食品药品检验检测中心分子生物学平台建设项目书样本.docx

食品药品检验检测中心分子生物学平台建设项目书尊敬领导：感谢贵单位给我机会向你们介绍分子生物学平台建设方案，该分子平台包含PCR电泳成像系统、荧光定量PCR仪、微滴式数字PCR系统、全自动病原微生物检测系统、脉冲场电泳系统，和酶标仪洗板机、蛋白纯化系统、细胞分选系统等，经过有机结合，技术互补，实现现在行业内最领先最专业分子检测技术，为食品药品安全提供整体处理方案。该分子平台可开展应用和研究方向包含但不限于：1、病原微生物快速检测、活菌定量检测、致病菌溯源2、动物源性成份定性和定量分析3、转基因成份定性和定量分析4、中药材真伪判别5、生物制品检测6、药品安全评价7、检测新技术研究及试剂盒开发等目 录一、分子平台应用实例31、食源性致病菌快速检测32、致病菌活菌定量检测73、致病菌溯源104、动物源性成份检测145、肉类及肉类制品中成份掺假和虚标196、转基因成份定性和定量检测237、中药真伪判别328、生物制品检测379、药品安全评价43二、关键仪器介绍441、PCR电泳成像系统442、CFX96 Touch型荧光定量PCR系统453、QX200微滴式数字PCR系统464、iQ-Check全自动病原微生物检测系统475、脉冲场电泳系统486、蛋白纯化系统497、细胞分选系统50三、分子平台推荐计划51四、分子平台推荐配置52一、分子平台应用实例1、食源性致病菌快速检测背景介绍民以食为天，食品作为大家日常生活中不可或缺一部分，它安全关系到人类生命安全和生存发展，而食源性致病菌是威胁到目前食品安全关键原因之一。即使多年来由食源性致病菌引发食物中毒事件报道数量有所降低，不过据美国CDC公布检测汇报显示，试验室检出食源性菌如沙门氏菌概率并没有降低，所以食源性致病菌对公共健康威胁仍不容小觑1。传统检测方法即使是食源性致病菌检测“金标准”，但因其操作繁琐，需要花费大量人力、物力和时间，极难满足基层日常检测和执法需求。尤其在中国，首先食品需求数量巨大，其次食品加工生产却呈规模小、零碎等特点，所以要确保中国民众食品安全，提升抽样覆盖率是十分必需。假如使用传统检测方法，不管从时间上还是经费上全部无法满足食品抽检需求。所以，有必需研发和普及部分检测速度快、费用低、灵敏度高快检技术来愈加好地应对和控制食源性疾病爆发。检测技术现在，文件报道食源性致病菌快检技术有很多，比如：免疫学检测技术、代谢学检测技术、分子生物学检测技术、生物传感器检测技术等。不一样检测技术各有特点，不过能满足检测速度快、费用低、灵敏度高、操作简单等特点，并适适用于基层执法和检测需求技术关键为免疫学检测技术和分子生物学检测技术。其中，免疫学检测技术含有很好特异性、灵敏性，检测效率高、费用低，对人员要求较低且不需要大型仪器等特点，所以现在应用得最为广泛。不过免疫学检测技术也含有一定不足：比如当待测样品中含有目标物竞争性物质时，很可能会出现假阳性检测结果；免疫学检测对反应体系环境要求较高，错误选择试剂会直接造成检测失败等。伴随分子生物学技术飞速发展，现在已经能够实现在分子水平上对食源性致病菌判定。其中最为便捷、快速和适用广泛判定技术要数聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)。PCR技术起源于20世纪80年代，由美国Kary Mullis发明。PCR技术关键是在体外适宜条件下，以DNA(或RNA)为模板，以一对人工合成寡核苷酸为引物在耐热DNA聚合酶作用下特异性扩增目标DNA片段技术。整个反应由20-45个循环组成，每个循环均包含高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤。多年来，用PCR技术检测食品中食源性致病菌方法有很多个，如常规PCR、不对称PCR、免疫PCR、套式PCR、荧光实时定量PCR（qPCR）、多重PCR、逆转录PCR等。，范宏英等2利用多重PCR技术成功将沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、绿脓杆菌和副溶血弧菌5种饮用水不得检出致病菌同时快速检出。，程晓燕等3建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法，取得了很好实现效果。现在，基于Taqman探针荧光实时定量PCR检测技术已经被广泛应用于食品性致病菌检测中，并制订了对应检验标准。