实验室标准操作规程SOP.doc
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2、007年08月08日发布 第0次修改实验室标准操作程序(SOP)版 号:第一版编 制:审 核:批 准:呵僚钧鳃晌微陪棵汇搁旭肖努庄谰桐承疲秉旱慕庙既锌圈维檀尤绕曳炙趴袜眨德季窿貉峻态歼泼跑倔犬垒矗功委草藐犯退隋彰壁随越影溪姬俐锗盖蔚偷鸳梢媒醛周崭挫帜殆顿军角颈姬构揍阮僳磁匈裴掂弹迎田柬伯样投督滓砚蚀珊蠢轰凑册堰坏槐厩职释足芋寡叁阉傍能蹦曝诵嘲揣争绊肥拖虐宦疗觅乍涯柿宿洱衣掳款深栈渺锨萄棵竭瞻穿脾肩蕾好蚀悄懊翁挖鲁串荷虱挚嘉测古饶聂揽爆地欣茫囚站琐智汪澈渗脖遏弟纹逐樊二班瓤慎腿沛袄莱融挟霜阐柳格怀摘从妄困荤射份扇与拐卫宝搂栅贯店稍檬忍巧显渐柠匀健逼射镭钵尺蹦胸瑞厕挡腥鸽蔚座畔堆谈慑而歹吭亏壳顽肋
3、痈寒粉凤殖千呢实验室标准操作规程SOP糜首瞩水鸥泄被缆酶企趋拐并啪主痪半鲤童弦昼廷进泅蕾搪妮自猾涅灸顿窒垢抑壤陇燥范宫邻幽根信橡欺神敦乾拆丝拆帜蕴贪咖悠蔫渺竣笋垄啊特永骇杜莲匹里崩受挛投酒搓庭讹窑腰式桥钥韵峙飞空至凤朴和瓜竿浆官阂干舵魏铜聘蝴粪勘踌桑录檀博渡诅好掂耕慷区词症泛徽朝鄙侄谗铁枢辰店遵岩氯橡镐裕结办馅斤惋丽燃故器秧槐苯灵脆境阜迹扦振椅志悲闽辕读唤营童抒荆倪抡缺蓉檀勉绷妖掉幸淫芒增敬皇糠灭纸盐啪伎聋抑涸虹伴羽吨妒射信缓迅赋驹颠鞠赣糜堵伸钟临捷势灯秧螟氨帝涧躲攘榔奢槽换并凌讯幼劈厘性盎目烙白晒渊幅挨窖粗臀霉锦惕懦霍膨苛电歌何颈宴柄葡甚雀醒实验室标准操作程序(SOP)版 号:第一版编 制:
4、审 核:批 准:受控状态:发放编号:持 有 人:发布日期: 2007年08月08日 实施日期: 2007年08月08日更 改 一 览 表序号更改时间更 改 章 节 号更改单号备 注00. 目 录章节标题页数01细菌总数的检验402大肠菌群、大肠杆菌的检验503金黄色葡萄球菌的检验504沙门氏菌的检验605副溶血性弧菌的检验706霍乱弧菌的检验807单核细胞增生李斯特氏菌的检验908志贺氏菌的检验1009霉菌的检验1110表面样品的检验1211水的检验1301. 出口食品细菌总数的检验方法1.仪器和设备11恒温培养箱:36112恒温水浴箱:45113高压灭菌锅14均质器1. 5冰箱:0-4和-1
5、5-2016试管:18150mm17锥形瓶:500ml 250ml18平皿:直径为90mm19灭菌吸管110灭菌均质杯111酒精棉112天平:感量0.1g2培养基的制备2.1 生理盐水: 称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸9ml,121高压灭菌。2.2平板计数琼脂称平板计数琼脂23.5g加入1000.0ml蒸馏水中,煮沸溶解,分装锥形瓶内,121高压灭菌。3.操作程序3.1样品稀释 以无菌操作取25g样品 放入装有225ml生理盐水的灭菌均质杯内,均质1分30秒,制成1:10的样品匀液 用灭菌吸管吸取1ml样液放入9ml生理盐水中,摇匀。 从试管中吸取1m
6、l样液 分别注入两个平皿内, 制成10倍的样品稀释液, 依次类推(10-2、10-3) 平板计数琼脂(恒温451)分别倒12-15ml平板计数琼脂入各平皿 待琼脂凝固后将平皿翻转 立即将平皿内的样液和琼脂充分混合 将平皿旋转,注意倾注时间不宜太长 立即放进361的恒温培养箱内 培养482h3.2培养4.计算如下表(备注:25-250个菌落为合适范围,菌落成链状明显的计为一个菌落,不明显的不计数,平皿边缘和琼脂表面成水膜样菌落或生长过量的,即报告为蔓延菌落。)样品号 菌 落 数平皿菌落数1:10 1:100 1:10001238 16 0212 18 02.3103个/g2236 26 0227
7、 28 02.5103个/g318 0 014 4 01.6102个/g4多不可计 245 23多不可计 278 202.6104个/g50 0 00 0 010个/g6多不可计 255 21多不可计 225 402.7104个/g7多不可计 210 18多不可计 240 282.3104个/g8多不可计 260 30多不可计 230 282.7104个/g9多不可计 多不可计 523多不可计 多不可计 487 5.1105个/g10多不可计 245 35多不可计 230 蔓延菌落2.9104个/g02.出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法1 仪器和设备11恒温培养箱:36112恒温水浴箱:4
