生物化学技术6凝胶过滤11市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第六章第六章 凝凝 胶胶 过过 滤滤第1页 凝胶过滤是凝胶过滤是20C-60Y20C-60Y发展起来一个分离纯化方法；发展起来一个分离纯化方法；又称分子筛层析、排阻层析又称分子筛层析、排阻层析原理：原理：凝胶含有网状结构，小分子物质能进入其凝胶含有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质量不一样进行筛分溶液中各种组分按分子质量不一样进行筛分特点：特点：设备设备简单，操作方便、重复性好、回收率简单，操作方便、重复性好、回收率高高用途：用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，测定蛋白质分子质量、样品浓缩和脱盐等测定蛋白质分子质量、样品浓缩和脱盐等 第2页目目 n掌握凝胶分类和性质掌握凝胶分类和性质n掌握凝胶过滤基本原理掌握凝胶过滤基本原理n熟悉凝胶过滤操作与应用熟悉凝胶过滤操作与应用第3页第一节第一节 凝胶分类及性质凝胶分类及性质 第4页 凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和很凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和很好分子筛作用化合物好分子筛作用化合物 当前主要有当前主要有葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、天然琼脂糖天然琼脂糖和和交联琼脂糖交联琼脂糖；其次，还有其次，还有聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）、（生物胶）、交联葡聚糖交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及，以及交联琼脂糖与葡聚糖共交联琼脂糖与葡聚糖共价结合凝胶价结合凝胶等等第5页第6页第7页商商品品名名称称：Sephadex，由由葡葡聚聚糖糖右右旋旋糖糖酐酐(G型型)和和3-氯氯-1，2环氧丙烷环氧丙烷(交联剂交联剂)以醚键交联而成以醚键交联而成 在在交交联联葡葡聚聚糖糖G-25、G-50中中加加入入羟羟丙丙基基后后，即即可可组组成成烷烷基化（基化（LH型）葡聚糖凝胶型）葡聚糖凝胶 一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶第8页第9页性状：性状：外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为网状网状皱纹皱纹溶溶解解性性：带带有有大大量量羟羟基基，亲亲水水性性好好，所所以以在在水水溶溶液液或或电电解解质质溶溶液中极易膨胀液中极易膨胀 型型号号：Sephadex Sephadex G-nG-n（n n越越大大，则则交交联联度度越越小小，而而膨膨胀胀度度、吸吸水水量和筛孔直径则越大量和筛孔直径则越大应用：应用：1.1.理化性质理化性质凝胶过滤层析：凝胶过滤层析：以以G G型型SephadexSephadex为固定相，水为流动为固定相，水为流动相，对水溶性物质进行分离相，对水溶性物质进行分离凝胶渗透层析：凝胶渗透层析：以以LHLH型型SephadexSephadex为固定相，以有机为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离第10页 在在水水溶溶液液、盐盐溶溶液液、碱碱溶溶液液、弱弱酸酸溶溶液液和和有有机机溶溶剂剂中是稳定、不溶解中是稳定、不溶解 强酸或氧化剂强酸或氧化剂溶液时，则轻易使糖苷键水解断裂溶液时，则轻易使糖苷键水解断裂 在在室室温温下下长长久久保保留留时时，应应加加入入适适量量防防腐腐剂剂如如CHClCHCl3 3、0.050.05NaNNaN3 3或或2020EtOHEtOH等等 2.2.稳定性稳定性第11页含含少少许许羧羧基基基基团团，为为弱弱酸酸性性物物质质。能能与与带带正正电电荷荷分分离离物物如碱性蛋白质等发生吸附如碱性蛋白质等发生吸附克克服服方方法法：提提升升洗洗脱脱液液离离子子强强度度至至0.050.05以以上上，可可克克服服此此非非特异性吸附特异性吸附 惯用含有惯用含有NaClNaCl缓冲液作洗脱液。缓冲液作洗脱液。