食品微生物学基础实验指导2010上课版.doc

中国农业大学自编教材

食品微生物学基础实验指导
（食品专业本、专科使用）

食品微生物教研组
2010.3

微生物学实验的目的与要求

微生物学实验是微生物学的重要组成部分，也是学习微生物学的一个重要环节。通过实验操作，可以加深和巩固对课堂讲授内容的理解。训练学生掌握最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；培养学生观察、思考、分析解决实际问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、爱护公物的良好作风。
为了上好微生物学实验课，并保证安全，实验时要注意如下事项：
1．为了保证实验室的整洁和实验的顺利进行，非必要的物品和书包，不得带入室内，实验时不得高声谈话和随意走动。
2．每次实验前要对实验内容进行充分预习，了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，并作合理安排。
3．实验中要认真观察，及时做好实验记录。对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
4．实验操作应严格按操作规程进行，万一遇有带菌物品洒漏、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
5．实验过程中，切勿使乙醚、丙酮、酒精等易燃药品接近火源，如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。
6．凡实验用过的菌种以及带有活菌的各种器皿，应先经高压灭菌后才能洗涤。制片上的活菌标本应先浸泡于3％来苏儿溶液或5％石炭酸溶液中，半小时以后再行洗刷。如系芽孢杆菌或有孢子的菌，则应适当延长浸泡时间。
7．实验中需进行培养的材料，应注明组别、名称及处理方法，实验完毕，应将仪器、用具等洗净，放好，做好桌面及地面的清洁工作。

实验目录

实验一 　培养基的制备、灭菌及无菌检测技术………………………（4）
（一）实验室内微生物的检测………………………………………（4）
（二）培养基的配制与灭菌…………………………………………（5）
实验二 微生物染色技术………………………………………………（9）
（一）细菌涂片及简单染色法………………………………………（9）
（二）革兰氏染色法…………………………………………………（11）
（三）细菌的特殊结构染色…………………………………………（13）
（四）生物显微镜的构造、使用和保养……………………………（15）
实验三 　微生物形态观察与接种技术…………………………………（19）
（一）细菌培养特征的观察…………………………………………（19）
（二）霉菌的形态观察………………………………………………（21）
（三）放线菌的形态观察……………………………………………（24）
（四）假丝酵母假菌丝的培养及观察………………………………（26）
（五）微生物的接种技术……………………………………………（27）
实验四 　食品中细菌总数及大肠菌群的检验…………………………（29）
附件一 染色液的配制…………………………………………………… (36)
附件二 教学用培养基…………………………………………………… (38)
附件三 常用试剂及溶液的配制 …………………………………………(41)
附录四 大肠菌群最可能数(MPN)检索表……………………………… （43）
实验一 培养基的配制、灭菌及无菌检测技术

（一）实验室内微生物的检测

一、目的和要求
微生物在自然界广泛存在，在实验室内亦不例外。由于其个体小，人们用肉眼看不到。只有通过微生物的大量繁殖形成微生物群体，即菌落，肉眼才能看到它们。
通过实验证明实验室内有各种微生物的存在，对微生物有初步的认识，并在今后的微生物学实验中注意无菌操作，防止杂菌污染，保证实验结果的可靠性。
二、实验材料
灭菌的牛肉膏蛋白胨培养皿、灭菌棉球、镊子、灭菌牙签、记号笔等
三、操作步骤
以3—5人为一组，取4—6个已倒好灭菌的牛肉膏蛋白胨培养皿，一皿对照不要打开盖，其余每人1皿，每组成员分别选择下列任何一种方法加以处理并在皿上写明班级、姓名、日期及处理方法。
(1)打开培养皿盖，在空气中暴露约10分钟，然后盖上皿盖。
(2)打开培养皿盖，用手指触摸培养基表面2—3个点，注意不要将培养基弄破，然后盖上皿盖。
(3)取自己的头发约5cm长3—5根打开皿盖用镊子放于培养基表面。然后盖上皿盖。
(4)用灭菌牙签取少量牙垢，打开皿盖涂于培养基表面，注意不要将培养基弄破，然后盖上皿盖。
(5)用灭菌棉球在实验台(或凳子)上擦两下，打开皿盖，在培养基表面轻轻涂抹，然后盖上皿盖。注意不要将培养基弄破。
(6)将接种的培养皿放入培养箱适温培养16-24小时。
四、结果观察
1、同组成员共同观察并记录结果，并与对照皿进行比较。
2、描述你处理的培养皿中长出的菌落，如形状、颜色、大小、边缘等特征
五、思考题
1、本组内不同处理的培养皿上的菌落是否相同，从本实验中得到了什么启示？
2、在今后的实验操作中要注意的问题是什么？
（二）培养基的配制与灭菌

