)、咖啡碱(caffein)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、马来酰肼(MH)、亚硫酸钠(Na2SO3)为化学诱变剂，以寒兰(Cymbidium kanran Makino)原球茎为材料进行离体化学诱变研究，探讨这7种化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化的效应，筛选适宜的诱变浓度和时间，以形态学方法鉴定再生植株的表型变异，以细胞学方法观察化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响，并分析诱变后的再生植株在生理生化指标的变化，以ISSR–PCR 扩增体系对化学诱变剂造成的寒兰遗传物质的改变进行了初步分析。结果表明：
1. 各化学诱变剂对寒兰原球茎的生长均有一定的抑制作用，随着浓度升高或时间的延长，原球茎的褐变率和死亡率升高，褐变率始终小于死亡率。
2. 各化学诱变剂对寒兰原球茎的增殖均有一定的抑制作用，随着浓度升高或时间的延长，原球茎的死亡率升高。增殖率和绝对生长速度的变化与处理浓度和时间之间并非简单的相关关系。
3. 通过对各处理结果的分析，计算了7种诱变剂对寒兰原球茎的半致死量，它与浓度和时间都有关系，可作为寒兰离体化学诱变的参考剂量。
4. 再生植株在表型上均有一定的变异，主要以叶色变黄为主。其中EMS和秋水仙素处理后原球茎的再生植株表型变异显著，但是表型变异再生植株的比率并不高。
5. 各化学诱变剂都能在细胞学水平对寒兰根尖细胞核造成明显改变，主要有畸形核、微核、多核、核破裂、核质浓缩、染色体畸变(加倍、滞后、缺失)等现象。
6. 再生植株可溶性糖含量较正常植株有不同程度的升高；EMS、DES、秋水仙素和Na2SO3处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量增高，咖啡碱、5-BU、马来酰肼处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量降低。
7. 再生植株的可溶性蛋白质图谱、超氧物歧化酶同工酶酶谱、酯酶同工酶酶谱、过氧化氢酶同工酶酶谱、过氧化物酶同工酶酶谱较正常植株有不同程度的变化，存在条带的减少和增加现象。
8. 再生植株和正常植株之间的基因组ISSR扩增图谱条带均有差异性，其中EMS、DES、5-BU诱变处理后再生植株的基因组扩增条带差异性较其他诱变剂的明显。
关键词：寒兰；原球茎；化学诱变

ABSTRACT
Using EMS, DES, colchicines, caffeine, 5-BU, MH, Na2SO3 as mutagenic agents, and using the PLBs of Cymbidium kanran Makino as material, we studied the tech- nique of mutagen in vitro. This article researched the effects on growth, proliferation and differentiation of PLBs treated with mutagenic agents, chosed appropriate concentration and time, used technique of morphologic to check up phenotypic mutation, used cytological technique to observe the influences on karyons of root tip, analyzed the physiological and biochemical change of plants from PLBs treated with mutagenic agents, at last, used ISSR–PCR amplified system to analyze the change on genome of plants from PLBs treated with mutagenic agents. The results were as follows:
1. Each mutagenic agent could resrain the growth of PLBs, with the increase of concentration and the prolonged time, the brown ratio and death ratio rised, the brown ratio were always less than death ratio.
2. Each mutagenic agents could resrain the proliferation of PLBs, with the increase of concentration and the prolonged time, the death ratio rised, the connection between proliferation rate and absolute growth rate were not simple correlativity.
3. Analyzing the results, we calculated the LD50 on PLBs of mutagenic agents, it related to concentration and time, the results could be the referenced dosage for chemical mutation of Cymbidium kanran Makino.
4. Some phenotypic mutation appeared on plants from PLBs treated with mutagenic agents, mostly were flavicant leafs. The distinct phenotypic mutation mostly appeared on the plants treated with EMS and colchicines. The percentage of phenotypic mutation were not high.
5. Each mutagenic agent could change karyons of root tip on cytological level, mostly were abnormal karyons phenomena, micronucleus phenomena, multinucleus phenomena, cracked karyons phenomena, concentrated karyoplasms phenomena, chromosome aberrance phenomenon(double, lag, deletion).