新新购购得得葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶对对蛋蛋白白质质往往往往有有不不可可逆逆吸吸附附性性能能，即即使使吸吸附附数数量量较较少少，但但在在定定量量测测定定或或者者分分离离纯纯化化极极难难得得到到物物质质时，也需先用易得到蛋白质进行时，也需先用易得到蛋白质进行预层析预层析，方便消除其影响，方便消除其影响 3.吸附性吸附性第12页葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶对对芳芳香香族族化化合合物物或或杂杂环环化化合合物物以以及及一一些些凝凝集集素素含含有有较较强强吸吸附附作作用用，若若采采取取凝凝胶胶过过滤滤层层析析分分离离它们时，往往利用是吸附性能，而不是排阻原理它们时，往往利用是吸附性能，而不是排阻原理 第13页第14页琼琼脂脂糖糖是是从从琼琼脂脂中中分分离离出出来来一一个个由由D-D-半半乳乳糖糖和和3,63,6脱脱水水L-L-半乳糖连接而成多糖。其商品名因生产厂家不一样而异半乳糖连接而成多糖。其商品名因生产厂家不一样而异瑞典、中国瑞典、中国 ：SepharoseSepharose美美国国：Bio-gel Bio-gel A A 15m15m，排排阻阻分分子子量量小小于于1515millionmillion分分子子，即即15 15 10 106 6（排阻程度）（排阻程度）英国：英国：SegavacSegavac，粉状、颗粒状粉状、颗粒状丹麦：丹麦：GelaroseGelarose除除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售 二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝胶第15页1.1.性性 质质高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶对尿素、盐酸胍等含有较强抵抗力，在对尿素、盐酸胍等含有较强抵抗力，在pH4.0pH4.09.09.0缓冲缓冲液中稳定液中稳定层析流速较高层析流速较高干胶易脱水破裂，普通存放于含防腐剂水溶液中，防干胶易脱水破裂，普通存放于含防腐剂水溶液中，防止猛烈搅拌止猛烈搅拌第16页Sepharose 2B(2)、4B(4)和和6B(6)Sepharose 6B机械强度大于机械强度大于2B，不过筛孔小于不过筛孔小于2B Sepharose与与1，3-二二溴溴异异丙丙醇醇(1,3-dibromopropanol)在在强强碱碱性条件下反应后，即生成性条件下反应后，即生成CL型交联琼脂糖型交联琼脂糖(Sepharose CL）这这种种琼琼脂脂糖糖筛筛孔孔与与同同浓浓度度、未未交交联联琼琼脂脂糖糖相相同同，但但耐耐热热、耐耐酸酸碱碱。不不过过在在氧氧化化剂剂存存在在下下，会会有有少少许许多多糖糖链链发发生生解解聚聚（稳稳定性提升定性提升）2.2.应用形式（按浓度分）应用形式（按浓度分）第17页3.3.特特 点点 机械强度和筛孔机械强度和筛孔稳定性稳定性都比葡聚糖凝胶好；且层析时都比葡聚糖凝胶好；且层析时流速较快流速较快第18页商商品品名名称称：Bio-gel（生生物物胶胶）。以以甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺(双双体体)作作交交联联剂剂，以以过过硫硫酸酸铵铵作作催催化化剂剂，在在N，N，N，N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(TEMED)加加速速剂剂作作用用下下（化化学学催催化化），将将丙丙烯烯酰酰胺胺(单单体体)聚合而成聚合而成 当当改改变变单单体体浓浓度度时时，就就可可得得到到吸吸水水率率不不一一样样产产物物。商商品品聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶型型号号有有Bio-gel P-2到到P-300，其其阿阿拉拉伯伯数数字字表表示示排阻程度排阻程度 如如 Bio-gel P-150排阻程度为小于排阻程度为小于150 103 Da三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶第19页 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶普普通通制制成成珠珠状状颗颗粒粒，使使用用前前必必须须溶溶胀胀。