在新公布食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品（GB 2707-）等127项食品安全国家标准中，一样包含到了PCR及qPCR检测技术。所以，在前增菌和选择性增菌后，应用PCR技术能够对样品中是否含有食源性致病菌进行检测，这种检测技术优势在于检测效率高、特异性好和灵敏度高等。标准编号标准名称SN/T1059.7-进出口食品中沙门氏菌检测方法 实时荧光PCR法SN/T 1870-食品中致病菌检测方法 实时荧光PCR法SN/T 2415-进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法 实时荧光PCR法GB 4789.6-食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验GB 4789.12-食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验GB 4789.42-食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验表1. 基于PCR技术进行食品致病菌检测部分行标和国家标准伯乐处理方案美国伯乐（Bio-Rad）企业作为生命科学领域领先者，一直致力为众多科学家处理实际科研应用问题，提供全套处理方案。所推出iQ-Check全自动病原微生物检测系统，包含核酸提取及经过认证定量检测试剂盒、自动化工作站(可选)、定量PCR仪器和专业分析软件，仅需一步增菌，在8-二十四小时内取得结果，为致病菌快速、正确检测提供了最好处理方案，其具体特点以下：1) 检测项目：配套18种常见致病菌检测，包含：沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、产志贺毒素大肠杆菌、对O族大肠杆菌进行确定和判定（检测7个关键血清型：O157:H7，O111，O26，O103，O145，O45，O121）、单增李斯特氏菌、李斯特菌属、弯曲菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌、阪崎肠杆菌、军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母菌；其中军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母可进行定性和定量检测；对市面上其它厂家多种致病菌检测试剂盒兼容性好；2) 检测兼容性：多个致病菌和检测项目可同时同机进行；3) 检测性能：检测中含内标质控和阳性对照，内部质控指示没有假阴性反应，有效避免检测假阴性，全部检测项目全部为Taqman探针；4) 病原菌DNA提取：专利提取步骤最少提取100ul增菌液，无需离心，一步即可提取DNA，提取时间15分至30分钟。且可整合最新Free DNA去除处理方案，有效去除食品中死菌DNA干扰，尤其适合经过辐照、巴氏消毒处理或以噬菌体作为加工助剂等类型食品样本；5) 仪器开放性：此检测仪为开放性操作平台，厂家配置检测试剂盒在2-二十四小时检测目标菌；非厂家配置试剂检测时间可能会有所延长；6) 检测灵敏度：检测食品仅需一步增菌，检出限CFU/25g；7) 检测通量：94个样本加上2个对照；8) 定量PCR仪特点：6通道检测，配置触控屏，可单机操作；9) 定量PCR仪温度控制：含有动态温度梯度功效，能够同时运行8个不一样温度；10) 定量PCR仪温控正确度：0.2；温度均一性：0.4；11) 定量PCR仪最高升降温速率：2.5/秒；12) 认证认可：软件分析系统及试剂取得AOAC、AFNOR等中国、国际认证，结果自动判读：直接读取“有”或“无”结果；13) 扩展使用：除可用于致病菌检测外，本系统还可应用于核酸定量、基因表示水平分析、基因突变检测、GMO检测及产物特异性分析、流行病学试验等多个检测、研究领域；14) 数据分析：能够对病原微生物进行定性和定量检测，并可进行标准曲线绘制，并有汉字软件及无偿升级；15) 质控功效：每份测试试剂内均自带质控功效，仪器能直接确定每一份测试试剂质量 图1. Bio-Rad iQ-Check全自动病原微生物检测系统 图2. iQ-Check手动及自动病原微生物快速检测步骤Reference1 Bakthavathsalam P, Rajendran VK, Saran U, et al. Immunomagnetic nanoparticle based quantitative PCR for rapid detection of Salmonella J. Microchim Acta, , 180:1241-1248.2 范宏英, 吴清, 吴若菁, 等. 