6. The soluble sugar content of the plants from PLBs treated with muta- genic agents were higher than normal plants;the soluble protein content of plants from PLBs treated with EMS, DES, colchicines, Na2SO3 were higher than normal plants, the soluble protein content of plants from PLBs treated with caffeine, 5-BU, MH were lower than normal plants.
7. The soluble protein bands, SOD isozyme bands, EST isozyme bands, CAT isozyme bands and POD isozyme bandsof plants from PLBs treated with 7 mutagenic agents were different from normal plants, existed the phenomenon of absent bands or added bands.
8. The ISSR-PCR amplified genome bands of plants from PLBs treated with mutagenic agents were different from normal plants, compared with other mutagenic agents, there distinct differences on genome bands between plants from PLBs treated with EMS, DES, 5-BU and normal plants.
KeyWords: Cymbidium kanran Makino;PLBs; Chemical mutation

缩略符号注释
EMS
ethyl methane sulfonate
甲基磺酸乙酯
DES
diethyl sulfate
硫酸二乙酯
5-BU
5-Bromouracil
5-溴尿嘧啶
MH
maleic hydrazide
马来酰肼
MS
Murashige Skoog
MS培养基
6-BA
benzy ladenine
6-苄基氨基嘌呤
NAA
naphthalena acetic acid
萘乙酸
PLBs
protocorn-like bodies
原球茎
min
minute
分钟
h
hour
小时
d
day
天
s
second
秒
r
rotation
转
rpm
round per minute
转/分
Tris
tris(hydroxymethyl)aminoethane
三(羟甲基)氨基甲烷
SDS
sodium lauryl sulfate
十二烷基硫酸钠
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine
N,N,N',N'-四甲基二乙胺
NBT
nitro blue terazolium
氮蓝四唑
PMS
phenazine methosulphte
酚嗪硫酸甲酯
NAD
nicotinamide adenine dinucleotide nadide
辅酶Ⅰ
MTT
thiazolyl blue
噻唑兰
SOD
superoxidae dismutase
超氧物歧化酶
EST
esterase
酯酶
MDH
malate dehydrogenase
苹果酸脱氢酶
CAT
catalase
过氧化氢酶
POD
peroxidase
过氧化物酶
PCR
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链式反应

目 录
第1章 绪论 1
1.1 组织培养是保护兰花种质资源的有效手段 1
1.2 人工诱变是获得兰花新品种的技术措施 3
1.2.1 诱变育种的发展过程及现状 3
1.2.1.1自发突变给人工诱变育种引发的思路 3