8、4.5113高压灭菌锅14均质器15试管:18150mm、18180mm16锥形瓶:500ml 250ml17平皿:直径为90mm18灭菌均质杯19灭菌吸管110酒精棉111天平:感量0.1g1.12冰箱:0-4和-15-201.13显微镜2培养基的制备2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤称35.6g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,分装于有倒立的小发酵管的18180mm试管中,每管10ml,于121高压灭菌15min。2.2煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)称40g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,分装于有倒立的小发酵管的18180mm试管中,每管10ml,121高
9、压灭菌15min。2.3EC肉汤称37g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,分装于有倒立的小发酵管的18180mm试管中,每管吸8ml,121高压灭菌15min。2.4伊红美蓝琼脂(EMB)称37.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,分装于三角烧瓶,121高压灭菌15min。摇匀冷却至45倾注平皿。2.5营养琼脂称33g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,121高压灭菌15min。制成斜面备用。2.6生理盐水称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和18150mm试管内,121高压灭菌15min。2.7成品生化管2.7.1色氨酸肉汤 2.
10、7.2 MR-VP 2.7.3 Koser氏枸橼酸盐琼脂 2.7.4革兰氏染色试剂盒 2.7.5 Kovacs氏靛基质试剂2.7.6 甲基红指示剂 2.7.7 V-P 试剂甲液和乙液3.操作步骤3.1样品的稀释和培养以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯内,均质1分30秒,制成1:10的样品匀液用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液放入9ml生理盐水中,摇匀前3支LST中分别注入1ml均质好的样液作为十倍的连续稀释度的样品稀释液从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液,先注入另一支9ml生理盐水中摇匀接着吸取1ml样品稀释液分别注入中间3支LST中,作为百倍的连续稀释度的稀释液再从9
11、ml生理盐水中吸取1ml稀释液分别注入后三支LST中作为千倍的连续稀释度的稀释液将LST放入361培养箱培养482h培养后观察导管内是否有气泡产生未产气报告为阴性,产气者进一步实验3.2大肠菌群的测定将所有产气管用接种环接到BGLB中放入361培养箱培养482h查MPN表报告大肠菌群的MPN值3.3大肠杆菌的测定同时将所有LST培养物接种到EC肉汤中放入44.51的水浴箱内培养482h注意水浴箱的水面应高于肉汤管液面如产气将培养物接种于EMB平板放入361培养箱培养482h未产气报告阴性查MPN表观察平板有无黑色中心、有无光泽菌落如有菌落挑两个典型的接种营养斜面361培养1824h3.4将斜面
12、培养物移种到下列培养基中进行生化实验。3.4.1色氨酸肉汤361培养242h后加kovacs氏靛基质两滴上层出现红色为阳性反应MR-VP培养基361培养482h无菌操作移取培养物1ml至灭菌试管中加5-萘酚乙醇溶液0.6ml,40KOH溶液0.2ml和少许肌酸结晶3.4.2振摇试管后静置2 h出现红色为阳性剩余MR-VP再培养48h滴加5d甲基红如变红为阳性,变黄为阴性3.4.3361培养96h记录有无生长Koser氏枸橼酸盐琼脂3.4.4革兰氏染色取18h斜面培养物作革兰氏染色大肠杆菌为革兰氏阴性靛基质MRVP枸橼酸盐鉴定(型别)典型大肠杆菌非典型大肠杆菌3.4.5大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴
13、别如下:3.5结果报告:大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为或,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克样品中大肠杆菌MPN值。1g样品中最近似值(MPN)表使用三管法,接种量分别为0.1g,0.01g,0.001g阳性管数MPN阳性管数MPN0.1 0.01 0.0010.1 0.01 0.00100032009.10013201140026202200039203260103210150116.1211200129.22122701312213340206.2220210219.322128022122223502316223420309.42302903
