生物分离工程第章萃取省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第七章第七章 萃取萃取（ExtractionExtraction）第1页v双水相萃取双水相萃取(Aqueous two-phase extraction)是利用是利用物质在互不相溶两个水相之间分配系数差异实现分离物质在互不相溶两个水相之间分配系数差异实现分离方法。方法。v1955年由Albertson首先提出了双水相萃取概念,今后这项技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都取得了一定进展。v到当前为止,双水相技术几乎在全部生物物质如氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等分离纯化中得到应用,尤其是成功地应用在蛋白质大规模分离中。第三节第三节双水相萃取技术双水相萃取技术第2页 溶液分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，溶液分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也能够形成两相水相也能够形成两相(即双水相系统即双水相系统)甚至多相。于是有可能甚至多相。于是有可能将水溶性酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一将水溶性酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成份离任务。水相中，从而完成份离任务。有机溶剂萃取不足：有机溶剂萃取不足：v许多蛋白质许多蛋白质都有都有极强亲水性，不溶于有机溶剂极强亲水性，不溶于有机溶剂；v蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。第3页第4页聚合物不相溶性：聚合物不相溶性：v主要是因为聚合物分子空间妨碍作用，相互间无法渗主要是因为聚合物分子空间妨碍作用，相互间无法渗透，当聚合物浓度到达一定值时，就不能形成单一透，当聚合物浓度到达一定值时，就不能形成单一水相，所以含有强烈相分离倾向。水相，所以含有强烈相分离倾向。v一些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混合时，只要浓一些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混合时，只要浓度到达一定值，也会形成两相，即聚合物度到达一定值，也会形成两相，即聚合物盐双水相体系盐双水相体系第5页 系统含水量多达系统含水量多达75%75%90%,90%,两相界面张力极低两相界面张力极低,有利于保有利于保持生物活性和强化相际间质量传递持生物活性和强化相际间质量传递 分相时间短分相时间短(尤其是聚合物尤其是聚合物/盐系统盐系统),),自然分相时间普通自然分相时间普通只有只有5 515min15min。双水相萃取技术易于连续化操作。双水相萃取技术易于连续化操作。目标产物分配系数普通大于目标产物分配系数普通大于3,3,大多数情况下大多数情况下,目标产物有目标产物有较高收率。较高收率。大量杂质能够与全部固体物质一起去掉大量杂质能够与全部固体物质一起去掉,与其它惯用固液与其它惯用固液分离方法相比分离方法相比,双水相萃取技术可省去双水相萃取技术可省去1 12 2 个分离步骤个分离步骤,使使整个分离过程更经济。整个分离过程更经济。设备投资费用少设备投资费用少,操作简单操作简单,不存在有机溶剂残留问题。不存在有机溶剂残留问题。双水相萃取技术优点双水相萃取技术优点第6页一、一、双水相分离理论双水相分离理论1、双水相形成双水相形成v熵增熵增混合混合自发自发v分子间作用力分子间作用力-伴随伴随Mr增加增加,而增大而增大.v聚合物不相容性聚合物不相容性-含有聚合物分子溶液发生分含有聚合物分子溶液发生分相现象相现象.惯用聚合物：惯用聚合物：聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇无机盐系统聚乙二醇无机盐系统无毒标准无毒标准第7页第8页2、相图、相图 临界点临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差异消失,任何溶质在两相中分配系数均为1。