一、实验目的
1．了解配制培养基的一般程序，掌握配制、分装培养基的方法
2．掌握高压蒸汽灭菌的原理及操作技术
二、实验材料及仪器
(一)药品
牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，可溶性淀粉，NaCl，KNO3，K2HPO4，MgSO4，FeSO4，琼脂。
(二)试剂
10％NaOH，l0％HCl。
(三)其它
托盘天平，电炉，硫酸纸，牛皮纸，线绳，棉花，纱布，石棉网、精密pH试纸，标签，烧杯，量简，玻棒，三角瓶，滴管，手提式灭菌锅。
三、实验原理
人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，叫培养基。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等，以提供微生物生命活动所需的能量、合成菌体和代谢产物的原料，及调节代谢活动的正常进行。培养基除了要满足所需要的各种营养条件外，还应保证微生物所需要的其它生活条件，如适宜的酸碱度和渗透压等。因此，配制培养基时，还应根据各种微生物的特点调节适宜的pH值。由于不同种类的微生物所需营养成分不尽相同，所以培养基种类很多。同时。即使是同一种微生物，由于实验目的不同，所采用的培养基的成分也不完全相同。根据培养基的使用、营养物来源以及物理状态，可以分成许多不同类型。本实验通过几种常用培养基的配制，掌握其一般配制方法。
为了保证培养微生物的纯净，需要对培养基进行灭菌。除特殊情况外，培养基的灭菌均采用高压蒸气灭菌法。此法是将待灭菌物品放在高压蒸气灭菌锅内，利用高压时水的沸点上升，从而造成蒸气温度升高，由此产生高温达到杀灭杂菌的目的。
用高压蒸气对培养基进行灭菌时必须根据培养基的种类、容器的大小及数量采用不同的温度及时间。一般少量分装的基础培养基通常为121℃15min灭菌。如盛装培养基的容器较大，则应适当增加其灭菌的温度和时间。含糖培养基，一般采用115℃20—30min灭菌，以免糖类因高热而分解。由于高压蒸气灭菌是通过提高蒸气压力而使其升高温度以杀死微生物，所以加压前应尽量排净锅内的空气。
四、方法步骤
培养基的种类很多，配制方法也不完全相同，但其基本程序和要求是大体相同的。一般培养基的配制程序如下
计算—称量——溶解定溶——调节pH值-加琼脂并溶解——过滤——分装——加塞——包扎——灭菌——摆斜面——无菌检查。
(一)计算
一般培养基配方用百分比或加入各种物质的质量或体积表示，配制前应先估计工作中需要培养基的数量，然后按比例计算各种物质的用量。
(二)称量
用托盘天平分别称取所需各药品。有些药品用量很小，不便称量(如某些培养基中使用的微量元素成分)，可先配制成较浓的溶液，然后按比例换算，再从中取出所需要的量，加入培养基中。
对牛肉膏、酵母膏等比较粘稠，不是粉状的原料，可先将玻棒和烧杯称重，再连同玻棒和烧杯—起称量原料。或者，在称量纸上称量后，连同称量纸一起投入水中，待原料溶解后将称量纸取出。
(三)溶解
先在容器内加入少于需要量的水；然后按配方上的顺序，依次投入各成分进行溶解。为避免生成沉淀造成营养损失，营养物质加入顺序应为先加缓冲化合物，然后是主要元素；再加入微量元素，最后加入维生素、生长因素等。最好是一种营养物溶解后再加入下一种成分。若各种成分均不会生成沉淀，可以一起加入。如有难溶物质可加热促使溶解。待全部成分完全溶解后，补足所需水量。
(四)调节pH值
先用精密pH试纸测定培养基原始pH值。然后根据配方要求以2mo1/L—2N HCl或2mol/L—2N NaOH进行调整。此时应用滴管逐滴加入酸或碱，边搅动边用精密pH试纸测pH值，直至符合要求为止。在调节过程中，尽量不要调得过酸或过碱，以免某些营养成分可能被破坏，并防止因反复调整而影响培养基的容量。
培养基经高压灭菌后，其pH值可降低0.1—0.2，故调节pH 时，应比实际需要的pH值高0.1—0.2,也有个别培养基在灭菌后pH值反而升高。
如果所培养的微生物对酸度的要求比较严格，其pH值可用酸度计测定。
(五)溶解琼脂
配制固体培养基时，需加入凝固剂琼脂。琼脂在水中溶化较慢且易沉淀于容器底部而烧焦。最好用夹层锅溶化琼脂。如果采用直接在火源上加热的方法，则应将液体培养基放在有石棉网的电炉上，待液体培养基煮沸后再加琼脂，并不断搅拌，以防琼脂沉淀，糊底烧焦。琼脂完全融化后，要加热水补足蒸发的水分。
(六)过滤 以四层纱布趁热过滤 。
(七)分装
根据需要将培养基分装于三角瓶或试管内。分装量视具体情况而定。通常：分装入试管中的固体培养基以管高的1／5为宜，灭菌后趁热摆斜面，斜面长度约为试管高度的1／2-1/3；分装入试管中的半固体培养基，一般以管高的1／3为宜，灭菌后直立冷却，凝固后为半固体深层琼脂；分装入试管中的液体培养基，以试管高度的1／4为宜；分装入三角瓶的培养基，以不超过三角瓶容积的1／2为限。
分装过程中，应注意勿使培养基粘到管口或瓶口上，以免粘污棉塞而导致杂菌污染。培养基的分装装置见图3。
见图 培养基的试管分装

