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生物技术在植物育种中应用市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx
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1、第十三章第十三章生物技术在植物育种中应用生物技术在植物育种中应用第1页1、教学基本要求、教学基本要求(1)了解细胞工程与作物育种原理和)了解细胞工程与作物育种原理和基本方法;基本方法;(2)了解作物转基因技术原理和基本)了解作物转基因技术原理和基本方法;方法;(3)了解分子标识主要类型和分子标)了解分子标识主要类型和分子标识辅助选择育种原理和基本方法。识辅助选择育种原理和基本方法。第2页2、教学基本内容、教学基本内容第一节第一节细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种二、植物原生质体培养和体细胞杂交二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节第二节
2、作物育种转基因技术作物育种转基因技术一、转基因技术发展现实状况一、转基因技术发展现实状况二、二、*转基因育种程序转基因育种程序三、转基因作物品种选育三、转基因作物品种选育四、转基因作物生物安全性四、转基因作物生物安全性第三节第三节分子标识辅助选择育种分子标识辅助选择育种一、一、*分子标识类型和特点分子标识类型和特点二、惯用分子标识原理和遗传特征二、惯用分子标识原理和遗传特征三、三、MAS育种方法育种方法第3页第十三章第十三章生物技术在作物育种生物技术在作物育种中应用中应用第一节第一节 细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种第4页 植物细胞工程植物细胞工程(plant cell plant cel
3、l engineeringengineering)是以植物组织和细胞培养技是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来一门学科。它以细胞为术为基础发展起来一门学科。它以细胞为基本单位,在体外(基本单位,在体外(in vitroin vitro)条件下进)条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学特征按人们意愿生产某种物质过程。特征按人们意愿生产某种物质过程。第5页 细胞工程与作物遗传改良有着亲细胞工程与作物遗传改良有着亲密关系,利用细胞工程技术已培育出密关系,利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广品种。一些大面积推广品种。第6页早期,哈布兰特在前人细胞学说影早
4、期,哈布兰特在前人细胞学说影响下,提出响下,提出高等植物组织和器官能够高等植物组织和器官能够不停分割不停分割,并深入提出了,并深入提出了植物细胞全植物细胞全能性(能性(celltotipotency)理论。)理论。第7页植物细胞全能性是植物细胞工植物细胞全能性是植物细胞工程理论基础程理论基础。细胞全能性是指细胞细胞全能性是指细胞所含有形成各种细胞类型潜在能力,所含有形成各种细胞类型潜在能力,也包含植物细胞经脱分化再形成植也包含植物细胞经脱分化再形成植株能力。株能力。第8页 19,Hanning用萝卜胚培养,取得小植株,为组织培养工作奠定了基础。第9页1934年,年,White对番茄切段进行培对
5、番茄切段进行培养,建立了第一个活跃生长无性繁殖系,养,建立了第一个活跃生长无性繁殖系,取得了离体培养真正成功。取得了离体培养真正成功。三年后,三年后,White又发觉又发觉B族维生素对族维生素对培养物生长有主要作用。培养物生长有主要作用。第10页经过几年努力,以经过几年努力,以White为主几为主几位科学家建立了植物组织培养位科学家建立了植物组织培养(plainttissueculture)综合培养)综合培养基,成为以后各种培养基基础。基,成为以后各种培养基基础。第11页1948年,年,Skoog等发觉腺嘌呤等发觉腺嘌呤/生长素生长素百分比是控制芽和根分化决定原因之一,这百分比是控制芽和根分化
6、决定原因之一,这一发觉成为植物组织培养中控制器官形成激一发觉成为植物组织培养中控制器官形成激素模式。素模式。Miller(1956)发觉激动素比腺嘌呤更)发觉激动素比腺嘌呤更能促进芽形成。能促进芽形成。第12页1958年,年,Stewart&Shautz从胡萝卜从胡萝卜根根悬浮细胞悬浮细胞诱导分化成完整小植株,使诱导分化成完整小植株,使50多多年前哈布兰特提出细胞全能性假说首次得到科年前哈布兰特提出细胞全能性假说首次得到科学验证,这一结果大大加速了植物组织培养研学验证,这一结果大大加速了植物组织培养研究发展。究发展。1964年,年,Guha等从曼佗罗等从曼佗罗花药花药培养出培养出单倍体植株。单