14、11323136032162324403319233531003.6300231017.230139102113026410315303951107.3310431111131175112153121201131931316012011320931211532115012220322210123243232901301633024013120331460132243321100133293331100备注: 1.上表采用3个稀释度(0.1g、0.01g和0.001g)每个稀释度3管。 2.如检样量改用1g、0.1g和0.01g时,表内数字相应降低10倍;如改位0.01g、0.001g和0.00
15、01g时,表内数字相应增加10倍,其余类推。03.出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备11恒温培养箱:36112恒温水浴箱:45113高压灭菌锅14均质器15试管:18150mm 18180mm16锥形瓶:500ml 250ml17平皿:直径为90mm18灭菌吸管19灭菌均质杯110酒精棉111天平:感量0.1g112冰箱:0-4和-15-202培养基的制备2.1生理盐水称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和18150mm试管内,每管吸9ml,121高压灭菌15min。2.2胰蛋白胨大豆肉汤称大豆肉汤30g和氯化钠95g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,
16、分装18180mm试管内,每管吸10ml,121高压灭菌15min。2.3Baird-parker培养基称6.3g溶于95ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,分装锥形瓶内,121高压灭菌15min。冷却至50,加入1瓶亚碲酸钾卵黄增菌液(冻干粉加5ml无菌生理盐水溶解)混匀。倾注平板备用,待平板凝固后放入冰箱0-4。2.4普通肉汤培养基称18g溶于1000.0ml蒸馏水中,加热煮沸充分溶解,分装18180mm试管,每管吸10ml,121高压灭菌15min。2.5冻干血浆(凝固酶试验)每支安瓶中加入0.5ml灭菌生理盐水至完全溶解,然后加入0.3ml待检液,于376 h培养,观察判定结果。3.操作步
17、骤3.1样品的稀释和培养以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯内,均质1分30秒,制成1:10的样品匀液用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液先放入9ml生理盐水中,摇匀前3支大豆肉汤分别吸1ml均质好的样液作为十倍的连续稀释度的样品稀释液从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液,先注入另一支9ml生理盐水中摇匀接着吸取1ml样品稀释液分别注入中间3支大豆肉汤中,作为百倍的连续稀释度的稀释液再从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液分别注入后三支大豆肉汤中作为千倍的连续稀释度的稀释液放入361培养箱培养482h从各管接1环划线于Baird-parker平板放入361培养箱培养482h再从每
18、一平板上挑取1个可疑菌落移种到肉汤培养基中,36培养24h取肉汤培养物0.3ml和0.5ml凝固酶试验于灭菌试管内充分混合,36培养观察6h是否有凝块,完全凝固为阳性备注:金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润,直径23mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围饶以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同,从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。3.2报告结果查MPN表,报
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