能能忍忍受受浓浓盐盐、尿尿素素和和胍胍盐盐等等溶溶液液浸浸泡泡；耐耐酸酸碱碱，但但要要防防止止长长久久与与强强酸酸和和强强碱碱接接触触，假假如如与与其其接接触触并并在在高高温温条条件件下下，酰酰胺胺基基将将快快速发生分解速发生分解 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶对对芳芳香香族族、酸酸性性和和碱碱性性化化合合物物稍稍有有吸吸附附现现象象 克服吸附方法：提升洗脱液离子强度克服吸附方法：提升洗脱液离子强度 第20页SephacrylSephacryl是是由由烯烯丙丙烷烷基基葡葡聚聚糖糖与与甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺共共价价交交联联制制成成。此此凝凝胶胶属属硬硬性性凝凝胶胶，它它含含有有一一定定大大小小筛筛孔孔和和少少许许羧羧基基基基团团耐耐酸酸碱碱、耐耐去去污污剂剂、耐耐解解离离剂剂，甚甚至至可可用用去去污污剂剂、盐盐酸酸胍胍或或尿素溶液作洗脱剂尿素溶液作洗脱剂 多多用用于于蛋蛋白白质质、核核酸酸、多多糖糖和和蛋蛋白白聚聚糖糖分分离离纯纯化化，也也用用于于病病毒颗粒毒颗粒分离分离四、四、SephacrylSephacryl第21页 由高交联度琼脂糖与葡聚糖共价结合而成由高交联度琼脂糖与葡聚糖共价结合而成特特点点：含含有有良良好好分分子子筛筛特特征征和和理理化化稳稳定定性性。溶溶液液酸酸碱碱度度可可在在pH3pH3 1212范范围围内内改改变变；溶溶液液中中加加入入去去污污剂剂(如如1 1SDS)SDS)和和(或或)解解离离剂剂(如如8 8mol/Lmol/L尿尿素素、6 6mol/Lmol/L盐盐酸酸胍胍)时时，也也不不会会影影响响分分离效果离效果 五、五、SuperdexSuperdex第22页SuperoseSuperose：高交联度多孔琼脂糖珠高交联度多孔琼脂糖珠玻玻璃璃珠珠：有有大大量量网网孔孔，且且分分布布均均一一。机机械械性性能能良良好好，在在较较高高层层析析流流速速下下，分分辨辨率率并并不不受受影影响响，其其缺缺点点是是对对蛋蛋白白质质等等物质有物质有吸附吸附能力能力聚苯乙烯凝胶聚苯乙烯凝胶五、其五、其 他他第23页第二节第二节 基本原理基本原理第24页一、基本原理一、基本原理 凝胶过滤层析所用基质是含有立体网状结构、筛孔直径较凝胶过滤层析所用基质是含有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒物质。这种物质可完全或部分排阻一些一致，且呈珠状颗粒物质。这种物质可完全或部分排阻一些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则能够在筛孔中大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则能够在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻程度用自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻程度用 表表示示 洗脱体积；洗脱体积；外水体积；外水体积；凝胶床体积凝胶床体积 在一定层析条件下，在一定层析条件下，和和 均为固定值，而均为固定值，而 伴随被分离物分子量改伴随被分离物分子量改变而改变。组分分子量越大，则洗脱更轻易（排阻越多），变而改变。组分分子量越大，则洗脱更轻易（排阻越多），越小，越小，越小越小第25页 各组分间各组分间 值差异越大，分离效果越好；值差异越大，分离效果越好；差异越小差异越小,则则分离效果很差，或根本无法分离分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分搜集器等量或等时搜集，检测后分段合并流出物用部分搜集器等量或等时搜集，检测后分段合并相同组分各管流出物，得到分子量不一样各种组分相同组分各管流出物，得到分子量不一样各种组分第26页 1、当当Kav=0时时，则则Ve=Vo，即即对对于于根根本本不不能能进进入入凝凝胶胶内内部部大大分分子子物物质质全全排排阻阻，洗洗脱脱体体积积等等于于空空隙隙体体积积即即外外水水体体积积（图图中组分中组分）2、当当Kav=1时时，Ve=Vo+Vi。即即小小分分子子可可完完全全渗渗透透凝凝胶胶内内部部时时，洗洗脱脱体体积积应应为为空空隙隙体体积积与与内内水水体体积积之之和和。