如C点。均相区两相区双节线系线第9页v聚合物分子量越高，聚合物分子量越高，相分离所需浓度越低相分离所需浓度越低v两种聚合物分子量相两种聚合物分子量相差越大，双节线形状越差越大，双节线形状越不对称不对称。第10页3、物质在两相中分配、物质在两相中分配 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中分配用分配系数和溶剂萃取法一样，物质在两水相中分配用分配系数K表示。表示。CTK=CBCt、CB分别代表分别代表上相、下相中溶质浓度上相、下相中溶质浓度K与温度、压力以及溶质和溶剂性质相关，与溶质浓度无关。与温度、压力以及溶质和溶剂性质相关，与溶质浓度无关。1）表面自由能影响）表面自由能影响(大分子物质表面性质对大分子物质表面性质对K影响很大影响很大)2）表面电荷影响）表面电荷影响(盐效应：盐效应：两相系统中如存在盐两相系统中如存在盐,对对K影响较大影响较大)3）综合考虑）综合考虑（影响原因很多，单原因定量很困难，最正确操作条件靠试验影响原因很多，单原因定量很困难，最正确操作条件靠试验）4）影响分配平衡参数）影响分配平衡参数(1)聚合物影响；聚合物影响；(2)体系中无机盐离子影响；体系中无机盐离子影响；(3)体系体系PH影响；影响；(4)体系温度影响；体系温度影响；(5)体系中微生物影响。体系中微生物影响。第11页1）表面自由能影响）表面自由能影响第12页第13页2）表面电荷影响）表面电荷影响道南电位道南电位(,Donnan potential):实际双水相系统中有电解质实际双水相系统中有电解质,当这些离子在两相中当这些离子在两相中K 1,则两相间产生电位差则两相间产生电位差U2，U1相相1 1和相和相2 2电位电位Z+,Z 分别表示一个盐正负离子离子价分别表示一个盐正负离子离子价 FF法拉第常数法拉第常数 T温度温度第14页v深入可证实：深入可证实：InKi*=InKi+ZiF(U2-U1)RTKi*i组分带电时在体系中分配系数组分带电时在体系中分配系数Kii组分不带电时在体系中分配系数组分不带电时在体系中分配系数Zii组分离子价组分离子价第15页意义：意义：A 荷电溶质分配系数对数与溶质荷电溶质分配系数对数与溶质净电荷数成正比净电荷数成正比.B因为同一双水相系统中添加不因为同一双水相系统中添加不一样盐产生一样盐产生不一样不一样,故故k与与Zi关关系因盐而异。系因盐而异。第16页3）综合考虑）综合考虑第17页4）影响分配平衡参数）影响分配平衡参数(1)聚合物影响聚合物影响vA A 聚和物分子量影响聚和物分子量影响 当聚合物分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物相。当聚合物分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物相。比如在比如在PEGDeX系统中，系统中，PEG分子量减小，会使分配系数分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖分子量减小，会使分配系数降低。增大，而葡聚糖分子量减小，会使分配系数降低。这是一条这是一条普遍规律，不论何种成相聚合物系统都适用普遍规律，不论何种成相聚合物系统都适用。第18页vB B 成相聚和物浓度影响成相聚和物浓度影响 当靠近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数靠近当靠近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数靠近于于1。如如成相聚合物总浓度或聚合物盐混合物总浓度增加时，系成相聚合物总浓度或聚合物盐混合物总浓度增加时，系统远离临界点统远离临界点，系线长度也增加，此时两相性质差异也增大系线长度也增加，此时两相性质差异也增大，蛋白质趋向于向一侧分配蛋白质趋向于向一侧分配，即，即分配系数或增大超出分配系数或增大超出1，或减，或减小低于小低于1。第19页(2)体系中无机盐离子影响体系中无机盐离子影响v盐离子在两相中有不一样分配，因而盐离子在两相中有不一样分配，因而在两相间形成电位差在两相间形成电位差，因为各相要保持电中性因为各相要保持电中性，所以对于带电荷蛋白质等物质萃取，所以对于带电荷蛋白质等物质萃取来说来说,盐存在就会使系统电荷状态改变盐存在就会使系统电荷状态改变,从而对分配产生显著从而对分配产生显著影响。