1、漏斗；2、乳胶管；3、弹簧夹；4、玻璃管

(八)加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上加上棉塞，以过滤空气防止外界杂菌污染培养基或培养物，并保证容器内培养的需氧菌能够获得无菌空气。 棉塞松紧应适宜，不能过松或过紧。太松，通气好但过滤作用差，容易污染；太紧；过滤作用好，但影响通气。检查松紧的方法是：将棉塞提起；试管跟着被提起而不下滑，表明棉塞不松；将棉塞拔出，可听到有轻微的声音而不明显，表明棉塞不紧；
加塞时棉塞总长度的3／5应在管口或瓶口内，管口或瓶口外面的部分不要短于1cm，以便于无菌操作时用手拔取。做棉塞的棉花应采用纤维较长的普通棉花，医用脱脂棉易吸水变湿造成污染，一般不宜采用。若需通气培养对，如用摇床振荡培养，可用所谓通气塞，即用6—8层纱布，或在两层纱布间均匀的铺一层棉花，代替棉塞，以供给菌体更多的氧气进行生长或发酵。
(九)包扎
加塞后，再在棉塞外包一层防潮纸，以避免灭菌时棉塞被冷凝水沾湿，并防止接种前培养基水分散失或污染杂菌。然后用线绳捆扎并注明培养基名称，配制日期及组别。
(十)灭菌
培养基包扎完毕后应立即按其配方规定的条件灭菌。如当天不能灭菌者应放入冰箱内保存。
(1)向手提式灭菌锅的锅体内加水约3L。最好用蒸馏水或煮沸过的水，以减少水垢在锅内的积存。
(2)将待灭菌的培养基装到灭菌桶内，注意不可装得太挤，要留有适当的空隙以利蒸汽流通。
(3)将灭菌锅盖上的软管插入灭菌桶内壁的槽内；对角地、平衡地拧紧锅盖上的螺栓，切勿漏气。
(4)点燃热源(电炉、煤气均可)。
(5)让排气孔一直开启，直至有大量蒸汽从锅内排出时，可视为锅内空气巳排尽，再将排气阀关闭。锅内水沸腾，升温、升压。
(6)待压力、温度达到要求时，控制热源，使压力及温度都稳恒在这个水平上，并开始计算灭菌时间。
(7)达到规定的灭菌时间后，关闭热源，让灭菌锅自然降压冷却。
(8)待压力完全降至“0”时打开排气孔。不能过早打并排气孔以免锅内压力快速降低，而温度不能很快下降，致使培养基剧烈沸腾，沾污棉塞，甚至冲出容器，造成污染。
(9)打开灭菌锅盖，取出灭过菌的物品。
(10)将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。
(十一)摆斜面
灭菌后，固体培养基如需制成斜面，应趁热将试管上部垫于一根玻棒或木条上，使培养基斜面长度为试管长度的1／2。（见图）