饮用水中5 种致病菌多重PCR技术检测研究J. 微生物学通报, , 32(3): 102-107.3 程晓燕, 刘庆慧, 黄捷. 实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法建立J. 安徽农业科学, , 38(26): 14265-14267.2、致病菌活菌定量检测背景介绍以前面我们知道，食源性致病菌检测对于食品安全检测关键性，而对于食品中活菌定量检测才能真实反应出该样品污染水平，所以怎样避免部分经过辐照、巴氏消毒等处理后样品中死菌干扰而仅定量检测活菌含量就显得至关关键。传统方法如分离培养法等不能满足快速检测目标，而现有致病菌基因检测方法如一般PCR、qPCR等常常无法有效识别食品中活菌和死菌，造成假阳性结果。所以开发快速、正确定量检测活菌方法很有必需。检测技术现在，研究者们利用活菌和死菌细胞膜完整性不一样，开发了EMA-qPCR/PCR和PMA-qPCR/PCR法。其中，叠氮溴化乙锭（EMA）和叠氮溴化丙锭（PMA）是一个结合能和DNA共价交联光敏材料，光照能够使EMA/PMA光敏基团转化为氮宾自由基，其能够和DNA发生共价交联，进而阻断DNA分子PCR扩增，而且这种染料只能选择性渗透死菌细胞膜，所以可被用于和PCR技术相结合定量检测活菌。不过有研究发觉，EMA含有细胞毒性，可进入部分活性细胞内影响检测结果，其应用受到限制，所以现在研究中更多采取无细胞毒性PMA染料结合qPCR法定量检测食品中活菌含量1,2。除了qPCR技术外，数字PCR技术（digital polymerase chain reaction，dPCR）是近两年来新兴生物分子检测技术，以一个全新方法进行核酸分子灵敏检测和绝对定量，和传统PCR、定量PCR相比，其结果正确度、正确性和灵敏度全部有大幅度提升，被称为“第三代PCR”技术，标志着PCR技术未来发展方向。伯乐处理方案：结合PMA处理微滴式数字PCR法美国伯乐企业作为数字PCR技术开拓者和领导者，开发和研制了最新型QX200微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)系统，其技术原理是可将核酸模板、引物/探针等组成荧光PCR反应体系均一等分为近2万份纳升级稳定“油包水”微滴(微反应单元)，等于将有限目标模板进行近似于无限稀释分开，在经过PCR扩增以后，含有模板微滴会检测到荧光信号，其它微滴无阳性信号。依据阳性液滴和液滴总数比值，可按泊松分布规律推算出反应液中目标模板浓度，实现核酸检测绝对定量。数字PCR技术以其正确性好、灵敏度高、无需任何外参校准物质、可对样品核酸进行绝对定量等优势，已经在临床诊疗、单细胞基因表示、环境微生物检测、二代测序结果验证和食品安全定量检测等方面得到了广泛研究和应用。图1. Bio-Rad QX200微滴式数字PCR系统商业化数字PCR仪出现，克服了研究者们各自研究工作中操作复杂、反复性差、通量低等困难，实现了自动化和高通量应用，从而深入推进和扩大了数字PCR技术发展和应用范围，在食品安全检测领域取得了广泛关注、引发了极大研究热情并已经取得了可喜结果。董莲华等3用ddPCR建立了大肠杆菌O157:H7定量检测方法，定量检测限为4 copies/20ul，定性检测限为3 copies/20ul。Rothrock等4将ddPCR和禽类加工行业现有常规两种检测方法qPCR和传统培养判定方法进行了比较，研究了在采取不一样取样时间和取样方法时这三种检测方法得到禽类加工设备中关键传染性致病微生物检测结果差异。结果表明，ddPCR能够从更早从样本中，也能够更多从不一样生产加工设备中检出病原菌特异性基因，且定量检测结果和传统病原菌培养判定检测方法一致。在食品致病菌活菌检测中，威海及山东出入境检验检疫局王静等5,6首次将PMA和ddPCR技术相结合，开发了高灵敏、高选择性检测食源性致病菌新方法。能够在死菌存在条件下定量检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌活菌，消除了“假阳性”结果出现，利用脱氧胆酸钠(SD)对样品预处理，使得PMA更轻易穿过死菌细胞膜。