影响。v盐种类对双水相萃取也有一定影响盐种类对双水相萃取也有一定影响,所以变换盐种类和添加所以变换盐种类和添加其它种类盐有利于提升选择性。其它种类盐有利于提升选择性。v在不一样双水相体系中盐作用也不相同。在不一样双水相体系中盐作用也不相同。在在PEG/磷酸盐磷酸盐/水中加入氯化钠能够使万古霉素分配系数由水中加入氯化钠能够使万古霉素分配系数由4提升到提升到120,而在而在PEG/DeX/水体系中只从水体系中只从1.55提升到提升到5。第20页(3)体系体系PH影响影响vpH会影响蛋白质中能够离解基团离解度，因而改变蛋白质所会影响蛋白质中能够离解基团离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。带电荷和分配系数。vpH也影响磷酸盐离解程度，若改变也影响磷酸盐离解程度，若改变H2PO4-和和HPO42-之间百之间百分比，也会使相间电位发生改变而影响分配系数。分比，也会使相间电位发生改变而影响分配系数。pH微小微小改变有时会使蛋白质分配系数改变改变有时会使蛋白质分配系数改变23个数量级。个数量级。第21页交交 织织 分分 配配 法法(crosspartitioning):当当加加入入不不一一样样种种类类盐盐时时，因因为为相相间间电电位位不不一一样样，lnlnk kpHpH关关系系曲曲线线也也不不一一样样。但但在在pIpI处处，k k应应相相同同，即即两两条条关关系系曲曲线线交交于于一一点点。所所以以,经经过过测测定定不不一一样样盐盐类类存存在在下下lnlnk kpHpH曲曲线线交交点点,可可测测定定蛋蛋白白质质/细细胞胞器以及微粒器以及微粒pIpI。血清蛋白血清蛋白第22页(4)体系温度影响体系温度影响 温温度度影影响响小小,普普通通温温度度改改变变不不影影响响产产物物萃萃取取。大大规规模模操操作作普普通通在在室室温温下下进进行行,不不需需冷冷却却。这这是是基基于：于：(1)(1)成成相相聚聚合合物物PEGPEG对对蛋蛋白白质质有有稳稳定定作作用用,常常温温下下蛋白质不会发生变性蛋白质不会发生变性;(2)(2)常温下溶液粘度较低常温下溶液粘度较低,轻易相分离轻易相分离;(3)(3)常温操作节约冷却费用常温操作节约冷却费用.第23页二、二、双水相萃取技术应用双水相萃取技术应用 1.双水相萃取法惯用于胞内酶提取和精制。双水相萃取法惯用于胞内酶提取和精制。当前已知胞内酶约当前已知胞内酶约2500种，种，但投入生产极少但投入生产极少。原因原因之一是提取困难之一是提取困难。胞内酶提取第一步系将细胞破碎得。胞内酶提取第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小细胞碎片存在，到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离方法，但非欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离方法，但非常困难。常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶深入精制。双水相系统可用于细胞碎片以及酶深入精制。第24页第25页第26页第27页要成功地利用两水相萃取方法，应满足以下条件：要成功地利用两水相萃取方法，应满足以下条件：要成功地利用两水相萃取方法，应满足以下条件：要成功地利用两水相萃取方法，应满足以下条件：欲提取酶和细胞应分配在不一样相中；欲提取酶和细胞应分配在不一样相中；酶分配系数应足够大，使在一定相体积比时，经酶分配系数应足够大，使在一定相体积比时，经过一次萃取，就能得到高收率；过一次萃取，就能得到高收率；两相用离心机很轻易分离。两相用离心机很轻易分离。第28页工程方面问题工程方面问题 在进行工业应用时，需考虑到达萃取平衡所需时间在进行工业应用时，需考虑到达萃取平衡所需时间和两相分离设备。和两相分离设备。在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能到达平衡，且行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能到达平衡，且能耗也极少。能耗也极少。两相分离则比较困难，这是因为两相密度差低和当处理两相分离则比较困难，这是因为两相密度差低和当处理匀浆液时，粘度较大。