1.2.1.2 人工诱变育种的产生和发展 4
1.2.1.3 人工诱变的原理 5
1.3 诱变技术与植物组织培养结合的方式 6
1.3.1 诱变与茎尖培养结合 6
1.3.2 诱变与单倍体育种技术结合 6
1.3.3 诱变结合其它器官外植体及愈伤组织培养结合 7
1.4 诱变技术与组织培养相结合在兰花育种中的应用 7
1.5 诱变与植物组织培养结合过程中应注意的问题 9
1.6 突变的筛选 10
1.6.1 形态学和细胞学方法 11
1.6.2 生理生化方法 11
1.6.3 现代分子生物学方法 11
1.7存在的问题 12
1.8 展望 13
1.8.1 新复合育种思路 13
1.8.2 多倍体育种 13
1.8.3 嵌合体的利用 14
1.8.4 兰花试管成花技术的应用 14
1.8.5 拓宽辐射源和诱变剂的使用范围 14
1.9 本课题研究的目的、意义及主要内容 15
1.9.1 研究目的及意义 15
1.9.2 主要研究内容 15
1.9.2.1 化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化影响 15
1.9.2.2 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响 15
1.9.2.3 化学诱变剂对寒兰生理生化指标的影响 16
1.9.2.4 化学诱变剂对寒兰遗传物质的影响 16
第2章 寒兰原球茎的化学诱变及再生植株的形态观察 17
2.1 材料与方法 17
2.1.1材料 17
2.1.1.1 实验材料 17
2.1.1.2 化学诱变剂 17
2.1.1.3 培养基及培养条件 17
2.1.2 方法 18
2.1.2.1 寒兰原球茎的诱导 18
2.1.2.2 化学诱变处理 18
2.1.2.3 处理材料的培养和观察 18
2.1.2.4 数据处理与统计方法 18
2.2 结果 19
2.2.1 化学诱变剂对原球茎生长的影响 19
2.2.2化学诱变剂对原球茎增殖的影响 24
2.2.3 半致死剂量的确定 31
2.2.4 对再生植株的形态学观察 32
2.2.4.1 EMS 32
2.2.4.2 DES 32
2.2.4.3 秋水仙素 32
2.2.4.4 咖啡碱、5-BU、马来酰肼、亚硫酸钠 32
2.3 分析 34
第3章 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响 36
3.1 材料与方法 36
3.1.1 材料 36
3.1.2 方法 36
3.2 结果 37
3.2.1 正常根尖的染色体数和细胞核形态 37
3.2.2 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响 37
3.2.2.1 EMS对寒兰根尖细胞核的影响 37
3.2.2.2 DES对寒兰根尖细胞核的影响 37
3.2.2.3 秋水仙素对寒兰根尖细胞核的影响 38
3.2.2.4 咖啡碱对寒兰根尖细胞核的影响 38
3.2.2.5 5-BU对寒兰根尖细胞核的影响 38
3.2.2.6 马来酰肼对寒兰根尖细胞核的影响 38
3.2.2.7 Na2SO3对寒兰根尖细胞核的影响 38
3.3 分析 39
第4章 化学诱变剂对寒兰生理生化指标的影响 42
4.1 材料与方法 42
4.1.1 材料 42
4.1.2 方法 42
4.1.2.1 可溶性蛋白质含量的测定 42
4.1.2.2 可溶性糖含量的测定 43
4.1.2.3 SDS-PAGE不连续电泳 43
4.1.2.4同工酶电泳 45
4.2 结果 49
4.2.1 化学诱变剂对可溶性糖含量的影响 50
4.2.2 化学诱变剂对可溶性蛋白质含量的影响 50
4.2.3 化学诱变剂对寒兰可溶性蛋白质组分的影响 50
4.2.4 化学诱变剂对寒兰同工酶的影响 53
4.2.4.1 超氧化物岐化酶同工酶(SOD)酶谱 59
4.2.4.2 酯酶同工酶(EST)酶谱 59
4.2.4.3 苹果酸脱氢酶同工酶(MDH)酶谱 59
4.2.4.4 过氧化氢酶同工酶(CAT)酶谱 59
4.2.4.5 过氧化物酶同工酶(POD)酶谱 59
4.3 分析 60
第5章 化学诱变剂对寒兰遗传物质影响的初步分析 61
5.1 材料和方法 61
5.1.1 材料 61
