草地贪夜蛾及二化螟肠道微生物多样性.pdf
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1、丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌丌保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报
2、保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报保山学院学报
3、保山学院学报保山学院学报草地贪夜蛾及二化螟肠道微生物多样性魏富雪1王有慧2柳青1陈文华1(1.保山学院 资源环境学院,云南 保山 678000;2.西南林业大学 生物多样性保护学院,云南 昆明 650224)摘要 采用高通量DNA测序技术以及微生物群落分析方法,对怒江下游蒲缥坝草地贪夜蛾、二化螟两种害虫肠道的微生物进行了研究。研究结果显示:单从菌群的Alpha多样性来看,两种昆虫肠道内微生物在物种数和均匀度方面基本相当;两组样本菌群在群落结构方面虽然存在差异,但不显著;在两组样本共有且相对丰度较高的10个属中,草地贪夜蛾中肠球菌属(Enterococcus)明显高于二化螟;而在二化螟中克雷伯氏
4、菌属(Klebsiella)和气单胞菌属(Aeromonas)的丰度明显高于草地贪夜蛾。关键词 怒江;草地贪夜蛾;二化螟;肠道微生物中图分类号 Q5文献标识码 Adoi:10.3969/j.issn.1674-9340.2024.02.003文章编号 1674-9340(2024)02-0013-05收稿日期:2024-01-02基金项目:保山学院校级科研项目“草地贪夜蛾对不同玉米选择性的化学驱动机制研究”(项目编号:ZKJC202102);云南省重大科技专项计划项目(项目编号:202102AA310055);怒江下游山地农业生态系统云南省野外科学观测研究站(项目编号:202305AM3400
5、31);云南省高校滇西昆虫资源保护与利用重点实验室建设项目(云教发201957号)。第一作者简介:魏富雪(1998),女,云南昭通人,学士,研究方向为生物学。通信作者:陈文华(1982),男,云南腾冲人,博士,副教授,研究方向为生态学。昆虫肠道内分布着物种丰富,数量庞大的微生物,这些微生物通过长期与宿主共生、协同进化的关系,在昆虫生长发育、协调消化,提供营养物质、抵抗病原物和降解毒素等方面发挥着重要作用1。另外,昆虫肠道微生物的群落结构和代谢活动能够赋予植食性昆虫与寄主植物特异性关系2,这为利用共生微生物控制害虫的理论与实践提供了基础3。近年来,随着大规模测序技术的快速发展,越来越多的学者开始
6、运用16S rRNA测序和宏基因组测序技术研究害虫肠道微生物4。以农、林害虫居多的鳞翅目昆虫也成为相关研究关注的焦点5-6。鳞翅目夜蛾科草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda与螟蛾科二化螟Chilo suppressalis是我国危害禾本科作物的重要害虫。这两种害虫具有杂食性,适应能力强、寄主范围广的特点,可危害玉米、水稻、高粱等重要粮食作物。但从取食偏好来看,草地贪夜蛾偏好玉米7,而二化螟更爱取食水稻8。草地贪夜蛾于2019年首次入侵我国云南省普洱市江城县,后逐步扩散蔓延,造成严重危害,国内学者对其生物学特性、生理生化、防控策略等进行了大量研究9-10。其中,基于害虫肠道微生物
7、群落的研究为该类害虫的绿色防控提供了新途径。Jones等(2019)认为寄主植物是形成肠道微生物群的主要驱动因素11。刘莹等(2021)发现来自不同虫源地的草地贪夜蛾肠道微生物群落具有较高的分异性12。本研究以怒江下游蒲缥坝草地贪夜蛾和二化螟为研究对象,通过宏基因组测序对两种生活环境相似、食性相似害虫的肠道微生物群落组成进行了比较,为利用肠道微生物进行害虫绿色防治提供科学数据。第 43 卷第 2 期保山学院学报2024 年 4 月1 材料与方法1.1 样本收集与预处理样本采集地点选取为云南省保山市隆阳区蒲缥镇何家寨(表1),2022年8月分别采集玉米地草地贪夜蛾(下文中简称SF)幼虫和水稻田二