因为粘度较高会引发阻塞，可采匀浆液时，粘度较大。因为粘度较高会引发阻塞，可采取自动排渣喷嘴分离机。取自动排渣喷嘴分离机。PEG/盐更适适用重力沉降；盐更适适用重力沉降；PEG/DeX多用离心机多用离心机。第29页第30页在两水相系统中进行生物转化，如酶促反应，能够把产在两水相系统中进行生物转化，如酶促反应，能够把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提升了产率。这物移入另一相中，消除产物抑制，因而提升了产率。这实际上是一个反应和分离耦合过程，有时也称为实际上是一个反应和分离耦合过程，有时也称为萃取生萃取生物转化物转化；假如发生是一个发酵过程，则也称为萃取发酵，；假如发生是一个发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也能够把两水相系统称为因而此时也能够把两水相系统称为两水相反应器。两水相反应器。2.两水相反应器两水相反应器第31页enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeEnzymetic reactionEnzymetic reactionsubstratesubstrateproductproduct第32页enzymeenzymeenzymeEnzymetic reaction with ATPS第33页要进行要进行两水相生物转化两水相生物转化反应应满足以下条件：反应应满足以下条件：催化剂应单侧分配；催化剂应单侧分配；底物应分配于催化剂所处相中；产物应分配在另一底物应分配于催化剂所处相中；产物应分配在另一相中；要有适当相比。如产物分配在上相中，则相相中；要有适当相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。比要大，反之则相比要小。这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，所以这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，所以常需要依据试验选择最优系统和操作条件。常需要依据试验选择最优系统和操作条件。第34页采取两水相系统进行生物转化反应有以下优点：采取两水相系统进行生物转化反应有以下优点：与固定床反应器相比，与固定床反应器相比，不需载体不需载体，不存在多孔载体，不存在多孔载体中扩散阻力，故中扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高反应速度较快，生产能力较高；生物催化剂在两水相系统中生物催化剂在两水相系统中较稳定较稳定；两相间表面张；两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在滴在10m m以下，有很大表面积，以下，有很大表面积，有利于底物和产有利于底物和产物传递。物传递。第35页早早期期双双水水相相萃萃取取过过程程仍仍以以间间歇歇操操作作为为主主。近近年年来来,在在天天冬冬酶酶、乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶、富富马马酸酸酶酶与与青青霉霉素素酰酰化化酶酶等等各各种种产产品品双双水水相相萃萃取取过过程程中中均均采采取取了了连连续操作续操作,有还实现了有还实现了计算机过程控制计算机过程控制。这这不不但但对对提提升升生生产产能能力力,实实现现全全过过程程连连续续操操作作和和自自动动控控制制,确确保保得得到到高高活活性性和和质质量量均均一一产产品品含含有有主主要要意意义义,而而且且也也标标志志着着双双水水相相萃萃取取技技术术在在工工业生产应用正日趋成熟和完善。业生产应用正日趋成熟和完善。三、三、双水相萃取技术发展双水相萃取技术发展第36页双双水水相相分分配配技技术术作作为为一一个个很很有有发发展展前前途途分分离离单单元元,除除了了含含有有上上述述独独特特优优点点外外,也也有有一一些些不不足足之之处处,如如易易乳乳化化、相相分分离离时时间间长长、成成相相聚聚合合物物成成本本较较高高、分分离离效效率率不不高高等等,一一定程度上限制了双水相分配技术工业化推广和应用。定程度上限制了双水相分配技术工业化推广和应用。