7、倍体植株。第13页1970年,年,Kameya等利用等利用花粉花粉培养取培养取得单倍体植株。得单倍体植株。1971年,年,Takebe等首次从烟草等首次从烟草原生质原生质体体取得再生植株;取得再生植株;1972年,年,Carlson等取得第一个烟草等取得第一个烟草种种间体细胞杂种间体细胞杂种植株。植株。第14页至此,在愈伤组织水平、单个细胞至此,在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都取得了完整植株,平和体细胞杂种水平都取得了完整植株,充分证实了植物细胞全能性。充分证实了植物细胞全能性。植物组织培养流程示意图以下。植物组织
8、培养流程示意图以下。第15页外植体起源外植体起源外植体培养外植体培养愈伤组愈伤组织织再生小植株再生小植株再生植株再生植株第16页植物细胞工程应用在植物细胞工程应用在20世纪世纪60年年代就已受到重视,但真正应用研究在代就已受到重视,但真正应用研究在70年代才进入高潮。我国第一个用花药培年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种,随即又育成了一些水养育成烟草品种,随即又育成了一些水稻、小麦新品种。稻、小麦新品种。第17页经济植物经济植物快繁与脱毒快繁与脱毒、体细胞变异筛选、体细胞变异筛选、新种质创造、细胞器移植、新种质创造、细胞器移植、DNA导入等均对导入等均对作物改良和农业生产起到了促进
9、作用。作物改良和农业生产起到了促进作用。第18页一、一、植物细胞和组织培养技术植物细胞和组织培养技术第19页(一)培养基及其组成(一)培养基及其组成第20页 1 1、培养基(、培养基(MediumMedium)种类和特)种类和特点点惯用培养基有惯用培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。等。第21页2、培养基成份、培养基成份培养基中都应包含植物生长必需培养基中都应包含植物生长必需16种营种营养元素和一些生理活性物质,通常将这些物养元素和一些生理活性物质,通常将这些物质分为三大类,即无机营养物、有机物质和质分为三大类,即无机营养物、有机物质和植物生长调整物质(表)。植物生长调整
10、物质(表)。第22页表表植物组织培养所需养分和激素植物组织培养所需养分和激素水水有机物有机物大量元素大量元素微量元素微量元素PH糖糖NFeCo氨基酸氨基酸PZnNi维生素维生素KBAl生长素生长素CaMnMo细胞分裂素细胞分裂素MgCuI调整物质调整物质赤霉素赤霉素S脱落酸脱落酸乙烯乙烯酵母提取物酵母提取物椰子汁椰子汁成份不定物质成份不定物质植物提取物植物提取物水解酪蛋白水解酪蛋白蛋白胨蛋白胨第23页(二)培养基配制(二)培养基配制第24页1、母液配制、母液配制为了为了降低配制培养基时每次称量药降低配制培养基时每次称量药品麻烦,降低极微量药品在每次称重时品麻烦,降低极微量药品在每次称重时误差误
11、差,普通先配制,普通先配制高浓度贮备液,即高浓度贮备液,即母母液液。第25页大量元素可配成大量元素可配成10倍母液倍母液,使用,使用时每配制时每配制1000ml培养基需要从母液培养基需要从母液中取中取100ml。配制母液时应做到分别。配制母液时应做到分别称量,充分溶解,在混合次序上应最称量,充分溶解,在混合次序上应最终加入终加入Ca2+,混合时要边加边,混合时要边加边混合。混合。第26页微量元素因为使用量低,普通配微量元素因为使用量低,普通配成成100倍甚至倍甚至1000倍母液倍母液,使用时每配,使用时每配制制1L培养基从母液中取培养基从母液中取10ml或或1ml,配制时应注意充分溶解后再依次
12、混合。配制时应注意充分溶解后再依次混合。第27页 第三种母液即铁盐,第三种母液即铁盐,铁盐必须单铁盐必须单独配制,独配制,若与其它元素混合易造成沉若与其它元素混合易造成沉淀。淀。普通采取鳌合铁普通采取鳌合铁,即,即FeSO4与与EDTA钠盐混合物,普通扩大钠盐混合物,普通扩大200倍。倍。第28页 EDTA钠盐须用温水溶解,然钠盐须用温水溶解,然后与后与FeSO4液混合,在液混合,在7580之间让其鳌合之间让其鳌合1h。使用鳌合铁目使用鳌合铁目标是防止沉淀,并使培养基能迟缓标是防止沉淀,并使培养基能迟缓不停地供给不停地供给Fe+。第29页 第四种母液为有机化合物母液,主要是第四种母液为有机化合
13、物母液,主要是维生素和氨基酸类物质,维生素和氨基酸类物质,这类物质不能配成这类物质不能配成混合母液,混合母液,一定要分别配成单独母液,一定要分别配成单独母液,浓度浓度为每毫升含为每毫升含0.1、1、10mg,使用时依据,使用时依据需要量取。需要量取。第30页最终一个母液是激素,最终一个母液是激素,每种激素每种激素应单独配制母液应单独配制母液,其浓度为,其浓度为0.1、0.5或或1.0mg/ml。各种激素难溶于水,。各种激素难溶于水,配制时应注意溶解次序。配制时应注意溶解次序。第31页IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少、玉米素先溶于少许许95%酒精,再加水定容;酒精,再加水定容;NAA可溶于