1/2试管长

(十二)无菌检查
将灭过菌的培养基放入37℃恒温箱内培养过夜，无菌生长为合格培养基。
(十三)保存
暂不使用的无菌培养基，可在冰箱内或冷暗处保存，但不宜保存时间过久。
五、实验内容
分组分别制备牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、察氏培养基和高氏1号培养基各200mI，分装试管和三角瓶，灭菌后摆斜面。
六、实验报告
简述你所制备培养基的制备程序。
七、思考题
(1)在你制备的培养基中，何为碳源?，何为氮源?
(2)配制合成培养基加入微量元素时，最好用什么方法加入?天然培养基为什么不需另加微量元素？
(3)做过本次实验后，你有什么体会?你认为在配制培养基的各步操作中应注意些什么问题?

实验二 微生物的染色技术

（一）细菌涂片及简单染色法

一、目的和要求
1．掌握细菌涂片和染色的基本技术
2．掌握无菌操作技术
二、实验材料及仪器
(一)菌种
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
(二)染色液
吕氏美蓝染色液，石炭酸复红染色液，草酸铵结晶紫染色液。
(三)其它
显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，吸水纸，香柏油，玻璃缸，玻片搁架。
三、实验原理
细菌细胞微小且无色透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色剂使菌体着色，增加与背景的反差，才能在显微镜下观察菌体的个体形态和部分结构。因此，微生物染色是微生物学中的一项基本技术。由于细胞对染料的毛细现象、渗透、吸附、吸收等物理作用，以及细胞与染料之间离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而会有不同的染色反应。在一般情况下细菌菌体多带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其它染料一样是一种盐，电离后染料离子带正电，易与带负电的细菌结合而使细菌着色。生物染色常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、石炭酸复红、番红等。
简单染色法是只用一种染色剂对细胞进行染色。此法操作简便，适用于菌体的一般形态观察，但通常不能显示细胞构造，也不能鉴别细菌类别。
染色前必须将菌体涂布于载玻片上并进行固定，其目的是杀死细菌，并使菌体粘附在载玻片上，防止菌体被染色剂冲掉。此外还可增加菌体对染料的亲和力。
四、方法与步骤
(一)制备涂片
(1)涂片：取洁净无油载玻片一块，在其中央滴加一小滴无菌水，用接种环以无菌操作法从试管斜面取少许细菌培养物，在载玻片上的水滴中研开后涂成薄的菌膜(直径约1cm)。如是液体标本，直接用接种环挑取1—2环菌液，涂布于玻片上，制成薄的菌膜。
(2)干燥：将涂布的标本在室温中自然干燥。如需加速干燥，可在酒精灯火焰上方的热车气中加温干燥，但切勿在火焰上直接烘烤。
(3)固定：手执玻片一端，涂有菌膜的一面朝上，以其背面迅速通过火焰2—3次，略作加热，以玻片背面触及手背皮肤，以有热感但不觉烫为度。
(二)染色
(1)染色：将玻片水平放置在玻片架上，在涂片菌膜处滴加吕氏美蓝染液(或结晶紫，或石炭酸复红染液)，以完全覆盖菌膜为度，染色l一2min。
(2)水洗：染色后倾去玻片上的染液，手持洗瓶，用细小水流从玻片侧面冲洗，至流下的水基本无色为止。
(3)吸干：用滤纸覆盖在玻片上并轻轻按压，吸干水分。
(三)镜检
用油浸物镜观察染色标本。
五、实验结果
将观察结果记录于下表中。
细菌简单染色及形态观察记录
菌 种
使用染料
菌体颜色
菌体形态图
大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

六、思考题
(1)根据你的实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项?
(2)染色之前为什么要对菌体进行固定?