怎怎样样克克服服这这些些困困难难,已已成成为为国国内内外外学学者者关关注注焦焦点点,其其中中“集集成成化化”概概念念引引人人给给双双水水相相分分配配技技术术注注入入了了新新生生命命力力,双双水水相相分分配配技技术术与与其其它它相相关关生生化化分分离离技技术术进进行行有有效效组组合合,实实现现了了不不一一样样技技术术间间相相互互渗渗透透,相相互互融融合合,充充分分表表达达了了集集成成化优势化优势。比如：。比如：第37页 (1)与与温温度度诱诱导导相相分分离离、磁磁场场作作用用、超超声声波波作作用用、气气溶溶胶胶技技术术等等实实现现集集成成化化,改改进进了了双双水水相相分分配配技技术术中中诸诸如如成成相相聚聚合合物物回回收收困困难难、相相分分离离时时间间较较长长、易易乳乳化化等等问问题题,为为双双水水相相分分配配技技术术深深入入成成熟熟、完完善善并并走走向向工工业业化化奠奠定定了了基基础。础。(2)与与亲亲和和沉沉淀淀、高高效效层层析析等等新新型型生生化化分分离离技技术术实实现现过过程程集集成成,充充分分融融合合了了双双方方优优势势,既既提提升升了了分分离离效效率率,又又简简化化了分离流程。了分离流程。(3)在在生生物物转转化化、化化学学渗渗透透释释放放和和电电泳泳等等中中引引入入双双水水相相分分配配,给给已已经经有有技技术术赋赋予予了了新新内内涵涵,为为新新分分离离过过程程诞诞生生提提供了新思绪。供了新思绪。第38页1.PEG衍生物：在衍生物：在PEG上引入亲和基团或上引入亲和基团或离子基团；离子基团；2.采取多级萃取。采取多级萃取。第39页第40页第四节第四节反胶团萃取反胶团萃取一、一、概述概述反胶团反胶团(ReversedMicelles)是是两性表面活性两性表面活性剂剂在在非极性有机溶剂非极性有机溶剂中中亲水性基团自发地向内聚集亲水性基团自发地向内聚集而成，而成，内含微小水滴内含微小水滴，空间尺度仅为纳米级，空间尺度仅为纳米级集合型集合型胶体胶体。是一个自我组织和排列而成，并具热力学稳。是一个自我组织和排列而成，并具热力学稳定有序结构。定有序结构。第41页v微胶团微胶团：水溶液中水溶液中表面活性剂极表面活性剂极性头朝外，疏水性头朝外，疏水尾部朝内，中尾部朝内，中间形成非极性间形成非极性“核核”水水非极性非极性“核核”极性极性“头头”非极性非极性“尾尾”第42页v反胶团反胶团：非极性有机溶剂中非极性有机溶剂中，表面活性剂极表面活性剂极性头朝内，疏水性头朝内，疏水尾部向外，中尾部向外，中间形成极性间形成极性“核核”非极性有非极性有机溶剂机溶剂极性极性“头头”极性极性“核核”非极性非极性“尾尾”反微团内溶解水称为微水相或水池反微团内溶解水称为微水相或水池反微团内溶解水称为微水相或水池反微团内溶解水称为微水相或水池第43页第44页反胶团微小界面和微小水相含有两个特异性功反胶团微小界面和微小水相含有两个特异性功效：效：(1)含有分子识别并允许选择性透过含有分子识别并允许选择性透过半透膜半透膜功效；功效；(2)在疏水性环境中含有使亲水性大分子如蛋白质等在疏水性环境中含有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性。保持活性。第45页反胶团萃取优点反胶团萃取优点(1)有很高萃取率和反萃取率，并含有选择性；有很高萃取率和反萃取率，并含有选择性；(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便；分离、浓缩可同时进行，过程简便；(3)能处理蛋白质能处理蛋白质(如胞内酶如胞内酶)在非细胞环境中快速失在非细胞环境中快速失活问题；活问题；(4)因为组成反胶团表面活性剂往往含有细胞破壁功效，因为组成反胶团表面活性剂往往含有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取含有活性蛋白质和酶；因而可直接从完整细胞中提取含有活性蛋白质和酶；(5)反胶团萃取技术成本低，溶剂可重复使用等。反胶团萃取技术成本低，溶剂可重复使用等。第46页二、反胶团形成二、反胶团形成1、反胶团结构反胶团结构：在胶体化学中，向在胶体化学中，向水溶液水溶液中加入表面活性剂，中加入表面活性剂，并使其浓并使其浓度超出一定数值时，度超出一定数值时，表面活性剂就会在水相中形成表面活性剂就会在水相中形成胶体或微胶体或微胶团胶团，它是表面活性剂聚集体。其亲水性极性端向外指向水，它是表面活性剂聚集体。