细胞生物学研究方法翟中和第四版省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第细胞生物学（第4版）版）第第3章章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第1页本章主要内容本章主要内容细胞形态结构观察方法细胞及其组分分析方法细胞培养与细胞工程细胞及其生物大分子动态改变模式生物与功效基因组研究第2页第一节第一节 细胞形态结构观察方法细胞形态结构观察方法病毒20-200 nm支原体0.1-0.3 m细菌0.5-5.0 m动植物细胞20-30 m活细胞多是无色透明无色透明直径直径第3页显微微镜观察范察范围肉眼肉眼观察范察范围第4页肉眼0.2 mm光学显微镜0.2 m电子显微镜0.2 nm扫描隧道显微镜样品制备样品制备技术分辨率分辨率第5页一、光学显微镜一、光学显微镜(light microscope)从细胞发觉、细胞学说建立，直至今天光学显微镜依然是细胞生物学研究主要工具1.目镜目镜 2.准焦螺旋准焦螺旋3.物镜物镜 4.载物台载物台5.反光镜反光镜第6页（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜组成组成由由3 部分组成：部分组成：光学放大系统（目镜光学放大系统（目镜与物镜）与物镜）照明系统（光源和照明系统（光源和聚光镜）聚光镜）镜架及调整系统镜架及调整系统第7页（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜成像成像放大倒立虚像放大倒立虚像经物镜形成倒立实像经目镜深入放大成虚像第8页（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜分辨率分辨率分辨率：分辨率：显微镜最主要性能参数分辨率是指能区分开两个质点间最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2 m:光源波长光源波长N:介质折射率介质折射率,空气为空气为1,油为油为1.4:物镜镜口角物镜镜口角(最大最大140o,Sin/2 最大最大0.94)第9页 镜口角是指被观察点射入物镜镜口角是指被观察点射入物镜前透镜边缘光线之间夹角。前透镜边缘光线之间夹角。第10页（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜样品制备样品制备Figure9-10,11a Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)石蜡切片石蜡切片H.E染色染色第11页（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜利用光线干涉原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞非染色活细胞观察A.当两束光相位相同时，相互干涉结果使光波振幅增加B.当两束光相位相反时，则造成光波振幅降低第12页（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜相差显微镜是在普通光学显微镜基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差体外培养MDCK细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果比较第13页（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上微小区分转化成明暗区分分辨率比普通光镜提升了一个数量级录像增差显微镜能够用来直接观察颗粒物质沿着微管运输动态过程Figure9-9 Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)第14页Four types of light microscopy(A)The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell,a technique known as bright-field microscopy (B)phase-contrast microscopy(C)Nomarski differential-interference-contrast microscopy(D)dark-field microscopyFigure9-8 Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)第15页正置显微镜与倒置显微镜比较正置显微镜与倒置显微镜比较组成一样，倒置显微镜物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，组成一样，倒置显微镜物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养活细胞，含有相差物镜。后者在载物台之上，用于观察培养活细胞，含有相差物镜。第16页（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜基本原理基本原理荧光：荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出可见光(波长比入射光长)第17页（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜基本原理基本原理光源和光学系统与普通光学显微镜不一样关键部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成第18页1.1.照明方式通常为落射式照明方式通常为落射式 2.2.光源为紫外光或其它短波光源为紫外光或其它短波 长光长光 3.3.