SD-PMA-ddPCR整个过程快速简便，成功检测鸡肉等样品中沙门氏菌及单核细胞增生李斯特氏菌含量(最低检出限为2 copies/20ul体系)。和基于qPCR方法相比，含有正确度高、灵敏度高、不需要建立标准曲线等优点。伯乐处理方案：iQ-Check Free DNA去除方案另外一个活菌检测处理方法就是前面提到iQ-Check食源性致病菌检测方案中采取死菌Free DNA去除方案，其原理是试剂盒中有一个可选择性识别游离DNA并将之降解酶，只需在裂解细胞提取DNA前用此酶和对应缓冲液于37处理样品15-30分钟即可极大消除死菌DNA干扰，随即加入裂解液可失活此酶，不影响后续活菌DNA提取。较之PMA处理法，该方法能够极大地简化操作，提升效率，且易于整合进iQ-Check病原微生物检测步骤中。采取此方法处理后平均可降低源自死菌游离DNA2-3个数量级(约6个Cq值)结果干扰，极大地降低了假阳性结果出现，为食源性致病菌活菌检测提供了便捷而有效处理路径。图2. iQ-Check Free DNA去除方案原理及步骤表1. 比较不一样含量李斯特死菌在经iQ-Check Free DNA去除处理前后检测结果差异Reference1 於颖,王文静,陆晔. PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌研究J. 检验医学, , 30(5): 500-506.2 徐义刚,李淑云,鞠文东,等. PMA结合定量PCR方法检测食品中活性志贺菌研究J. 黑龙江畜牧兽医, , 07: 206-208.3 董莲华, 张玲, 姜君, 等. 大肠杆菌 O157:H7 微滴数字 PCR 定量方法建立J. 分析化学, , 43(3): 319-324. 4 Rothrock M J, Hiett K L, Kiepper B H, et al. Quantification of Zoonotic Bacterial Pathogens within Commercial Poultry Processing Water Samples Using Droplet Digital PCRJ. Advances in Microbiology, , 03(05): 403-411.5 王静, 张慧敏, 魏玮, 等. SD-PMA-ddPCR检测食品中沙门氏菌研究 J. 食品工业科技, , 37(10): 67-71.6 王静, 刘玉敏, 李春喜, 等. SD-PMA-ddPCR检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌J. 微生物学通报, (10).3、致病菌溯源背景介绍由细菌、病毒、真菌等经过食物、环境接触等方法传输引发感染性疾病，是食源性疾病中最关键组成部分，每十二个月在全世界爆发食源性疾病中，由细菌等造成感染占90以上，严重影响、危害公众健康。而且，伴随全球贸易往来、旅游等活动日益频繁，该种感染常常展现出跨国家、跨地域、跨省市多地点、大范围爆发，成为一个世界范围内公共卫生问题。所以，在快速确定致病菌种类同时，立即对致病菌进行溯源分析是一项很迫切而关键任务。只有找到了致病菌起源，相关部门才能在源头上进行布署和控制，才能避免感染或中毒事件深入爆发和扩散。针对上述问题，美国CDC于1996年开始建立PulseNet系统并成功应用。该系统在暴发流行病识别、分析、预警和改善加强控制方法中发挥了关键作用。在美国毒菠菜事件中爆发大规模O157：H7型致病病菌感染，就是利用了PulseNet快速判定和溯源。美国PulseNet在-花生酱污染鼠伤寒沙门菌暴发疫情中，快速查明传染源，召回问题食品，有效控制疫情蔓延（1），PulseNet所以被列为二十一世纪公共卫生领域最具影响力创新之一，取得美国科技创新奖（2）。中国在9月正式开启了PulseNET China。在C群流脑暴发处理和猪链球菌感染暴发处理过程中，PulseNet China全部起到了很大作用。技术原理和试验步骤PulseNet系统利用标准化PFGE（Pulsed-Field Gel Electrophoresis脉冲场电泳）技术，在试验室即可得到某种菌株或其亚型分子分型图谱，比如大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弯曲杆菌和霍乱弧菌等，该图谱能够以图片形式上传和分享，经过图谱中显示差异条带和特异条带，就能够和PulseNET数据库中成千上万个类似图谱进行比对。