其亲水性极性端向外指向水溶液，疏水性非极性溶液，疏水性非极性“尾尾”向内相互聚集在一起。向内相互聚集在一起。当向当向非极性有机溶剂非极性有机溶剂中加入表面活性剂，中加入表面活性剂，并使其浓度超并使其浓度超出一定数值时，出一定数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂聚集体。也会在非极性溶剂内形成表面活性剂聚集体。与在水相中不一样是，其疏水性非极性尾部向外，指向非极与在水相中不一样是，其疏水性非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成微胶团方向相反，性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成微胶团方向相反，因而称之为因而称之为反胶团或反向胶团反胶团或反向胶团。第47页第48页组成反胶团表面活性剂种类：组成反胶团表面活性剂种类：v阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂AOTv阳离子表面活性剂阳离子表面活性剂季铵盐季铵盐v非极性有机溶剂：环己烷，庚烷，非极性有机溶剂：环己烷，庚烷，辛烷等辛烷等分离蛋白质时，分离蛋白质时，使用最多是阴离子型表面活性剂使用最多是阴离子型表面活性剂AOT。第49页2、反胶团物理化学特征及制备、反胶团物理化学特征及制备（1）反胶团物理化学特征反胶团物理化学特征反胶团反胶团临界胶团浓度临界胶团浓度v表面活性剂在非极性有机溶剂中能形成反胶团最小浓度表面活性剂在非极性有机溶剂中能形成反胶团最小浓度反胶团反胶团含水率含水率WW=C水水/C表表W越大，反胶团半径越大越大，反胶团半径越大第50页第51页（2）反胶团制备反胶团制备注入法注入法相转移法相转移法溶解法溶解法第52页v（1）注入法注入法将含有将含有蛋白质水溶液蛋白质水溶液直接直接注入到含有表面性剂注入到含有表面性剂非极性有机溶剂中去非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明溶为止。，然后进行搅拌直到形成透明溶为止。这种方法过程较快并可很好地控制反胶团平均直径含水量。这种方法过程较快并可很好地控制反胶团平均直径含水量。v（2）相转移法相转移法将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活剂将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活剂非极性有机溶剂中形成反胶团非极性有机溶剂中形成反胶团-蛋白质溶液。即蛋白质溶液。即将含蛋白质将含蛋白质水相与含表面活性剂有机相水相与含表面活性剂有机相接触，在迟缓搅拌下，一部分蛋接触，在迟缓搅拌下，一部分蛋白质转入（萃入）有机相。此过程较慢，但最终体系处于稳白质转入（萃入）有机相。此过程较慢，但最终体系处于稳定热力学平衡状态，这种方法可在有机溶剂相中取得较高蛋定热力学平衡状态，这种方法可在有机溶剂相中取得较高蛋白质浓度。白质浓度。v（3）溶解法溶解法对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团（W3-30）有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白）有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质反胶团也是质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质反胶团也是稳定，这也说明反胶团稳定，这也说明反胶团“水池水池”中水与普通水性质是有区分。中水与普通水性质是有区分。第53页1、反胶团萃取原理反胶团萃取原理v蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间表面活性剂层相和水相两宏观相界面间表面活性剂层 ,同邻近蛋同邻近蛋白质分子发生静电吸引而变形白质分子发生静电吸引而变形 ,接着两界面形成含接着两界面形成含有蛋白质反胶团有蛋白质反胶团 ,然后扩散到有机相中然后扩散到有机相中 ,从而实现从而实现了蛋白质萃取。了蛋白质萃取。(可能机理可能机理）v改变水相条件改变水相条件 (如如pHpH值、离子种类或离子强度值、离子种类或离子强度 ),),又可使蛋白质从有机相中返回到水相中又可使蛋白质从有机相中返回到水相中 ,实现反萃实现反萃取过程。