（二）革兰氏染色法
一、实验目的
1．了解革兰氏染色的机理
2．掌握革兰氏染色的方法
二、实验材料及仪器
(一)菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(二)试剂
革兰氏染色液、（草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95％乙醇、番红染色液）。
(三)其它
显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，香柏油，二甲苯，擦镜纸等。
三、实验原理
革兰氏染色法(Gram stdn)是丹麦医生Gram于1884年创立的。通过这一染色，可把几乎所有细菌分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(简写为G+、G-)两大类。因此它是细菌分类鉴定时的重要指标。又由于这两大类细菌在细胞结构、成分、生理、生化、遗传、免疫、生态及药物敏感性方面都呈现出明显的差异，因此任何细菌只要先通过简单的革兰氏染色，即可提供不少其它重要的生物学特征方面的信息。
革兰氏染色的方法是先用结晶紫对菌体细胞进行初染色，再用碘液进行媒染，然后用95％乙醇对被染色的细胞进行脱色。此时不同细菌的脱色反应不同，有的细菌能保持结晶紫—碘复合物的颜色而不被脱色，有的细菌则能被脱色。最后用一种颜色不同于初染色液的染料番红进行复染色，使被脱色的细胞染上不同于初染色液的颜色。能保持结晶紫—碘复合物而不被脱色的细菌，菌体呈紫色，为革兰氏阳性细菌(G+)；初染的颜色被酒精脱去，复染时着上番红颜色的细菌，菌体呈红色，为革兰氏阴性细菌(G-)。两类细菌对革兰氏染色的反应不同，是基于它们细胞壁特殊化学组分及结构基础上的一种物理原因。通过初染和媒染后，在细菌细胞膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高且其分子交联度高、结构紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖层网状结构中的孔径会因脱水而收缩变小，通透性降低，再加上它基本上不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘的复合物仍被阻留在细胞壁内而不被脱色；革兰氏阴性细菌因其壁薄，肽聚糖含量低且交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的脂类含量高，所以当乙醇把脂类溶解后，细胞壁上就会出现较大的缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞，因此通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时，再经番红复染，就使革兰氏阴性细菌成为红色，而革兰氏阳性细菌仍为紫色。
四、方法与步骤
(一)制片
制片方法与简单染色相同。
(二)染色
(1)初染：在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色约1—1.5min，然后用细小的水流从标本上端冲净残余染液(注意勿使水流直接冲洗涂菌处)，至流下的水无色为止。
(2)媒染：滴加路哥氏碘液覆盖菌膜，媒染约1—1.5min，然后用流水冲洗掉多余的碘液。用吸水纸吸干载片上的水分。
(3)脱色：倾斜玻片并衬以白色背景，流滴95％乙醇冲洗涂片，同时轻轻摇动载片使乙醇分布均匀，至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止脱色，并立即用水冲净乙醇。
这一步是染色成败的关键，必须严格掌握酒精脱色的程度。脱色过度，则阳性菌会被误认为阴性菌；脱色不足阴性菌也可被误认为阳性菌。
(4)复染：滴加番红染液，染色1—2min，水洗后用滤纸吸干水分。
(三)镜检
先用低倍镜，再用高倍镜和油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散存在的细胞的革兰氏染色反应为准，过于密集的细胞常呈假阳性。
五、实验内容
(1)将大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌分别做革兰氏染色。
(1) 制备大肠杆菌和枯草杆菌混合涂片，并做革兰氏染色，以进行对比。
六、实验结果
革兰氏染色结果记录
　大肠杆菌： 枯草杆菌： 金黄色葡萄球菌：