经过分布在各地网络试验室实际检测结果，建立网络平台立即交流和比对数据，这么就能够对不一样时间、地点爆发疫情中得到不一样分离株同时进行分析，从而评定食源性传染病发生关联和调查和快速判定暴提议源(图1)。 图1，致病菌溯源分析示意图PFGE技术是用于分离大分子量DNA片段一个电泳方法。仪器交替改变电场方向，大片段DNA在凝胶中不停重新定向，DNA分子越大，重排所需要时间越长，DNA分子越小，所需时间越短，据此就能够按其大小分开（图2）。图2，脉冲场电泳原理示意图利用限制性核酸内切酶，将基因组DNA酶切成有限数目（1020）大分子量限制性片段以后，经过PFGE使这些限制性片段相互分离，形成电泳图谱。因为不一样菌株电泳图谱含有高度特异性，从而识别特异菌株。PFGE检测技术含有敏感、特异、分辨率高等特点，而且在试验操作中结果稳定、反复性好、已易于标准化，所以被称为细菌分子分型金标准，也是现在世界上最为成功推广技术。世界各国疾控系统在建立和使用PFGE技术过程中，绝大部分全部是使用BIO RAD企业脉冲场电泳设备和成像系统。CHEF Mapper XA 系统是市面上最优异脉冲场凝胶电泳系统，能够用在全部PFGE相关应用领域中。它将CHEF、PACE、DR、FIGE和AFGE多个技术结合在一起，还能够提供“多矢量”功效和“二次脉冲”程序，使我们研究全部片段大小范围DNA分子全部能得到最好分离。 PFGE试验步骤以下（图3）：菌株分离和接种。在试验前一天做好菌株平板培养，备用。制备小胶块Plug。挑取适量菌体，用细胞悬浮液进行悬浮，同提前配置好胶溶解在一起，利用模具进行灌胶，待胶凝固后，取出小胶块。细菌裂解。将小胶块放入提前配置好裂解液中，在摇床上进行细菌DNA裂解过程。胶块清洗。 利用灭菌水将胶块反复清洗。胶块内DNA酶切。选择特定内切酶，对胶块进行酶切。电泳。先将小胶块切成适宜大小后贴在电泳梳底端边缘，然后进行灌胶，胶凝固后将梳子拔出即可。在电泳设备上设置好电泳程序，将胶放入电泳槽，即可进行电泳试验。图像获取。电泳结束后利用成像设备对电泳结果进行拍照保留。利用数据分析软件进行胶图深入分析。图3，脉冲场电泳试验步骤电泳结束后，经过成像设备，我们能够得到检测样本胶图（图4左），将该胶图导入数据分析软件以后，能够同其它样本胶图进行分析比对，得到聚类分析结果（图4右），进行溯源分析，确定该次致病菌爆起源头。图4，脉冲场电泳试验步骤案例（1），黑龙江完达山药业刺五加注射液因为细菌污染，造成3人死亡，多人出现严重不良反应，PFGE方法在该起事件溯源调查中发挥了关键作用。（2），德国爆发了由肠出血性大肠杆菌O104:H4感染 “毒黄瓜”事件，后蔓延至16个国家，50人死亡，4000多人受感染，PFGE分型对该事件溯源分析提供了最可靠试验室证据。（3）10月，美国爆发“毒菠菜”事件，共有26个州199人感染，其中102例(51%)住院，31例(16%)发展为肾衰竭，3例死亡。经过PFGE方法最终确定“自然选择”食品企业袋装菠菜中O157：H7为此次大肠杆菌感染事件元凶。 Reference(1) Pezzoli L, Elson R, Little C et al., International outbreak of Salmonella Senftenberg in . Euro Surveill.;12(24):pii=3218. 31 July . (2) Lieftucht A, Reacher M. Case control study of Salmonella paratyphi B infection associated with travel to Alanya, Turkey: update. Euro Surveill. 1999;3(44):pii=1307.1 August . 4、动物源性成份分析背景介绍“动物源性成份”检测一直以来全部是检验检疫部门关键检测项目，直接关系到饲料安全、食品安全等公众健康热点问题。动物源性副产品因富含蛋白质、钙等营养成份而被应用于畜禽饲料中，但现有证据表明，在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或感染过痒病因子牛羊肉/肉骨粉后能够引发和传输疯牛病（BSE）,中国已经制订了多个对于动物源性饲料生产管理相关条例。另外，在食品领域，对于动物源成份检测也是必不可少。