Ve=Vo+Vi（图中组分（图中组分）第27页3 3、当当0 0K Kavav1 1时时，V Ve e=V Vo o+K Kavav（V Vi i V Vg g）。表表示示固固定定相相中中只只有有一一部部分分可可被被组组分分扩扩散散渗渗透透，一一部部分分被被排排阻阻，V Ve e即即在在V Vo o与与V Vo o+V Vi iV Vg g之间改变（图中组分之间改变（图中组分）4 4、有时、有时K Kavav1 1，表示凝胶对组分有吸附作用表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中从内水中洗脱出来含量下降），此时洗脱出来含量下降），此时V Ve eV Vo o+V Vi iV Vg g。比如一些芳香比如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-Sephadex G-2525中洗脱体积远超出理论计算最大值中洗脱体积远超出理论计算最大值第28页二、二、值测定值测定只要测出只要测出 、和和 ，即可计算出，即可计算出 值值 1.测定：测定：（1 1）计算法：）计算法：2.2.（2 2）测定法：）测定法：第29页 测定：测定：用蓝色葡聚糖用蓝色葡聚糖（M=200M=200万），在万），在SephadexSephadex中被中被完全排阻，并借助其本身颜色，采取肉眼或分光光度计完全排阻，并借助其本身颜色，采取肉眼或分光光度计检测（检测（210210、260260或或620nm620nm）洗脱体积）洗脱体积 测定：测定：用用 、N-N-乙酰酪氨酸或其它小分子物乙酰酪氨酸或其它小分子物质作为洗脱对象。因为分子量小，且无吸附，故洗脱体质作为洗脱对象。因为分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是积刚好是 （=1=1）当分子大小在凝胶孔径上、下限之间时，则当分子大小在凝胶孔径上、下限之间时，则 介于介于 和和 之间（即之间（即 =0=0 1 1）第30页第31页第三节第三节 操操 作作第32页（一）凝胶选择（一）凝胶选择 1.1.型号：型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：如：Sephadex G Sephadex G 型多用于分离蛋白质；型多用于分离蛋白质；生物胶和生物胶和 SephacrylSephacryl等多用于分离核酸；等多用于分离核酸；要除去蛋白质中盐类，多用要除去蛋白质中盐类，多用Sephadex G-25Sephadex G-252.2.粒粒度度：粒粒度度与与交交联联度度无无关关。与与粗粗颗颗粒粒相相比比，细细颗颗粒粒凝凝胶胶之之间间空空间间小小，装装柱柱易易均均匀匀，分分离离效效果果好好，但但流流速速慢慢；而而粗粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径层析柱颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径层析柱 一、凝胶选择与处理一、凝胶选择与处理第33页第34页（二）凝胶用量计算（二）凝胶用量计算 因为凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算因为凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出凝胶用量需增加出凝胶用量需增加101020%20%第35页（三）凝胶处理（三）凝胶处理 将所用干胶置于将所用干胶置于5 51010倍量倍量D.WD.W中，充分浸泡（表中，充分浸泡（表6-26-2溶胀溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮小颗粒，再用时间），用倾斜法去除表面悬浮小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡室温浸泡0.5h0.5h，抽滤除去碱液，抽滤除去碱液，用用D.WD.W洗至中性。再用抽气方法以洗至中性。