有两个特殊滤光片有两个特殊滤光片 (发射滤片和阻断滤片发射滤片和阻断滤片)第19页荧光显微镜光路系统荧光显微镜光路系统第20页（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜样品制备样品制备免疫荧光技术免疫荧光技术荧光素直接标识技术荧光素直接标识技术绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GFP)基因与编码某种蛋白质基因相融合表示融合表示两种以上荧光素标识同一样品，可同时显示不一样成份在细胞中定位第21页（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜应用应用在光镜水平上，对细胞内特异蛋白质、核酸、糖类、脂质以及一些离子等组分进行定性定位研究有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺纺锤体微管（绿色）锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）中期染色体（蓝色）和原原纤维状蛋白（纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）（红色）等结组成份第22页（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜以激光为光源聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上信息，形成清楚二维图像分辨率比普通荧光显微镜1.41.7倍第23页（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜可经过“光学切片”叠加后重构出样品三维结构Figure9-20 Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)(二向)第24页3DImageReconstructionzxy第25页zxyzyy第26页荧光显微镜（荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（）和激光扫描共焦显微镜（b）第27页二、电子显微镜二、电子显微镜透射电镜透射电镜 transmission electron microscope,TEM扫描电镜扫描电镜 scanning electron microscope,SEM第28页（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜 电子束电子束作为光源电磁透镜电磁透镜聚焦镜筒高度真空真空图像经过荧光屏或感光胶片统计第29页1电子显微镜与光学显微镜基本区分电子显微镜与光学显微镜基本区分Figure9-42(part1of2)Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)第30页 光镜光镜 电镜电镜光源光源 可见光（可见光（300-700nm）电子束电子束 紫外光（紫外光（200nm）分辨率分辨率 200nm 0.2nm透镜透镜 玻璃透镜玻璃透镜 磁透镜磁透镜真空真空 无要求无要求 1.33*10-310-5Pa电子束波长与加速电压相关。当加速电压为电子束波长与加速电压相关。当加速电压为50100千伏千伏时，电子束波长约为时，电子束波长约为0.00530.0037纳米纳米 第31页2电子显微镜分辨本事与有效放大倍数电子显微镜分辨本事与有效放大倍数电子显微镜分辨率分辨率可达0.2nm电镜分辨本事分辨本事是指电镜处于最正确状态下分辨率第32页3电子显微镜基本结构电子显微镜基本结构电子束照明系统电子束照明系统成像系统成像系统真空系统真空系统统计系统统计系统第33页（二）透射电镜制样技术（二）透射电镜制样技术超薄切片技术超薄切片技术戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像第34页超薄切片技术显示细胞超微结构超薄切片技术显示细胞超微结构应用超薄切片技术，几乎能够观察细胞各种超微结构Figure9-45 Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)第35页（二）透射电镜制样技术（二）透射电镜制样技术负染色技术负染色技术观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5nm左右第36页（二）透射电镜制样技术（二）透射电镜制样技术冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术包含冰冻断裂冰冻断裂与蚀刻复型蚀刻复型两步观察膜断裂面上蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感样品不需固定包埋第37页冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片 第38页透射电镜照片与冰冻断裂透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较和冰冻蚀刻电镜照片比较第39页电镜三维重构与低温电镜技术电镜三维重构与低温电镜技术电镜三维重构技术电镜三维重构技术低温电镜技术低温电镜技术电子扫描断层成像技术电子扫描断层成像技术核孔复合物核孔复合物第40页（三）扫描电镜技术（三）扫描电镜技术利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出二次电子成像，能够得到样品表面立体形貌第41页（三）扫描电镜技术（三）扫描电镜技术样品利用CO2临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜普通扫描电镜分辨本事仅为3nmFigure9-49(part1of2)Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)第42页小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较注意样品制备技术差异！第43页三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中隧道效应含有原子尺度高分辨本事能够在真空、大气、液体等各种条件下工作非破坏性测量http:/en.wikipedia.org/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png第44页第二节第二节 细胞及其组分分析方法细胞及其组分分析方法第45页一、用超离心技术分离细胞组分一、用超离心技术分离细胞组分差速离心：差速离心：利用不一样离心速度所产生不一样离心力，将各种质量和密度不一样亚细胞组分和各种颗粒分开差速离心差速离心第46页一、用超离心技术分离细胞组分一、用超离心技术分离细胞组分密度梯度离心：密度梯度离心：经过离心力作用使样品中不一样组分以不一样沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不一样沉降带第47页二、细胞成份细胞化学显示方法二、细胞成份细胞化学显示方法显色剂与细胞组分中特殊基团结合经过显色剂在细胞中定位及颜色深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中分布和相对含量第48页福尔根反应福尔根反应 Feulgen stain特异显示特异显示细胞内呈紫红色DNA 分布分布原理：原理：酸水解能够去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键嘌呤，使脱氧核糖醛基暴露。