8、化螟(下文中简称CS)幼虫若干。表1 供试样本草地贪夜蛾和二化螟采集信息样品种类草地贪夜蛾二化螟采集时间2022-8-132022-8-22采集地点云南省保山市隆阳区蒲缥镇何家寨云南省保山市隆阳区蒲缥镇何家寨经纬度99234E;245842N99236E;245830N海拔(m)1353.91397.2待测昆虫处理:选取野外采集的草地贪夜蛾6龄幼虫、二化螟3龄幼虫各30头,分置于60个培养皿中,于常温下饥饿处理24 h。待测昆虫肠道解剖:在无菌工作台上对虫体进行解剖。首先用70%酒精对虫体进行体表消毒2次,每次60 s,再将虫体完全浸泡在无菌水中去除表面残留的酒精。将洗净的幼虫转入已灭菌的解剖
9、蜡盘,解剖取出其肠道置于1.5 mL灭菌离心管中,立即用封口胶封口放入液氮保存。两种昆虫各解剖30头,每10头混合放入一个离心管,进行编号,在-80条件下冷冻保存。1.2 DNA提取及测序基因组DNA提取参考前人的研究经验13,使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取肠道细菌总DNA,使用Nanodrop检测OD260/OD280比值,选取的比值应在1.8-2.0。经琼脂糖凝胶电泳检测质检合格后的DNA样本,使用NEB建库试剂盒(NEBNext MLtraTMDNA Library Prep Kitfor Illumina,NEB#7370)进行文库构建。构建好的文库用质检试剂盒DNA 10
10、00 assay Kit(Agilent Technologies公司,产地Lithuania)进行库检,合格后,经ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(life Technologies)定量,根据Hiseq2500的PE150模式Pooling上机测序。测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。对测序得到的raw data进行质控和过滤,剔除来源于宿主的reads,得到有效序列,获得质控拼接后的优化数据。最后使用序列降噪方法(DADA2/Deblur等)处理优化数据,获得操作分类单元(OTU)代表序列。1.3 统计分析用软件QIIME对优质序列在95%水平上
11、进行OTU聚类,并利用Silva和UNITE数据库分别对两种昆虫肠道细菌16S rRNA和真菌ITS序列进行物种注释。基于OUT丰度统计结果,进行群落多样性及物种差异分析。本研究选取Chao1、Ace、Simpson、Shannon等指数14来分析草地贪夜蛾和二化螟肠道微生物多样性。其中Chao1和Ace指数反映物种丰富度,二者值越大,表明样品中物种数目越多,丰富度越高;Simpson和Shannon指数反映样本内物种丰富度与均匀度,数值越大代表物种多样性越高。微生物群落分析使用R软件(版本4.3.1)“vegan”包进行计算。2 结果与分析2.1 物种多样性基于95%一致性和90%覆盖度对所
12、预测基因进行分析,SF肠道注释获得18门、33纲、51目、69科、84属122种微生物;CS肠道共注释获得20门、37纲、58目、74科、97属166种微生物。采用Wilcoxon秩和检验对两组样本菌群4项Alpha多样性指数进行比较,未发现显著差异(P值0.1-0.7,均大于0.05),说明两种昆虫肠道内微生物在物种种数和均匀度方面基本相当。为进一步研究两组样本微生物差异,基于属水平丰度,Bray-curtis距离做非度量多维标度(NMDS)分析。结果如图1(a)所示,图中点代表样本,点之间的距离越大表示差异越大。可见SF和CS组内样本不太集中,显示组内菌群有一定差异,而且两组样本中有部分距
13、离较近,说明这部-14魏富雪,王有慧,柳青,陈文华:草地贪夜蛾及二化螟肠道微生物多样性分样本相似度较高。通过Anosim分析对比组间与组内差异,结果(图1b)显示Anosim统计量R=0.410,表明组间差异大于组内差异,但不显著(P=0.2 0.05)。图1 SF和CS幼虫肠道微生物的NMDS(a)和Anosim分析(b)2.2 域水平的群落组成通过与NCBI数据库比对,在草地贪夜蛾(SF)和二化螟(CS)肠道中注释到细菌(Bacteria)、真菌(Fungi)、病毒(Viruses)、真核生物(Eukaryota)以及古生菌(Archaea)。其中细菌的相对丰度最高,在SF样本中平均达87
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