再用抽气方法以D.WD.W或平衡液除去凝胶颗或平衡液除去凝胶颗粒之间气泡粒之间气泡第36页1 1柱子选择柱子选择当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高床体积相同时，柱长长者比短分辨率高床体积相同时，柱长长者比短分辨率高普普通通理理想想层层析析柱柱直直径径与与长长度度之之比比是是1 1：25251 1：100100；层层析析柱柱外外面面最最好好有有夹夹套套，能能控控制制温温度度（柱柱温温箱箱），以以确确保保结结果果重重复复性性 2 2装柱：装柱：惯用湿装法（第三章）惯用湿装法（第三章）3 3凝胶柱判定凝胶柱判定 二、凝胶柱制备二、凝胶柱制备第37页流速、柱长对分离影响流速、柱长对分离影响 第38页 加加样样量量与与层层析析柱柱床床体体积积及及检检测测方方法法灵灵敏敏度度相相关关。床床体体积积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少越小、方法灵敏度越高时，加样量越少 层层析析目目标标在在于于分分析析时时，加加样样量量占占床床体体积积12，作作制制备备、脱盐用时，占脱盐用时，占2030 普普通通来来说说，加加样样量量越越少少，分分辨辨率率越越高高。详详细细加加样样体体积积由由分配系数分配系数(Kav)或洗脱体积或洗脱体积(Ve)来决定来决定三、加样与洗脱三、加样与洗脱（一）加（一）加 样样第39页第40页 V VeAeA、V VeBeB：组分组分A A、B B洗脱体积洗脱体积 K KavAavA、K KavBavB：组分：组分A A、B B分配系数分配系数 V Vs s：A A、B B两组分洗脱体积之差（又称为分离体积）两组分洗脱体积之差（又称为分离体积）V Vs s=V=VeA eA V VeBeB当当样样品品体体积积V Vp pV Vs s时时，理理论论上上洗洗脱脱图图形形是是两两种种物物质质恰恰好好分分开开(图图中中)。但但因因为为样样品品流流过过柱柱时时扩扩散散作作用用，其其体体积积会会逐逐步步增增大大，致致使使其其洗洗脱脱体积远比原来大体积远比原来大加样量（Vp）确定第41页 图图、中中A A、B B两两种种物物质质有有一一定定程程度度交交叉叉，这这表表明明二二者者只只是是部部分分分分开开。所所以以，当当V Vp p等等于于或或大大于于V Vs s时时，A A、B B两两种种物物质就不能完全分开质就不能完全分开(图中图中)当当V Vp pV Vs s时，时，A A、B B两种物质就能分开两种物质就能分开(图中图中)依据依据 V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o）又又 V Vs s=V=VeAeAV VeB eB =（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vt t V Vo o）第42页 V Vs s=（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vt t V Vo o）=（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vi i+V+Vg g）A A、B B两种物质能分开最低限：两种物质能分开最低限：V Vp pV Vs s最大最大V Vs s时必要条件：时必要条件：KKavAavAK KavB avB 最大，为最大，为1 10 01 1 V Vi i+V+Vg g最大，普通为最大，普通为V Vt t/2/2则：则：最大理论加样量最大理论加样量V Vp pV Vs sV Vt t/2/2最大理论加样量计算最大理论加样量计算第43页 为为提提升升分分离离效效果果，除除了了缩缩小小加加样样体体积积以以外外，样样品品黏黏度度也也普普通通以以小小于于2 2cp(cp(厘厘帕帕，P=P=N/mN/m2 2s s)，或或者者与与洗洗脱脱液黏度相当为宜液黏度相当为宜 葡聚糖使粘度上升葡聚糖使粘度上升 黏度影响黏度影响第44页粘度对柱层析影响粘度对柱层析影响 第45页1.1.洗脱液选择标准洗脱液选择标准 能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活 普普通通以以单单一一缓缓冲冲液液（如如PBSPBS、Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液等等）或或盐盐溶溶液液，有时甚至用有时甚至用D.WD.W作为洗脱液作为洗脱液 2.2.洗脱速度洗脱速度 若若流流速速不不均均匀匀，搜搜集集每每一一部部分分洗洗脱脱体体积积不不恒恒定定，K Kavav就就难难以以确确定定 最最好好装装置置是是恒恒流流泵泵(微微量量泵泵、蠕蠕动动泵泵)，能能够够使使流流速速在在较较大大范范围围内内恒恒定定。