（三）细菌的特殊结构染色法
一、实验目的
1．了解特殊染色法的种类和用途
2．拿握几种常用的特殊染色方法
二、实验材科及仪器
(一)菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
普通变形杆菌(Proteus vulgaris)
圆褐固氮菌(Azotobacter chrooccom)
肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
(二)染色液
孔雀绿染色液，0.5％番红水溶液，黑色素溶液，鞭毛染色液等。
(三)其它
显微镜，载玻片，酒精灯，接种环，洗瓶，染色架，玻璃缸，纯甲醇等。
三、实验原理
(一)芽孢染色
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲和力不同的原理，用不同的染料先后对细菌进行染色，使芽孢和菌体呈现不同颜色以便于观察识别。芽孢壁厚而致密，透性低，着色、脱色都比较困难。因此当用一种弱碱性染料如孔雀绿，在加热的条件下进行染色时，染料可进入菌体也可进入芽孢内；水洗后，菌体被脱色，而芽孢内的染料不易透出故仍为绿色。当用复染液如番红对菌体进行复染色后，在显微镜下即可看到红色的菌体内包含有绿色的芽孢。
(二)荚膜染色
荚膜是包围在菌体细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分多为多糖类物质。荚膜不易着色，观察荚膜时多用负染色法或称背景染色法，即将菌体与背景分别染色，将不着色而透明的荚膜衬托出来，所以这种染色法又称为衬托染色法。荚膜很薄，容易收缩，故在制片时不用加热的方法进行固定。
(三)鞭毛染色
鞭毛是细菌的运动“器官”。细菌的鞭毛直径；般为0.01-- 0.02um，普通光学显微镜下不能直接观察。鞭毛染色法实际上是借助于媒染剂和染料的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，使鞭毛直径变粗，同时着色，才能在光学显微镜下看到。
四、方法与步骡
(一)芽孢染色
(1)用培养24h左右的斜面菌种作涂片、干燥、固定。
(2)滴加3—5滴孔雀绿染液于固定好的涂片上。
(3)用试管夹夹住载玻片，在火焰上方徐徐加热，保持染液冒蒸汽而不沸腾，切勿使染液蒸干，必要时应添加少许染液。从染液蒸汽开始计时，加热4—5min。也可以不加热，改用饱和孔雀绿溶液(约7.6％)染色10min。
(4)倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。
(5)用番红水溶液复染1min，水洗。
(6)待干燥后，置油镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
(二)荚膜染色
(1)在清洁无油的载玻片一端滴一滴无菌水，取少许培养到稳定期的斜面菌种于水滴中制成悬液。
(2)取一滴新配制的黑色素水溶液(也可用碳素墨水)与菌悬液混合后，取另一块载玻片作为推片，将推片平整的一端以30。角接触菌悬液，并顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干将涂片浸入纯甲醇中固定1min。
(3)取出涂片，滴加数滴番红染液冲去涂片上残余甲醇，并染色30s。以细水流适当冲洗，吸干后置油镜下观察，背景黑色，菌体红色，荚膜无色。
(三)鞭毛染色
(1)菌种的培养：进行鞭毛染色的菌种应先经活化，即用新配制的斜面连续移种2—3次后再使用。使用前将活化的菌种转接到新制各的琼脂斜面或半固体培养基平板上，培养10h左右，备用。
(2)制片：在载玻片一端滴一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许斜面菌苔，最好是从斜面底部的冷凝水中取菌，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片倾斜，使菌液从裁片上缓慢流到另一端，切勿用接种环牵引或涂布，然后平放晾干。
(3)染色：涂片干燥后滴加鞭毛染色液A液染色3—5min，用蒸馏水冲洗，将残水沥干或用B液冲去残水(注意一定要将A液冲净后再加B液，否则背景上沉积染料，影响观察)。洗净A液滴加B液后，将载玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，染色30—60s。用蒸馏水冲洗后自然干燥。 　　　　　　　　　　　　　
(4)镜检：镜检时如未见到鞭毛，应在整个涂片上多寻找几个视野，有时只在涂片上找到个别菌体带有鞭毛。菌体深褐色，鞭毛褐色。
注意事项：细菌鞭毛染色成功的关键主要决定于：
①菌种活化的情况，需连续移种几次；
②菌龄要合适，一般幼龄菌鞭毛着生好，不易脱落，容易染色；
③新鲜的染色液；
④要求载玻片干净且无划痕。鞭毛染色所用的载玻片的清洗方法是：
选择光滑无伤痕的载玻片，放在特制的玻片架上，将洗衣粉加蒸馏水煮沸后，滤纸过滤去渣。然后将架和玻片置于洗衣粉水中煮沸，冷却后取出，用清水洗净洗衣粉，再放入浓洗液中浸泡24h左右，取出，用清水洗净残酸。最后用蒸馏水洗净沥干水放入95％乙醇中浸泡取出玻片用火焰烧去残余乙醇，立即使用。如不立刻使用，可存放于干净的盒中或浸入50％乙醇中短期存放。在洗净的玻片上水滴应能均匀散开。
五、实验内容
(1)对枯草杆菌进行芽孢染色。
(2)对圆褐固氮菌进行荚膜染色。
(3)对普通变形杆菌进行鞭毛染色。
六、实验结果
绘图表示你所观察的细菌芽孢、荚膜和鞭毛。
七、思考题
(1)为什么用孔雀绿染色液加热染色中，要待玻片冷却后才能用水冲洗？
(2)为什么荚膜染色中用甲醇固定而不用加热固定？
(3)为什么鞭毛染色制片时不能涂布?