取过程。三、三、反胶团萃取理论基础反胶团萃取理论基础第54页第55页2、蛋白质溶解模型、蛋白质溶解模型a、水壳模型：、水壳模型：蛋白质位于水蛋白质位于水池中心，周围存在水层将其与反池中心，周围存在水层将其与反胶团壁隔开；胶团壁隔开；b、半岛模型：、半岛模型：pro表面存在强表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接烈疏水区，该区直接与有机相接触；触；c、pro吸附于反胶团内壁；吸附于反胶团内壁；d、pro疏水区与几个反胶团疏疏水区与几个反胶团疏水尾发生相互作用，被几个小反水尾发生相互作用，被几个小反胶团所胶团所“溶解溶解”。第56页3、影响反胶团萃取作用力、影响反胶团萃取作用力1）决定分配系数分离场）决定分配系数分离场-分离物质间相互作用分离物质间相互作用第57页溶解推进力溶解推进力 静电作用：静电作用：理论上理论上,当溶质所带电荷当溶质所带电荷与表面活性剂相反时与表面活性剂相反时,因因为静电引力作用为静电引力作用,溶质易溶质易溶于反胶团溶于反胶团,溶解率或分溶解率或分配系数较大配系数较大,反之反之,则不能则不能溶解到反胶团相中溶解到反胶团相中左图为左图为pH值对不一样蛋值对不一样蛋白质溶解率急剧改变白质溶解率急剧改变,当当pHpI,即在带正电荷即在带正电荷pH范围内蛋白质溶解率范围内蛋白质溶解率靠近靠近100%,说明说明静电相互静电相互作用作用对蛋白质反胶团萃取对蛋白质反胶团萃取起决定性作用起决定性作用。第58页 空间相互作用空间相互作用 vA.盐浓度增大对盐浓度增大对反胶团相产生脱水效反胶团相产生脱水效应应,含水率含水率W0随盐浓随盐浓度增大而降低度增大而降低,反胶团反胶团直径减小直径减小,空间排阻空间排阻作用增大作用增大,pro溶解下溶解下降。降。第59页B.在各在各propI处处(排除了静电相互作用影响排除了静电相互作用影响)，反胶团萃取试，反胶团萃取试验研究表明验研究表明:伴随伴随M增大增大,pro分配系数分配系数(m,溶解率溶解率)下降。表下降。表明随明随M增大增大,空间排阻作用增大空间排阻作用增大,pro溶解率降低溶解率降低.疏水性相互作用疏水性相互作用aa疏水性各不相同疏水性各不相同,研究表明研究表明,aa或肽或肽m随随aa疏水性增大而疏水性增大而增大增大。蛋白质疏水性影响其在反胶团中溶解形式蛋白质疏水性影响其在反胶团中溶解形式,因而影响因而影响其分配系数其分配系数.疏水性较大疏水性较大pro可能以可能以“半岛式半岛式”形式溶解。形式溶解。所以能够依据所以能够依据pro间间M差异选择性对差异选择性对pro进行萃取分离。进行萃取分离。第60页2）反胶束萃取影响原因）反胶束萃取影响原因v水相水相pH值值v盐离子盐离子种类和浓度种类和浓度v温度温度v蛋白质蛋白质分子量和浓度分子量和浓度v表面活性剂表面活性剂 第61页水相水相pH值值 pH对萃取影响主要表达在改变蛋白质表面电对萃取影响主要表达在改变蛋白质表面电荷上。荷上。在 pH小于蛋白质等电点(PI)时,蛋白质表面带正电荷;大于等电点时,蛋白质带负电荷。AOT是一个阴离子型表面活性剂,它所形成反胶团内表面带负电荷。当水溶液 pH小于蛋白质等电点时,两表面异电荷吸引力使蛋白质萃取率靠近1 0 0%。当pH大于PI时,溶菌酶萃取率急剧下降,直到靠近于零。第62页第63页盐离子种类盐离子种类第64页盐浓度盐浓度盐浓度W0S&ProZ萃取率第65页温度温度v 温度是影响蛋白质萃取率一个主要原因。温度是影响蛋白质萃取率一个主要原因。普普通来说通来说 ,温度增加将使反胶团含水量下降温度增加将使反胶团含水量下降 ,因而因而不利于蛋白质萃取不利于蛋白质萃取。经过提升温度能够实现蛋白。经过提升温度能够实现蛋白质反萃取。质反萃取。第66页蛋白质分子量和浓度蛋白质分子量和浓度v蛋白质分子量对其萃取率有较蛋白质分子量对其萃取率有较大影响。大影响。比如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋比如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶分子白酶分子量分别为量分别为14300、23300、35000,AOT/异辛烷反异辛烷反胶团萃取它们最大萃取率分别约胶团萃取它们最大萃取率分别约为为100%、90%、30%,表明表明分子量越大蛋白质越难萃取分子量越大蛋白质越难萃取。