若若无无此此装装置置，可可用用控控制制操操作作压压方方法法进进行行，其其装装置置可可使使用恒压瓶用恒压瓶 普普通通，洗洗脱脱速速度度慢慢，分分离离效效果果就就好好；但但若若太太慢慢，由由会会因因扩扩散散加剧而影响分离效果加剧而影响分离效果(二二)洗洗 脱脱第46页。第47页Sephadex Sephadex G-50G-50及及其其以以下下（交交联联度度大大）流流速速与与操操作作压压之之间关系恪守间关系恪守DarcysDarcys规律规律u u：线性流速：线性流速(ml/cmml/cm2 2h)h)K K：常数：常数(粗、中、细颗粒各不相同粗、中、细颗粒各不相同)P P：操作压：操作压(cp)cp)L L：柱长柱长流速与操作压流速与操作压第48页 K Ko o仅与凝胶性质相关，而与柱子直径基本无关。仅与凝胶性质相关，而与柱子直径基本无关。不不过过G-75G-75以以上上各各种种型型号号交交联联葡葡聚聚糖糖流流速速还还与与柱柱直直径径大大小相关小相关 当洗脱液黏度为当洗脱液黏度为lcplcp时表示式时表示式第49页第50页 普通，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩普通，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而影响分离效果散加剧而影响分离效果第51页四、凝胶柱再生及保留四、凝胶柱再生及保留（一）再生（一）再生 使用过一次或几次凝胶柱，通惯用使用过一次或几次凝胶柱，通惯用3 34 4倍床体积洗脱液倍床体积洗脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过屡次后，凝胶冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过屡次后，凝胶床体床体积变小、流动速度下降、杂质过多积变小、流动速度下降、杂质过多等，其处理方法是等，其处理方法是 先用水重复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行先用水重复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平衡；平衡；把凝胶倒出，用低浓度酸或碱按其预处理方法进行处把凝胶倒出，用低浓度酸或碱按其预处理方法进行处理，然后重新装柱理，然后重新装柱第52页膨胀状态膨胀状态 即在水相中保留。可加入即在水相中保留。可加入0.02%0.02%叠氮钠（叠氮钠（NaNNaN3 3）溶液等防溶液等防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保留。腐剂或加热灭菌后于低温短时间保留。普普通通不不用用氯氯仿仿、丁丁醇醇、甲甲苯苯等等为为防防腐腐剂剂。因因为为它它们们能能引引发发凝凝胶胶颗颗粒粒收收缩缩，同同时时还还能能进进入入层层析析仪仪器器塑塑料料部部件件，使使塑塑料料变软，造成不良后果变软，造成不良后果（二）保（二）保 存存第53页第54页半收缩状态：半收缩状态：用用完完后后水水洗洗净净，然然后后再再用用60%60%70%70%乙乙醇醇洗洗，则则凝凝胶胶体积缩小，于低温较长时间保留体积缩小，于低温较长时间保留干燥状态：干燥状态：用用水水洗洗净净后后，加加入入含含乙乙醇醇水水洗洗，并并逐逐步步加加大大含含醇醇量量，最最终终用用95%95%乙乙醇醇洗洗，则则凝凝胶胶脱脱水水收收缩缩，再再用用乙乙醚醚洗洗去去乙乙醇醇，抽滤至干，于抽滤至干，于60608080烘干后长时间保留烘干后长时间保留不脱水而直接烘干会黏结成块不脱水而直接烘干会黏结成块第55页第四节第四节 应应 用用第56页原原理理：盐盐类类小小分分子子物物质质进进入入凝凝胶胶筛筛孔孔，而而大大分分子子物物质质则则被被排阻在外排阻在外（分子筛原理）（分子筛原理）优点：优点：与透析相比，速度快，不会引发大分子物质变性与透析相比，速度快，不会引发大分子物质变性材料：材料：细颗粒葡聚糖凝胶细颗粒葡聚糖凝胶G-25G-25 一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩第57页分分离离对对象象：溶溶解解度度、带带电电性性等等理理化化性性质质相相同同而而分分子子质质量量不不 同，或者是聚合度不等混合物溶液同，或者是聚合度不等混合物溶液实例：实例：Sephadex G-200Sephadex G-200层析纯化层析纯化AFPAFP 制制备备Ag-AbAg-Ab复复合合物物 