（四）显微镜的构造、使用和保养
一、目的和要求
由于微生物的个体小，必须借助于显微镜将其放大才能看清楚它们的形态，所以显微镜的使用是微生物学的基本操作，必须认真掌握。
1．了解显微镜的构造和性能
2．正确掌握显微镜的使用技术和保养方法
二、实验材料及仪器
(一)标本片
啤酒酵母(Saccharomyces cereuisiea)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
(二)仪器和药品
普通光学生物显微镜，镜头纸，香柏油，二甲苯等。
三、实验内容
(一)显微镜的结构与性能
普通光学生物显微镜由机械系统和光学系统组成(图1)。
1．机械系统
主要包括镜座、镜臂、镜筒、镜台、调焦装置和转换器。

图1 显微镜的构造
1、 接目镜；2．镜筒；3．物镜转换器，4．接物镜；5．载物台；6．聚光镜固定螺丝；7，虹彩光圈；8．聚光器升降螺旋9．反光镜，l0．镜座；11．粗调螺旋；12．微调螺旋13．镜臂；
(1)镜座：是显微镜的底座，用于支撑整个显微镜，座内装有反光镜或照明光源。
(2)镜臂：其作用是支撑镜筒。有固定式和活动式两种。活动式镜臂可改变角度。
(3)镜筒：是用金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。
(4)转换器：为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装有3—4个物镜，通过其旋转，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。
(5)镜台：又称载物台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一通光孔。有的载物台上装有两个金属压片，称为标本夹，用以固定标本；有的装有标本推进器，转动螺旋可使标本前后左右移动。有的推进器上带有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。
(6)调焦装置；包括粗动螺旋即粗调节器和微动螺旋即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，调节物镜和标本问的距离，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像
2．光学系统
主要包括物镜、目镜、聚光器和光源四个部件。
(1)物镜：安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如NA O.30；10×；160／0.17；16mm。其中“NA 0.30”表示物镜的数值孔径(Numerical Aperture，简写为NA)，“10×”表示物镜的放大倍数，“160／0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片的厚度，16mm表示焦距。
(2)目镜：装于镜筒上端，由两块透镜组成。目镜把物镜的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有5×、10×、16×等放大倍数，可根据需要选用。显微镜总的放大倍数是目镜与物镜放大倍数的乘积，但从提高分辨率的实际效果来看，还是选用放大倍数较高的物镜为好。
(3)聚光器：光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射在标本上，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器装在载物台下，由聚光镜和虹彩光圈组成。聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于l的聚光镜时需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到1.0。虹彩光圈由薄金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光器的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图象。
(4)光源：较新式的显微镜本身带有照明光源，通常是装在镜座内，通过按钮开关来控制。有的显微镜无照明光源则采用反光镜，反光镜是一个双面镜子，一面是平面镜，另一面是凹面镜，使用低倍镜时用平面反光镜；用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。
3．成像原理
(1)油浸系物镜的基本原理