古有“挂羊头卖狗肉”，现在，食品掺假、肉类掺假等丑闻在世界范围内层出不穷，比如欧洲发生“马肉风波”震惊全球，而在中国，多种肉类造假新闻更是不绝于耳，屡见不鲜，“牛肉膏”制造假牛肉，鸭肉制成“涮羊肉和烤羊肉”，还有“假肉丸鱼丸”，遍布大小集贸市场、餐饮饭馆，乃至深受消费者信赖著名超市， “掺杂使假”可谓无孔不入。总而言之，对动物源性成份检测是关系到食品安全、民众健康关键检测项目，必需严加实施。依据目前实施国家标准、出入境检验检疫行业标准，利用PCR技术、电泳、成像系统，和荧光定量PCR系统，可实现食品及饲料中多个常见动物源性快速检测（如表1）。近些年，伴随技术不停更新，部分新检测方法如微滴式数字PCR技术也越来越多被应用于动物源成份检测项目中来，其检测结果及发表文件受到了多方关注，正逐步成为检验检疫部门 “新宠”。动物源性成份分析经典检测方法 关键优势：1. 操作简便，简单培训即可掌握2.日常使用成本较低3.开放平台，兼容性高性能要求：1. 能一次处理1-96个样品2. PCR每管反应体积可达0.2mL3. 支持不一样反应条件同时进行，可同时运行8个不一样温度4. 20分钟内可完成单次PCR扩增反应5. 凝胶成像系统含有足够分辨能力，CCD分辨率达1360 1024定性PCR法平台关键组成： 热循环扩增仪 电泳仪 凝胶成像系统 定性PCR法用于源性成份分析是现在最为常规检测技术，在现有国家标准体系统中是各类成份判定判别关键手段之一。该方法适用范围广，加上操作简便及成本较低特点，使得其在各级检测试验室中普遍使用。基于不一样物种成份含有各自独特核酸序列，一般PCR法能够轻松实现各类源性成份有没有定性分析，不过不能进行定量分析。 关键优势：1. 操作简便2.日常使用成本适中3.闭管设计，降低试验室污染可能性能要求：1. 能一次处理1-96个样品2. 开放平台，兼容性强3. 多个通道，能够满足多组引物同时检测4. 40分钟完成扩增全过程 在过去几年中，实时荧光定量PCR法发展快速，在现有国家标准体系中，也陆续有相关检测方法出台。该方法能够直接定量分析，和常规定性PCR法互为补充，共同满足源性成份分析检测需求。 实时荧光PCR方法能够在单台仪器上完成从PCR扩增到检测结果分析全过程，操作上愈加简便。Bio-Rad 实时荧光定量PCR 平台，提供全汉字操作软件，在操作上愈加符合中国用户使用习惯。仪器采取触摸屏设计，可在单机上完成各项操作而无需外置电脑。另外，该仪器性能稳定，即使搬运也无需额外校准，适适用于各类卫生应急事件快速响应。 微滴式数字PCR技术是近几年兴起第三代PCR检测技术。该平台原理是：将PCR反应液进行油包水微滴化处理，形成约2万个纳升级微滴，每个微滴里均可进行一个PCR反应，最终将全部微滴逐一经过检测器进行荧光信号检测，最终经过判定微滴阴阳性来判定样本浓度是多少拷贝。其试验步骤关键包含反应液配置、生成微滴、PCR、检测微滴、数据分析这多个步骤。 这种最新技术无需任何标准品就能够直接对样本进行定量分析，软件自动显示样本中某种动物源成份有多少个拷贝数，最低可检测单拷贝，对于含量极低样本一样能够稳定检出，且该方法对对样本质量及扩增效率要求不高。 性能要求：1. 能一次处理1-96个样品2. PCR每管反应体积可达0.2mL3. 支持不一样反应条件同时进行，可同时运行8个不一样温度4. 20分钟内可完成单次PCR扩增反应5. 凝胶成像系统含有足够分辨能力，CCD分辨率达1360 1024 关键优势：1.无需标准曲线，实现绝对定量2.实现超高灵敏度或高通量样品分析3.兼容 TaqMan 探针或 EvaGreen成功案例：德国根特大学科学家Floren等人将数字PCR技术用于动物源性成份定量检测。研究结果显示，将两种不一样动物基因组DNA根据不一样百分比进行混合后，利用微滴式数字PCR平台，质量百分比定量检测限和定性检测限分别能够达成0.01%和0.001%。上海出入境检验检疫局动植物和食品检验检疫技术中心潘良文主任试验室最近表文章中，采取微滴式数字PCR平台建立了一个新检测方法，利用该方法能够在肉制品重量(mg)、DNA重量(ng)及特定目标基因拷贝数(copies/ul)之间建立良好线性关系，进而检测肉类样品中猪肉和鸡肉正确重量及含量，并利用上述方法对超市中买到11种不一样肉制品其中鸡肉和猪肉百分比进行了实测，得到了很好结果。