5.1.2试剂和设备 61
5.1.3 试剂配置 62
5.1.4 方法 62
5.1.4.1 材料DNA的提取 62
5.1.4.2 ISSR分子标记PCR扩增 63
5.2 结果 63
5.3 分析 65
第6章 讨论 67
6.1 讨论 67
6.1.1 染色体畸变 67
6.1.2 点突变 68
6.1.2.1 EMS和DES(烷化剂类诱变剂) 68
6.1.2.2 咖啡碱、5-溴尿嘧啶、马来酰肼(碱基类似物类诱变剂) 69
6.1.2.3 亚硫酸钠(无机化合物类诱变剂) 70
第7章 结论及建议 71
7.1 结论 71
7.2 建议 72
7.2.1 复合诱变手段 72
7.2.2. 缩短营养生长期 72
7.2.3 与分子生物学的结合 73
参考文献 74
图版Ⅰ 78
图版Ⅱ 80
读研期间已发表论文 86

第1章 绪论
寒兰(Cymbidium kanran Makino)，兰科兰属中的地生兰，生长于海拔400～2400米，主要分布在江西、台湾、福建、浙江、湖南、广东、广西和四川等地，也见于日本和朝鲜半岛南端。寒兰的营养繁殖为分株繁殖，是传统繁殖方式，然而其繁殖系数极低；通过种子萌发来繁殖，为有性繁殖，但是寒兰种子极小，没有胚乳，只有一个发育不完全的胚，种皮致密有蜡质，并且可能含有抑制物，因此，自然条件下极难萌发。
目前野生寒兰资源正面临一场劫难，表现为寒兰数量剧减，一些种群甚至濒危或灭绝，其主要原因有三：一是自然繁殖系数低；二是因为其巨大的经济价值而遭到人为的滥采，有资料统计表明，市场上交易的寒兰99%来自于自然野生资源；三是由于森林砍伐，水土流失，寒兰赖以生存的生态环境遭到严重破坏。随着国内寒兰热的急剧升温，野生寒兰资源保护面临着严峻挑战，寒兰的种质资源保存也被提上议题。
在兰花市场上，寻购“新、奇、特”的寒兰精品的兰友络绎不绝，甚至不惜重金收集，在此强烈的市场需求下，寒兰的价格被逐渐抬高。在经济利益的驱动下，人们纷纷在野生寒兰品种中寻找变异植株，而寒兰在自然界的变异率仅有百万分之一，随着人们毫无限制性的采撷，使得原本就不算丰富的野生寒兰资源迅速走向枯竭，成为濒危珍稀植物，这使得保护寒兰的种质资源成为迫在眉睫的任务。因此，为了保护寒兰资源，满足市场需求，需要建立一套寒兰快速繁殖培养体系，可以迅速大量的培养寒兰，并且在此基础上进行化学诱变研究，培育出新品种，尽可能的满足人们对“新、奇、特”兰花的需求。
1.1 组织培养是保护兰花种质资源的有效手段
兰花是整个兰科植物(Orchidaceae)的总称，全世界约有730多属，21500多种，广泛分布于全球各地，但主要分布在热带、亚热带地区。我国约173余属，1240余种，在南北各地均有分布，但以云南、台湾、海南最为丰富[1]。兰科植物可分为三种类型：地生兰、附生兰和腐生兰。在我国，习惯把兰花分为国兰和洋兰。国兰一般指原产于我国、花型小、有香气的兰属(Cymbidium)中的几种地生兰，主要有春兰(C. goeringii)、蕙兰(C. faberi)、建兰(C. ensifolium)、墨兰(C. sinense)、寒兰(C. kanaran)、莲瓣兰(C. lianpan)和春剑(C. goeringii var. longibracteatum)等。洋兰主要是指原在热带的国外生产和培育的一些花大、色艳的附生种类，主要有卡特兰属(Cattleya)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、石斛兰属(Dendrobium)、文心兰属(Oncidium)等[2]。目前，兰花在世界各地逐渐发展成为产业。
兰科植物一直倍受国际社会关注，在生物进化研究、生物多样性保护等方面发挥着极其关键的作用，尤其是在观赏花卉、医药保健等领域更具有巨大的经济开发和利用价值。在兰花观赏上，“新、奇、特”的兰花精品供不应求，人们甚至不惜重金收集，在此强烈的市场需求下，兰花的价格被逐渐抬高。受到经济利益的驱使，野生兰资源遭受了人为的滥采，这就需要人们寻找有效的方式来保护兰花的种质资源[3]。