微生物学研究用显微镜的物镜通常有：低倍物镜(16mm，10×)、高倍物镜(4mm，40一45×)、油浸物镜(1.8mm，95一l00×)；油浸物镜(简称油镜)上通常标有黑圈、白圈或红圈，也有的以“01”(01immersion)字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据所用目镜的放大倍数不同，可使被检物体放大1000—2000多倍。油镜的焦距和工作距离(标本在焦点上看得最清晰时，物镜与标本之间的距离)最短，光圈开得最大。因此，在使用油镜观察的倒立的虚像时，镜头距标本非常近，需特别小心。
使用时，油镜与其它物镜的不同是载玻片与物镜之间的介质不是空气而是香柏油，故称为油浸系物镜。香柏油的折射系数，n＝1.52，与玻璃的折射率相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系物镜，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，减低了视野的照明度。
使用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径。显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)一半的正弦与介质折射率的乘积，可用如下公式表示：
N.A＝N×sin(a)/2
因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈高，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时NA的理论限度为90。，Sin90。＝1，故以空气(n＝1)为介质时；数值孔径不能超过1；如以香柏油为介质时，则M增大，其数值孔径也随之增大。显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此物镜的数值孔径越大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大。因此，高分辨力就意味着小的可分辨距离，二者成反比。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。
能辨别两点之间的最小距离D=λ/2N.A 式中：λ为光波波长(平均0.55微米)
人们肉眼能感受的光波平均长度为0.55微米，假如数值孔径为0.65的高倍镜，它能辨别的两点之间的距离为0.42微米。而对相距不足0.42微米的两点则不能分辨。即使用放大倍数更大的目镜，使显微镜的总放大倍数增加也仍然不能分辨。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才能分辨。
例如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的最小距离为 D=0.55/(2×1.25)=0.22微米。因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍镜(NA＝0.65)和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0.42微米。
(二)显微镜的使用方法
(1)位置和姿势:用左手握镜臂，右手托住镜座，轻轻地从镜箱内取出显微镜，放在左胸前的实验台上。桌椅的高低要配合适当，工作人员的姿势要端正。
(2)调节光源：将低倍镜转到工作位置。上升聚光器至最高点，虹彩光圈完全打开，然后转动反光镜，至视野中得到均匀而明亮的照明为止。光源以采用自然光为宜，如果阴天或晚上可用电光源，使用时取下反光镜，放上一个聚光镜。
(3)低倍镜观察：将待检的标本片放在镜台上，用压片夹或推动器固定。逆时针旋转粗调节器，使镜台向上移动至标本片与物镜间距离约5mm处。然后边从目镜中观察边慢慢顺时针旋转粗调节器，使镜台缓缓下降至发现视野中的检视物时，改用细调节器对准焦距进行观察。观察不染色标本时光线宜弱，可将聚光器稍稍降低或将光圈缩小；观察染色标本时光线宜强，应将光圈开大，聚光器尽量升高。低倍镜的视野面积比高倍镜大，观察标本片时，宜先用低倍镜找到被检目标，将欲详细观察的部位移到视野中心，然后换用高倍镜。
(4)高倍镜观察：显微镜一般具有共焦性能，在低倍镜下看清晰的物体换用高倍镜后也基本上位于焦点附近，只要用细调节器稍微校正即可观察。同时将聚光器适当下降，并调节光圈，使被检物清晰可见。如观察需要，亦可换用油镜。
(5)油镜观察：滴加—滴香柏油于标本片上，转动转换器将油镜对入光路，从侧面观察；慢慢转动粗调节器，将镜头浸入油滴中，并几乎与标本相接触，但切不可压及标本，以免损坏镜头。然后从目镜中观察，并微微转动粗调节器使镜台下降，至视野中闪出模糊物像时，换用细调节器调节焦距至看清物像为止。
(6)收镜：观察完毕之后，将标本片取下，用镜头纸将镜头擦拭干净，用过油镜的应先用镜头纸将镜头上的香柏油擦去，再用镜头纸蘸二甲苯擦2—3次，最后再用镜头纸将二甲苯擦去。擦净之后，转动转换器，将物镜摆成八字形，转动