标准编号标准名称GB/T 0-饲料中牛羊源性成份定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法GB/T 21101-动物源性饲料中猪源性成份定性检测方法 PCR方法GB/T 21102-动物源性饲料中兔源性成份定性检测方法 实时荧光PCR方法GB/T 21103-动物源性饲料中哺乳动物源性成份定性检测方法 实时荧光PCR方法GB/T 21104-动物源性饲料中反刍动物源性成份(牛,羊,鹿)定性检测方法 PCR方法GB/T 21105-动物源性饲料中狗源性成份定性检测方法 PCR方法GB/T 21106-动物源性饲料中鹿源性成份定性检测方法 PCR方法GB/T 21107-动物源性饲料中马、驴源性成份定性检测方法 PCR方法GB/T 25165-明胶中牛、羊、猪源性成份定性检测方法 实时荧光PCR法SN/T 2051-食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成份检测方法_实时PCR法SN/T 2557-畜肉食品中牛成份定性检测方法 实时荧光PCR法SN/T 2978-动物源性产品中鸡源性成份PCR检测方法SN/T 3730.1-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第1部分:貂成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3730.2-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第2部分:狗成份检测实时荧光PCR法SN/T 3730.3-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第3部分:狐狸成份检测实时荧光PCR法SN/T 3730.4-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第4部分:驴成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3730.5-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第5部分:马成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3730.6-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第6部分:猫成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3730.7-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第7部分:水牛成份检测 实时荧PCR法SN/T 3730.8-食品及饲料中常见畜类品种判定方法 第8部分:猪成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3731.1-食品及饲料中常见禽类品种判定方法 第1部分:鹤鹑成份检测PCR法SN/T 3731.2-食品及饲料中常见禽类品种判定方法 第2部分:鹅成份检测PCR法SN/T 3731.3-食品及饲料中常见禽类品种判定方法 第3部分:鸽子成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3731.4-食品及饲料中常见禽类品种判定方法 第4部分:火鸡成份检测 实时荧光PCR法SN/T 3731.5-食品及饲料中常见禽类品种判定方法 第5部分:鸭成份检测 PCR法SN/T 3731.6-食品及饲料中常见禽类品种判定方法 第6部分:鹧鸪成份检测 实时荧光PCR法表1，动物源成份检测部分标准和方法Reference(1) C.Floren,Wiedemann,B.Brenig et al., species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR(ddPCR);Food Chemistry 173()1054-1058.(2) Y.Cai, X.Li, R. Lv et al., Quantitative Analysis of Pork and Chicken Products by Droplet Digital PCR;BioMed Research International Volum . 5、肉类及肉类制品中成份掺假和虚标背景介绍目前，对于研究者、消费者、食品工业和政策制订者而言，食品安全全部是一个热点问题，尤其是肉类掺假和成份虚标问题。