植物的种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式。原地保存和异地保存都是指在自然状态下保存植物。设施保存，也叫设备保存、离体保存，就是利用种质资源库(冷藏库、超低温库、组织培养室)等保存设施长期保存种子、配子体、器官、组织、细胞等种质材料，来达到保存植物种质资源的目的，它也可以被看作是异地保存中的一种形式，组织培养就是其中最安全有效的保存方式。植物组织培养(Plant tissue culture)，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。由于培养的是脱离植物母体的培养物，所以也叫植物离体培养(In vitro culture of plant)或植物试管培养(Plant culture in test-tube)。广义的组织培养，不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。利用组织培养的方式进行大规模克隆繁育，可以缓解对兰科植物资源的采集压力。兰花组织培养的外植体有：根、茎段、顶芽、侧芽、花茎等。自从1960年法国G.Morel开创了兰花茎尖组织培养法以来，全世界已有70多个属，数百种和更多的品种兰花走上了工厂化生产。我国在20世纪70年代末就开始进行兰属植物组织培养方法的研究，并取得了阶段性成果，这一技术的应用对其快繁、品种复壮、加快优良品种的培育、挽救珍稀濒危种类等方面起到了重要作用。近几年来，由于我国经济的发展，兰花种子萌发技术的进步、组培快繁技术的应用和栽培技术的不断提高，兰花开始走上产业化的道路。兰花产业发展到今天，组织培养技术功不可没，国兰中的墨兰(C. sinense)、建兰(C. ensifolium)、春兰(C. goeringii)、蕙兰(C. fabri)都建立了无性快速繁殖体系，培养出来的新植株和它们母体具有相同的全部遗传信息，即遗传上的相对稳定性，然而有关寒兰的组织培养报道较少。所以，建立完整的寒兰快速繁殖体系对其物种资源保护具有重要的意义。
1.2 人工诱变是获得兰花新品种的技术措施
众所周知，兰花市场的竞争，实质上就是优良品种的竞争，组织培养能快速繁殖培养兰花品种，但对培育新品种来说，由于其变异率低，而少有单独用于品种培育；基因工程手段显然是育种主要研究方向之一，由于起步晚，需要较高的实验手段，方法条件尚不成熟处于探索之中；再加上中国兰花繁殖的特殊性，试图通过杂交获得优良变异并使之遗传下去，难度较大，并且所需时间也很长，所以，中国兰很少用杂交的方式来培育新品种。
上个世纪30年代，遗传学史上最重要的发现之一就是Muller发现突变能够被诱发(1930)，并由此产生了一种新的育种途径——诱变育种。它的出现为植物优良种质的创造和优良品种的选育开辟了一个新的途径，具有重要的意义。与常规育种相比，诱变育种能够提高突变率，扩大变异谱，诱变的突变率一般可达千分之几，有时可达1/30，甚至可能获得自然界罕见的珍稀变异，在短时间内育出新品种。因其育种程序简单而可有效缩短育种年限；更由于其可控因素较多，可控性强而适用于个别性状的改良。
1.2.1 诱变育种的发展过程及现状
1.2.1.1自发突变给人工诱变育种引发的思路
自发突变是指自然条件下发生的突变，在生物体进化的历史中，它是生物变异的重要来源，也是自然进化的基础。自然界存在广泛的自然突变，无论是低等生物，还是高等动植物及人类，都可能发生自然突变。一方面，自然突变的发现和研究为人类实践诱变育种奠定了基础，另一方面自发突变也为人类提供了极有价值的育种材料。自发突变为最初的人工诱变育种的出现开拓了思路，但由于自发突变的突变频率极低(只有10-5～10-8)，恢复率高，群体太小，分离麻烦和非遗传变异较多，而且选择的优良个体少、鉴定时间长，无法收集到足够的突变体。另外，自发突变基因通常需要用图位克隆方法进行分离，时间长，耗费大，只能作为突变体构建的辅助方法。所以在此基础上出现了最初的人工诱变，即运用物理化学等方法实施人为定性的变异诱导。
1.2.1.2 人工诱变育种的产生和发展
诱变育种从20世纪发现和使用至今，在植物上的应用已有相当长的时间，主要有2种方式：辐射诱变和化学诱变。Muller在1924年发现X射线能引起果蝇产生遗传变异，并由此发现了物理因素的诱变作用后，Stadler、Nilsson-Ehle和Gustafsson、Tollenler等先后利用射线在玉米、大麦、烟草等植物上诱发了有实用价值的突变体，由此，成为早期诱变的主要方式。辐射诱变使用各种射线以造成染色体水平的畸变，如倒位、缺失等等形成突变[2]。特点是对染色体伤害较大，因此致死突变较多。尽管如此，由于早期是诱变技术的主流，从事诱变及其后代品种筛选工作的人员众多，也获取了大量的用于生产的稳定突变体后代。