所暴露自由醛基与希夫试剂（Schiffsreagent）反应呈紫红色第49页三、特异蛋白抗原定位与定性三、特异蛋白抗原定位与定性细胞内特异蛋白显示可经过抗抗原抗体特异结合原抗体特异结合方法得以实现若抗体偶联荧光染料抗体偶联荧光染料，则能够经过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内精细定位，抗体需偶联电子致密抗体需偶联电子致密物物(胶体金)，用电镜观察第50页（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术直接间接免疫荧光直接间接免疫荧光技术（A）间接免疫荧光间接免疫荧光技术（B）第51页（二）免疫电镜技术（二）免疫电镜技术在超微结构水平上研究特异蛋白抗原定位免疫胶体金技术受到越来越多青睐第52页四、细胞内特异核酸定位与定性四、细胞内特异核酸定位与定性原位杂交：原位杂交：用标识核酸探针经过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中位置第53页原位杂交技术原位杂交技术光镜水平同位素标识或荧光素标识探针电镜水平生物素标识探针与抗生物素抗体相连胶体金标识结合第54页FISH(Fluorescent In Situ Hybridization)第55页五、定量细胞化学分析与细胞分选技术五、定量细胞化学分析与细胞分选技术流式细胞术第56页 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中细胞一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中细胞经过高频振荡控制喷嘴，形成包含单个细胞液滴，经过高频振荡控制喷嘴，形成包含单个细胞液滴，在激光束照射下，这些细胞发出散射光和在激光束照射下，这些细胞发出散射光和荧光荧光，经，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可依据这些性质分选出高纯度细胞出统计结果，并可依据这些性质分选出高纯度细胞亚群，分离纯度可达亚群，分离纯度可达99%。（。（flow cytometer）。）。第57页http:/ 含量和细胞表面分子含量含量和细胞表面分子含量2.细胞、细胞组分分选细胞、细胞组分分选第59页第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程http:/ 110 110代以内细胞代以内细胞传代细胞传代细胞 在体外培养条件下连续传代培养细胞在体外培养条件下连续传代培养细胞接触抑制接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停顿分裂贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停顿分裂 生长现象生长现象细胞系细胞系 （Cell line)极少数细胞在传极少数细胞在传1010代后可渡过危代后可渡过危 机而传下去机而传下去40-5040-50代次并代次并仍保持原来染色体二仍保持原来染色体二 倍体数量倍体数量及接触抑制行为及接触抑制行为 有限细胞系有限细胞系 永生细胞系：永生细胞系：细胞发生了遗传改变细胞发生了遗传改变(染色体显著改染色体显著改 变变)，有，有癌变癌变特点特点细胞株细胞株（Cell strain)单个细胞增殖而来，全部细胞含有相单个细胞增殖而来，全部细胞含有相 同遗传性状同遗传性状.第62页当前试验室中惯用几个细胞系当前试验室中惯用几个细胞系细胞系名称细胞系名称细胞类型细胞类型起源3T33T3成纤维细胞成纤维细胞小鼠小鼠HeLaHeLa宫颈癌上皮细胞宫颈癌上皮细胞人人BHK21BHK21成纤维细胞成纤维细胞叙利亚仓鼠叙利亚仓鼠PtKlPtKl上皮细胞上皮细胞袋鼠袋鼠L6L6成肌细胞成肌细胞大鼠大鼠PC12PC12嗜铬细胞嗜铬细胞大鼠大鼠SP2SP2浆细胞浆细胞小鼠小鼠SP2SP20 0骨髓瘤浆细胞骨髓瘤浆细胞小鼠小鼠CHOCHO卵巢细胞卵巢细胞中国地鼠中国地鼠第63页一、细胞培养一、细胞培养植物细胞培养植物细胞培养单倍体细胞培养：单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，经过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株第64页一、细胞培养一、细胞培养植物细胞培养植物细胞培养原生质体培养：原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁原生质体经诱导分化长成植株第65页二、细胞工程二、细胞工程第66页（一）细胞融合与单克隆抗体技术（一）细胞融合与单克隆抗体技术细胞融合细胞融合灭活病毒化学物质（如PEG）电融合同核体同核体（homokaryon）异核体异核体（heterokaryon）合核体合核体（synkaryon）第67页单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体与多克隆抗体第68页单克隆抗体制备单克隆抗体制备第69页（二）显微操作技术与动物克隆（二）显微操作技术与动物克隆细胞拆合：胞质体，核体物理法：机械法或短波光化学法：细胞松弛素显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等第70页克隆羊多莉培育克隆羊多莉培育第71页第四节第四节 细胞及生物大分子动态改变细胞及生物大分子动态改变Martin D N,Baehrecke E H Development;131:275-284第72页一、荧光漂白恢复技术一、荧光漂白恢复技术亲脂性或亲水性荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束照射使某一区域荧光不可逆淬灭因为生物膜流动性，淬灭区荧光强度逐步恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率第73页fluorescence photobleaching recovery，FPRFigure10-36a Molecular Biology of the