溶溶于于少少许许0.1mol/L 0.1mol/L Gly-HClGly-HCl缓缓冲冲液液中中，并并用用本本液液透透析析2h 2h 上上Sephadex Sephadex G-200G-200柱柱 得得AFPAFP峰峰 置置0.1mol/L0.1mol/L柠檬酸柠檬酸-磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH4.8pH4.8）透析）透析 上柱洗脱上柱洗脱 AFPAFP纯品纯品二、分离生命物质二、分离生命物质第58页第59页第60页热热源源物物质质：指指微微生生物物产产生生分分子子量量很很大大一一些些多多糖糖蛋蛋白白复复 合合物等，能使人体发烧物质物等，能使人体发烧物质材料：材料：Sephadex G-25Sephadex G-25（8080120120目目 ）特点：特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便比活性炭吸附、离子交换吸附等方便 实实例例：用用Sephadex Sephadex G-25G-25凝凝胶胶层层析析除除去去氨氨基基酸酸粗粗品品中中热热源源质质：利利用用热热源源（大大分分子子蛋蛋白白类类）K Kavav=0=0，而而氨氨基基酸酸K Kavav11，将将试试剂剂量控制在柱体积量控制在柱体积202030%30%，能实现完全分离，能实现完全分离三、去热源物质三、去热源物质第61页 原原理理：Kav=b lgM+c 或或lgM=adKav(M为为分分子子质质量量，常数常数a、b、c、d均大于均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav 也可用以下也可用以下4个指标代替个指标代替VeVo：分离体积分离体积Ve/Vo：相对保留体积（另相对保留体积（另R Vo/Ve）Ve/Vt：简化洗脱体积，受柱填充情况影响较小简化洗脱体积，受柱填充情况影响较小 Ve：洗脱体积洗脱体积特点：简便实用，所需样品量较少特点：简便实用，所需样品量较少 四、测定分子质量四、测定分子质量第62页pH6pH68 8范范围围内内，曲曲线线线线性性才才比比很很好好；而而在在极极端端pHpH时时，因因为为变性等原因易偏高变性等原因易偏高 普通普通适合用于球状适合用于球状propro分子量测定，而纤维状分子量测定，而纤维状propro不适当不适当糖蛋白中若糖蛋白中若糖百分比糖百分比5 5时，测定结果偏大时，测定结果偏大不受不受变性剂变性剂如尿素和盐酸胍影响如尿素和盐酸胍影响有些酶类不适用。如有些酶类不适用。如淀粉酶淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶物，这种络合物与酶-底物络合物相同，所以在凝胶层析时底物络合物相同，所以在凝胶层析时有异常反应有异常反应用凝胶过滤法测定分子量不足用凝胶过滤法测定分子量不足第63页第64页第65页第66页第67页 若若在在SephadexSephadex分分子子上上连连接接DEAEDEAE、羧羧甲甲基基或或磺磺酸酸乙乙基基等等离离子子基基团团，可可使使凝凝胶胶在在含含有有分分子子筛筛基基础础上上，还还含含有有离离子子交交换换能力，大大提升能力，大大提升SephadexSephadex在生化制药中应用范围在生化制药中应用范围 如如：DEAE-Sephadex DEAE-Sephadex A-25A-25可可用用于于制制备备无无热热原原物物质质去去离离子水子水五、其五、其 他他第68页4 4在在凝凝胶胶层层析析柱柱中中分分离离某某有有效效成成份份时时，洗洗脱脱体体积积为为140140mlml，其其外外水水体体积积和和总总体体积积分分别别为为6060mlml和和200200mlml，求求分分配系数是多少配系数是多少?思索题思索题 解：解：V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o ）140 140=60+K=60+Kavav（200200 60 60）K Kavav=0.57=0.57第69页解：最大理论加样量解：最大理论加样量 Vp=Vs=Vt/2 =3.14(5.0/2)2 60/2 =589ml思索题思索题5 5在在5.05.0cm60cmcm60cm凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最 多多加样体积是多少毫升加样体积是多少毫升?第70页