利用化学试剂进行人工诱变的尝试开始于1924年，Auerbach用芥子气诱导产生类似于射线诱导的各种变异，而后在小麦、水稻、高粱、大豆以及蔬菜、花卉等20多种植物上获得突变体。化学诱变的应用虽然晚于物理因素，但目前在诱变领域的应用也并不逊色。化学诱变通过化学试剂造成生物DNA的损伤和错误修复，产生突变体。这些突变以点突变为主，并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。由于这一技术还具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点，因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。狭意的化学诱变的技术包括诱变材料的选择、诱变剂的选用，而广意上说，突变体筛选技术和随后的突变体分子检测技术的发展也是重要的组成部分，决定着化学诱变技术在当代科技的背景下，在育种上的广泛而有效的应用[4]。在近40年的发展过程中，从诱变剂的利用到诱变手段和分离筛选技术的不断研究，使得诱变体系日臻完善。化学诱变的特点满足了人们对兰花求新求异的要求，使化学诱变成为目前兰花品种培育与改良中的一种非常重要的手段，国内外在此领域的研究均有较为乐观的成果。
1.2.1.3 人工诱变的原理
1 辐射诱变原理
辐射诱变的主要机理为：通过高能电子或带电粒子把能量传递给靶物质，导致生物体合成被抑制，DNA分子损伤(包括碱基脱落、碱基破坏、二聚体形成等)，DNA双链断裂，从而引起生物体通过损伤修复而产生遗传性变异。目前应用最广泛的辐射源，包括X射线、γ射线、β射线、紫外线和中子等[5]。
2 化学诱变原理
常见的化学诱变剂主要有以下几类
(1) 烷化剂
作用机制：烷化作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。烷化剂分为以下几类：
① 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐
代表药剂：甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)
② 亚硝基烷基化合物
代表药剂：亚硝基乙基脲(NEH)、N-亚硝基-N-乙基脲烷(NEU)
③ 次乙胺和环氧乙烷类
代表药剂：乙烯亚胺(EI)
④ 芥子气类：氮芥类、硫芥类
(2) 核酸碱基类似物
作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。
代表药剂：5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-溴去氧尿嘧啶核苷(5-BUdR)，8-氮鸟嘌呤、咖啡碱、马来酰肼等。
(3) 其他诱变剂
包含一些无机化合物和生物碱
① 亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA 复制紊乱。HNO2 还能造成DNA 双链间的交联而引起遗传效应。
② 秋水仙素可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向两极，从而产生染色体加倍的核[6]。适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的形成，但对染色体结构无明显影响，用秋水仙素主要是诱导多倍体植株。
1.3 诱变技术与植物组织培养结合的方式
1.3.1 诱变与茎尖培养结合
诱变与茎尖培养相结合的研究主要集中在香蕉和马铃薯等无性繁殖植物上。Omar等研究了EMS对香蕉两个无性系茎尖培养的作用方式，发现标记的诱变剂在茎尖顶端分生组织、叶原基部位累积，并在球茎区域更广泛地存在，而这个区域正是新的不定芽起源的部位。随着EMS浓度的提高，新的不定芽产生的数量减少[7]。从理论而言，在诱变与茎尖培养的结合中，诱变了的细胞发育为再生植株的机率主要依赖其在多细胞的茎尖组织中的位置，表层细胞要比深层细胞机率要大，如果诱变发生在顶端原始细胞，这些细胞会产生较大的突变区域，那么则可保证获得数量较多的突变体。Bhagwat和Duncan研究了叠氮化钠、硫酸二乙酯和EMS作为诱变剂结合香蕉茎尖培养抗镰刀菌萎蔫症突变体，发现不同诱变剂之间及不同处理时间长短对诱导产生的变异数目影响不显著，从三种化学诱变剂处理产生的植株中分别获得4.2%、1.9%和6.1%的耐性植株。他们还研究了不同剂量的γ-射线对香蕉茎尖培养的诱变效果，发现新切割下的茎端和球茎要比在液体培养基中培养4周的茎端外植体的有效性高[8]。