Cell(GarlandScience)第74页二、单分子技术与细胞生命活动研究二、单分子技术与细胞生命活动研究指在单分子水平上对生物分子行为(构象改变、相互作用、相互识别等）实时动态检测以及在此基础上操纵调控等第75页use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesinFluorescentimageofsinglemotorproteins(left):Motionoftwodiffusingkinesinmolecules(green)onamicrotubule(red)shownasatimeserieskymograph.Schematic(right):Bydraggingdiffusingkinesinmoleculeswithlasertweezersoveramicrotubule,thefrictionforcebetweenthemotoranditsmicrotubuletrackcanbemeasuredveryprecisely第76页三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术在体内分析蛋白质分析蛋白质蛋白质相互作用蛋白质相互作用利用转录激活因子DNA结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才含有完整转录激活功效原理第77页四、荧光共振能量转移技术四、荧光共振能量转移技术(FRET)分子含有不一样能级：分子中外层电子，普通处于电子基态S0(electronicgroundstate)最低振动能级吸收光能以后，它能够被激发到第一电子激发态S1任意振动能级。这过程发生在10-15s时间内被激发分子，首先释放能量回到S1最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1最低振动能级回到S0各振动能级，并以光子形式释放能量，即发射荧光第78页FRET产生条件产生条件D、A都能发荧光D发射光谱和A激发（或吸收）光谱必须有部分重合D和A之间距离必须小于10nm。第79页FRET 基本原理第80页检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用假如两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出荧光可激发另一蛋白产生荧光两个蛋白未相互作用相互作用第81页五、放射自显影技术五、放射自显影技术利用放射性同位素电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：两个主要步骤：即同位素标同位素标识生物大分子前体掺入识生物大分子前体掺入和细细胞内同位素显示胞内同位素显示第82页依据试验要求选择适当同位素依据试验要求选择适当同位素研究DNA合成时通惯用氚（3H）标识3H-TdR研究RNA合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代谢时，用35S标识蛋氨酸和半胱氨酸第83页对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：连续标连续标识识、脉冲标识脉冲标识显微放射自显影显微放射自显影电镜放射自显影电镜放射自显影第84页胰岛胰岛B细胞电镜放射自显影结果细胞电镜放射自显影结果A.3H-亮氨酸脉冲标识完成10分钟后，被标识胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中B.3H-亮氨酸脉冲标识完成45分钟后，被标识胰岛素蛋白进入分泌颗粒内第85页第五节第五节 模式生物与功效基因组研究模式生物与功效基因组研究Figure1-44 Molecular Biology of the Cell,FifthEdition(GarlandScience)第86页一、细胞生物学研究惯用模式生物一、细胞生物学研究惯用模式生物模式生物通常个体较小，轻易培养，操作简个体较小，轻易培养，操作简 单，生长繁殖快单，生长繁殖快因为基因在进化上保守性以及遗传密码通用性，从一个试验生物得到相关基因性质或功效方面信息往往也适合用于其它生物第87页Why do we need model systems?AllcellsaredescendedfromacommonancestorSimplesystemstostudyabiologicalquestionExtrapolate（外推）resultstohigherorganismsAdvantageouscharacteristicsfoundinmodelorganismsAmenabletogeneticmanipulationReproducerapidlyTransparentDefinedcelllineage第88页（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株诱变，分离和判定轻易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行第89页（二）酵母（二）酵母单细胞真核生物代表：芽殖酵母和裂殖酵母，生长快速而且易于遗传操作惯用于白质相互作用、细胞周期、基因表示调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等第90页（三）线虫（三）线虫(Caenorhabditis elegans)遗传背景清楚、生命周期只有3天，成体只有959个细胞，通体透明，便于胚胎发育中细胞分裂、分化以及细胞死亡研究第91页（四）果蝇（四）果蝇(Drosophila melanogaster)基因组序列已测定，与人类基因有很高同源性，在遗传分析、染色体特征研究、胚胎发育基因调控和细胞分化机制研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域研究发挥主要作用第92页（五）斑马鱼（五）斑马鱼(Danio rerio)小型脊椎动物。许多基因与人类基因存在对应关系3个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为第93页（六）小鼠（六）小鼠(Mus musculus)小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最靠近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA干涉以及疾病模型第94页（七）拟南芥（七）拟南芥(Arabidopsis thaliana)十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学研究第95页二、突变体制备技术二、突变体制备技术RNA水平水平RNA 干扰干扰（RNAi）第96页二、突变体制备技术二、突变体制备技术DNA水平水平基因敲除基因敲除(knock out)http:/