14、热可溶于热水或少许酒精后,再加水定容;水或少许酒精后,再加水定容;2,4-D不不溶于水,可用溶于水,可用1molNaOH溶解后再定容;溶解后再定容;KT和和BA应先溶于少许应先溶于少许1molHCl中,然后中,然后定容。定容。第32页表表一些植物组织培养基成份(一些植物组织培养基成份(mg/L)-成份成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-大量元素大量元素NH4NO31650-1650-720-16501200KNO319002527.51900809502500-19001900CaCl2 2H2O440150-20075440440CaCl2-440-166-MgS
15、O4 7H2O370246.5370750185400250370370KH2PO4170-170-68-170340NH4H2PO4-340-(NH4)2SO4-134-Ca(NO3)2 4H2O-300-NaNO3-600-NaH2PO4 H2O-150-19-125-KCl-65-750-第33页-成份成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-微量元素微量元素KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -H H3 3BOBO3 3 6.2 3 24.8 1.5 10
16、 5 1 6.2 0.63 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63MnSOMnSO4 44H4H2 2O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23MnSOMnSO4 4HH2 2O -10 -10 -O -10 -10 -Zn SOZn SO4 47H7H2 2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -Zn SOZn SO4 44H4H2 2O -O -Zn NaZn Na2 2EDTA -15EDTA -15NaNa2 2
17、MoOMoO4 42H2H2 2O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025MoOMoO3 3 -0.001 -0.001 -Cu SOCu SO4 4 -0.2 -0.2 -Cu SOCu SO4 45H5H2 2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025CoClCoCl2 26H6H2 2O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.02
18、5 0.0025O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.025 0.0025CoSOCoSO4 47H7H2 2O -0.03 -O -0.03 -AlClAlCl3 3 -NiClNiCl2 26H6H2 2O -0.03 -O -0.03 -第34页-铁盐成份铁盐成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-FeCl366H2O-1-Fe2(SO4)3-2.5-FeSO477H2O27.8-27.8-27.815-27.827.8Na2EDTA2HEDTA2H2 2O O37.3-37.3-37.320-37.337.3NaFe EDTA-28-1-第35页成
19、份成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER有机物有机物盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5110.010.50.5-0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.110130.010.55-0.40.5烟酸烟酸0.5110.0555-0.5肌醇肌醇100100100-1001000-100-甘氨酸甘氨酸2-32-2脯氨酸脯氨酸-1381-叶酸叶酸-0.5-生物素生物素-0.05-蔗糖蔗糖3%2%3%2%2%3%-3%4%第36页2、培养基配制、培养基配制以配制以配制1L培养基为例,培养基配制方法培养基为例,培养基配制方法以下:以下:第37页混合各成份母液。取大量元素混合各成份母液。取大量元素母液母