“欧洲马肉事件”和“沃尔玛狐狸肉事件”等一系列肉类掺假事件为肉类安全敲响了警钟，成份虚标更是存在于高达20食品检测案例中（Ballin N Z et al., ）。食品安全是食品药品检验检测中心一项重中之重工作，所以怎样快速有效检测肉类掺假及成份虚标是需要处理首要任务。检测平台和技术路线现在，对肉类样品进行分子检测技术分为两大类：DNA分析和蛋白质分析。蛋白质分析关键有ELISA、LC等方法，不过因为灵敏度不高、操作复杂等特点其推广应用受到了很大限制；DNA分析关键有琼脂糖凝胶电泳分析（定性分析）、荧光定量PCR（qPCR）和近几年受到广泛关注数字PCR技术（dPCR）。本部分意在经过介绍以ELISA、qPCR和dPCR为基础搭建检测平台，为检测工作提供更多简便灵敏可选方案。 ELISA检测平台（适适用于全部肉类制品）检测背景：肉类成份判定方法较多，其中ELISA灵敏度相对较高，特异性好，而且操作相对简单，易于推广。本文意在建立通用ELISA检测平台以进行肉类成份判定。 检测平台：Cooked Meat Species Identification Kit (ELISA-TEK, Gainesville,FL)及判定物种相对应单克隆抗体。检测步骤：将100种生鲜肉类和熟食样品称取25 g在水中搅碎并进行搅拌，直到无块状物；将混合物100加热15 min，滤出不溶物后用kit和单克隆抗体进行检测。检测结果：检测试剂盒LOD为1。ELISA方法能够特异性判定多种肉类掺假成份。Bio-Rad处理方案：Bio-Rad提供xMARK、iMARK等不一样系列酶标仪产品，体型小巧，操作简单，同时含有强大数据分析能力，能够为日常ELISA工作提供更多帮助。另外，Bio-Rad同时提供Western Blotting全套V3处理方案，为蛋白质印迹研究提供简练便利、定量正确工作平台。 qPCR检测平台（以牛肉和猪肉为例）检测背景：常规检测肉类成份手段包含ELISA、PAGE和PAGIF等蛋白质分析技术，但因为肉类样品加热后蛋白质变性而难以检测出细微成份区分；本研究试图建立高效、灵敏qPCR检测平台，以作为试验室常规检测手段。检测平台：qPCR平台。牛肉检测以磷酸二酯酶基因（bosPDE）为检测位点，扩增子长度为104bp，猪肉检测以ryanodin gene中108bp片段（susRY）为检测位点。检测步骤：待检测样品用改良CTAB方法和蛋白酶K进行处理，最终溶解于50lTE Buffer中。分别以FAM标识susRY和bosPDE，进行qPCR检测。检测结果：两种检测体系LOD均达成了0.1%（w/w），超出绝大部分蛋白质分析法；当检测猪肉时，假如制品里含有超出1（w/w）土鸡肉时，会出现非特异性扩增，但其它情况特异性均很好，所以能够作为肉类成份常规检测手段。Bio-Rad处理方案：CFX96 Touch系列荧光定量PCR仪含有正确、快速、灵活三大优势，切实处理日常工作中核酸定量繁琐操作、性能不稳定等缺点。正确：长寿命LED光源和一体化检测器，寿命长，性能稳定，扫描模式无光程差。快速：快速升降温，支持fast PCR；即插即用，无需校正；温度梯度功效，快速优化试验条件；真正5通道(450-730nm)检测。 灵活：可实现多台仪器连接；真正单机运行，实时显示，可储存100个结果。 ddPCR检测平台 检测背景：现有荧光定量PCR方法用来做绝对定量，不过因为DNA扩增效率和扩增质量在对照和检测样品间存在差异，所以其应用受到很大限制。检测平台：本文件报道ddPCR以gDNAF2基因为标识，采取拷贝数百分比方法评定肉类及制品中物种成份。检测步骤：待测样品采取改良CATB方法及加热方法进行DNA提取，后续采取ddPCR对线粒体CYTB基因和基因组中F2基因分别进行ddPCR检测。检测结果：相比现有qPCR手段，ddPCR检测下限和定量下限分别达成0.001%和0.01%水平；之前物种判定方法通常以线粒体DNA上CYTB基因为标识，不过假如要定量分析物种成份，以线粒体为靶标往往会得出过高或过低结果（偏低70%至偏高160%），这是因为不一样组织细胞中线粒体拷贝数差异极大，而F2基因是更适宜检测靶点。检测背景：肉类检测中，qPCR因为其依靠于扩增效率及标准曲线特点应用受到了极大限制，本文件致力于发展利用数字PCR建立完整检测平台，以揭示ddPCR结果和成份含量之间关系。检测平台：ddPCR检测平台。猪肉检测是以Sus Scrofa