1.3.2 诱变与单倍体育种技术结合
单倍体育种或加倍单倍体育种技术包括对花药(小孢子)培养、(未受精)胚珠培养和染色体去除获得单倍体植株及染色体加倍技术。利用诱变与花药培养结合的研究见诸于多种植物的报道，Vagera等报道用MNH(N-甲基-N-亚硝基脲)和BMS(n-丁基甲基碘酸盐)处理烟草种子进行花药培养，其产生单倍体的数量比对照增加100%～220%，即使较高剂量的诱变剂也能显著增加花药出愈率和雄核发育单倍体的频率。Przewozny等也发表了类似的研究报道，用X射线、γ射线和化学诱变剂处理双单倍体的马铃薯花序，在其花药培养物中由小孢子衍生出来的多细胞频率增加，其中用0.1或0.5Mm MNH处理的刺激效应比最高，比对照分别增加165%和126%。
1.3.3 诱变结合其它器官外植体及愈伤组织培养结合
除茎尖和花粉外，其它再生能力较强的外植体如叶柄、叶片、花序、花瓣、果柄等也可经诱变处理获得较高频率的突变体，如以马铃薯叶轴、叶柄和小叶圆片作为外植体，经X射线处理后，体外培养产生的不定芽中，平均突变率达68.2%，其中小叶圆片作为外植体产生不定芽的频率最高，达85.9%。以愈伤组织作为材料，也可获得较高频率的突变体。需要指出的是，不同剂量或浓度的诱变剂对愈伤组织的诱导率、成活率、绿苗分化率及再生植株突变率有较大的影响[9]。由于绝大多数植物的细胞悬浮培养和原生质体培养难以再生植株，所以这方面的报道极少。
1.4 诱变技术与组织培养相结合在兰花育种中的应用
近年来随着组培和生物技术的不断发展和完善，将组织培养、生物技术和诱变育种相结合，产生了一种新型的育种途径——生物技术诱变育种。组织培养原来的目标是母本性状的克隆和快繁，近几年来却成为创造新种质的有效方法。植物体细胞经组织培养，可以产生大量的变异，自然条件下出现无性系变异是一种正常的现象，其自然变异频率随培养时间的延长而提高。这些变异的个别性状可稳定遗传给后代，给创造新的种质资源提供了可靠的遗传基础。组培过程中产生的变异个别性状稳定快，一般R3即可稳定，比常规育种方法稳定世代短，有利于加速育种的进程。采用这种方法已经获得多种优良品种：如孔繁伦等通过水稻体细胞培养获得了大粒型水稻；何世贤等用小麦体细胞培养选育出几个新的优良品系；王呈祥等通过组培研究表明高粱体细胞无性系变异类型丰富，许多形态学及生物学性状均可发生变异等。
随着诱变育种范围的不断拓广，其与组培技术的结合为显现体细胞突变开辟了广阔前景。它可以彻底暴露内部组织，为不同的细胞提供更多更深刻的变异机会，进一步扩大诱变频率；将诱变后的材料再利用分离突变体的培养基、培养液或短期胁迫进行筛选，以使突变型尽早显现出来，还可以提前获得突变体，缩短诱变与选择时间。Broerjes指出，离体叶片、叶柄、花梗上产生的不定芽多起源于单细胞，而来自辐射材料单个或少数细胞产生的不定芽，获得突变的机率较大，可以减少体细胞选择，获得高频的周缘嵌合体或同质突变体，对缩短育种年限、提高育种效率大有益处[10]。结合诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选，还可实现一定程度的定向诱发和选择，克服辐射诱变本身的随机性、嵌合性和单细胞突变的缺陷，育种效率提高，周期缩短。使用植物激素，尤其是高浓度的细胞分裂素6-BA(3mg.L-1)等诱导愈伤组织，会提高多倍体细胞的分裂频率或导致不正常细胞分裂[11，12]，从而增加变异机率。因此，利用化学诱变剂处理外植体可提高获得突变体的可能性[13]。
兰花的组织培养始于20世纪60年代，Morel采用大花蕙兰的茎尖，将其分生组织诱导形成原球茎并分化成植株[14]，导致兰花栽培技术变革，建立了兰花工业，之后40多年来，兰花组培技术不断发展和完善，先后大约有60余属数百种兰花的组织培养研究见诸报道。国外的洋兰组织培养早已发展成为产