20、液100ml、微量元素母液、微量元素母液10ml、铁、铁盐母液盐母液5ml于一个于一个1L烧杯中,依次加烧杯中,依次加入有机成份和激素,并加水至入有机成份和激素,并加水至500ml。第38页熔化琼脂:称熔化琼脂:称78g琼脂和所需琼脂和所需蔗糖于另一蔗糖于另一1L烧杯中,加水至烧杯中,加水至500ml,待糖溶解后,加热使琼脂充分熔化。,待糖溶解后,加热使琼脂充分熔化。第39页将(将(1)和()和(2)混合,搅拌均匀,)混合,搅拌均匀,补水至补水至1000ml。第40页调调PH。普通用。普通用0.1molNaOH或或1NHCl调调PH至所需至所需PH。普通。普通PH调至调至5.8,但,但也有也有
21、PH调到调到7.0,不一样材料最适,不一样材料最适PH不一样。不一样。对培养基凝固来说,对培养基凝固来说,PH较高时,培养基过硬,较高时,培养基过硬,不便于培养材料吸收营养;不便于培养材料吸收营养;PH过低,低到过低,低到4.0以下时,培养基极难凝固。以下时,培养基极难凝固。第41页分装:将培养基分装于分装:将培养基分装于100ml或或50ml三角瓶中,每瓶三角瓶中,每瓶50或或30ml左左右,封口包装。右,封口包装。第42页灭菌:普通用灭菌:普通用1.1kg/cm2压力,压力,在在121下灭菌下灭菌1520min。灭菌时间。灭菌时间应依据材料掌握。时间短,灭菌不彻底;应依据材料掌握。时间短,
22、灭菌不彻底;时间长,会引发培养基成份降解。时间长,会引发培养基成份降解。第43页放置备用。灭菌后取出培养瓶放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上,使之冷却凝固。培放置在培养台上,使之冷却凝固。培养瓶应平放,以免形成斜面。养瓶应平放,以免形成斜面。第44页(三)无菌操作方法(三)无菌操作方法第45页1、消毒剂、消毒剂在接种前,必须使材料完全无菌,这是在接种前,必须使材料完全无菌,这是取得植物组织培养成功基本确保。要确保这取得植物组织培养成功基本确保。要确保这一点,取材时应选取植物组织内部无菌材料。一点,取材时应选取植物组织内部无菌材料。从健壮植株上取材,不要有伤口;严格预防从健壮植株上取材,不
23、要有伤口;严格预防病虫。病虫。第46页应在晴天取材,最好中午或下午取材。应在晴天取材,最好中午或下午取材。最好防止选取田间材料,选取无菌苗很好。最好防止选取田间材料,选取无菌苗很好。非要用田间材料时,为防止消毒困难,可将非要用田间材料时,为防止消毒困难,可将材料种在大棚或生长箱里。惯用消毒剂见表。材料种在大棚或生长箱里。惯用消毒剂见表。第47页表表植物材料消毒惯用消毒剂及使用方法植物材料消毒惯用消毒剂及使用方法-消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度消除难易消除难易消毒时间消毒时间消毒效果消毒效果(%)(min)-次氯酸钠次氯酸钠2易易530很好很好次氯酸钙次氯酸钙910易易530很好很好漂白粉漂白粉饱
24、和溶液饱和溶液易易530很好很好氯化汞氯化汞0.11.0较难较难210最好最好酒精酒精7075易易0.22好好H2O21012最易最易515好好溴水溴水12 易易210很好很好AgNO31较难较难530好好抗生素抗生素450mg/L中中3060很好很好第48页对于难消毒材料,如有茸毛、粗糙不平对于难消毒材料,如有茸毛、粗糙不平材料等,在消毒前,普通先用肥皂水洗,自材料等,在消毒前,普通先用肥皂水洗,自来水冲净,在来水冲净,在70%酒精或酒精或1LHCl中浸中浸30s,再加入消毒剂。不一样材料消毒方式和所,再加入消毒剂。不一样材料消毒方式和所需时间不一样,研究者应依据不一样材料确需时间不一样,研
25、究者应依据不一样材料确定详细消毒方案。定详细消毒方案。第49页2、无菌操作、无菌操作准备好接种材料用培养基、待消毒材料、准备好接种材料用培养基、待消毒材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具(如剪刀、镊子、解剖刀等,这些工操作工具(如剪刀、镊子、解剖刀等,这些工具可用高温消毒,也可用高压高温灭菌,也可具可用高温消毒,也可用高压高温灭菌,也可随用随消毒)、随用随消毒)、70%酒精等。酒精等。第50页将超净工作台打开,让其运行将超净工作台打开,让其运行10min左左右,在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖,右,在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖,
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