蛋白质分离纯化试题版教学内容.doc

蛋白质分离纯化试题版

精品资料
一、 已知某生物中一种蛋白质的分子量约为62000，请最大限度的分离纯化这种蛋白，根据下列要求写出具体的分离纯化方法。
（1） 利用溶解度差别进行分离
（2） 利用蛋白分子大小进行分离
（3） 根据不同的电荷进行分离
（4） 利用已制备对的抗体进行分离
（5） 蛋白质纯度坚定
答：（1）根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。
（2） 根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
（3）根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。
离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
（4）利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。

测定蛋白质纯度的5个方法

　　蛋白质分离纯化的最后一个步骤是鉴定蛋白质样品是否均匀一致。但从目的蛋白质中检测出少量污染蛋白质远非易事，这是由于污染蛋白质的量可能低于其分析方法的检测极限，当用一种方法检验蛋白质纯度时，可能有两个或者更多的蛋白质表现行为类似，这种类似的表现行为可能会得出本来是混合物的样品却被认为是均一的错误结论。因此，只用一种方法作为蛋白质纯度检验的标准不很可靠，纯度鉴定应采用多种分析方法，从不同角度测定蛋白质样品的均一性。下面是几种鉴定纯度的方法。

1 电泳法

电泳法是蛋白质纯度鉴定最常用的方法。如果样品在凝胶电脓上显示一条区带，说明样品在其荷质比方面是均一的，可作为纯度鉴定酌一个指标。如果在不同PH下电泳，出现一条区带，说明样品的分子旦是均一的，因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。
2 通过层析性质的检测

　　当样品用线性梯度离子交换层折或分子筛层析分离时，若得到的组分是均一的，则各分织组分的比活力应当恒定。因此，可以通过层析组分具有相同的比活力，判定样品的层析性质是均一的。

3 免疫化学法

免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫分析等都是鉴定蛋白质纯度的有效方法。特别是放射免疫分析法发展迅速、应用广泛、几乎普及于生物体内各种微量成分的测定、灵敏度很高，但缺点是需要一定的设备。
4 蛋白质化学结构分析法

　　随着蛋白质分析技术的改进，末端基团的测定方法等也逐渐用于蛋白质纯度的鉴定。对于一个纯蛋白质来说，通过N一末端的定量分析可以发现，每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的N末端氨基酸。少量其它末端基的存在，常常表示存在着杂质。如果只是定性地测定N末端，那么此法就只适用于仅有一个脸镊的蛋白质。

　　5 超速离心沉降分析法

　　凝胶电泳可检测出占主要成分1%的杂质，但有些样品不适于用电泳法分析。例如，脂蛋白和其膜束缚的蛋白质的电泳行为异常，而且其结构酌完整性需在去污剂存在下才能保持。这时最好用超速离心法。在离心管中若出现明显的分界线，或者分部取出离心管中的样品，管号对样品浓度作田，若组分的分布是对称的，则表明样品是均一的。此法的优点是时间短，用旦少，缺点是灵敏度较差，微量杂质难以捡出。

　　总而言之，检验纯度的最常用方法是电泳法。然后才是其它方法。如果对样品纯度的要求越高，则用来检验纯度的方法应当越多，而且对所得到的数据的解释超应当小心谨慎。
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