v用用AOT反胶团体系萃取血红蛋反胶团体系萃取血红蛋白时发觉白时发觉,蛋白质浓度高时蛋白质浓度高时,萃取率降低萃取率降低;而蛋白质浓度低时而蛋白质浓度低时,萃取率较高。萃取率较高。第67页表面活性剂表面活性剂v表面活性剂表面活性剂类型类型当前最惯用反胶团或微乳液是当前最惯用反胶团或微乳液是 AOT/AOT/异辛烷体异辛烷体系。系。一是一是AOTAOT形成反胶团较大形成反胶团较大 ,有利于蛋白质有利于蛋白质萃取萃取 ;二是二是AOTAOT形成反胶团时不需加助表面活形成反胶团时不需加助表面活性剂性剂。v表面活性剂表面活性剂浓度浓度当其它条件一定时当其它条件一定时 ,表面活性剂浓度也存在某表面活性剂浓度也存在某临界值。临界值。小于此临界值时小于此临界值时 ,增大表面活性剂浓增大表面活性剂浓度可提升蛋白质萃取率度可提升蛋白质萃取率 ,大于临界值时大于临界值时 ,则无则无显著影响显著影响第68页第69页四、四、反胶团萃取应用反胶团萃取应用v分离蛋白质混合物；分离蛋白质混合物；v 浓缩浓缩-淀粉酶；淀粉酶；v从发酵液中提取胞外酶从发酵液中提取胞外酶；v直接提取胞内酶；直接提取胞内酶；v用于蛋白质复性。用于蛋白质复性。第70页案例一：案例一：经过三步分离操作分离了核糖核酸酶经过三步分离操作分离了核糖核酸酶a、细胞色素细胞色素c和溶菌酶。和溶菌酶。依据原理依据原理1依据原理依据原理2第71页第72页v经过调整经过调整水相水相pHpH值和值和KClKCl浓度浓度来实现三种蛋白质分离。来实现三种蛋白质分离。在在pH=9pH=9时，核糖核酸酶溶解度很小，保留在水相而时，核糖核酸酶溶解度很小，保留在水相而与其它两种蛋白质分离；相分离后得到反胶团相与其它两种蛋白质分离；相分离后得到反胶团相（含细胞色素（含细胞色素C C和溶菌酶）与和溶菌酶）与0.5 mol/L0.5 mol/LKClKCl水溶液接水溶液接触后，细胞色素触后，细胞色素C C被反萃取到水相，而溶菌酶留在反被反萃取到水相，而溶菌酶留在反胶团相；含溶菌酶反胶团与胶团相；含溶菌酶反胶团与2.0 mol/L KCl2.0 mol/L KCl，pHpH值为值为11.511.5水相接触后，将溶菌酶反萃至水相中。水相接触后，将溶菌酶反萃至水相中。第73页案例二：案例二：使用二级混合使用二级混合-分离型萃取流程，用分离型萃取流程，用TOMAC/0.1%辛醇辛醇-异辛烷溶液体系连续分离异辛烷溶液体系连续分离-淀粉酶，浓缩了淀粉酶，浓缩了17倍。倍。(图图)第74页第75页案例三案例三：胞内酶提取胞内酶提取第76页大大量量研研究究工工作作已已经经证证实实了了反反胶胶团团萃萃取取法法提提取取蛋蛋白白质质可可行行性性与与优优越越性性。不不论论是是自自然然细细胞胞还还是是基基因因工工程程细细胞胞中中产产物物都都能能被被分分离离出出来来;不不但但发发酵酵滤滤液液和和浓浓缩缩物物可可经经过过反反胶胶团团萃萃取取进进行行处处理理,就就是是发发酵酵清清液液也也可可一一样样进进行行加加工工。不不但但是是蛋蛋白白质质和和酶酶都都能能被被提提取取,还有核酸、氨基酸和多肽也可顺利地溶于反胶团。还有核酸、氨基酸和多肽也可顺利地溶于反胶团。然然而而反反胶胶团团萃萃取取在在真真正正实实用用之之前前还还有有许许多多有有待待于于研研究究和和处处理理问问题题,比比如如表表面面活活性性剂剂对对产产品品沾沾染染、工工业业规规模模所所需需基基础础数数据据;反反胶胶团团萃萃取取过过程程模模拟拟和和放放大大技技术术等等。尽尽管管如如此此,用用反反胶胶团团萃萃取取法法大大规规模模提提取取蛋蛋白白质质因因为为含含有有成成本本低低、溶溶剂剂可可循循环环使使用用、萃萃取取和和反反萃萃取取率率都都很很高高等等优优点点,正正越越来来越越多多地地为为各各国国科科技技界界和和工工业界所研究和开发。业界所研究和开发。第77页第五节第五节 超临界流体萃取超临界流体萃取（supercritical fluid,SCFsupercritical fluid,SCF）一一.序序言言超临界流体萃取超临界流体萃取：是将：是将超临界流体作为萃取溶剂超临界流体作为萃取溶剂一个萃取技一个萃取技术，它兼有传统术，它兼有传统蒸馏和液液萃取蒸馏和液液萃取特征，是适用面很广一门特征，是适用面很广一门新型分离技术。新型分离技术。超临界流体超临界流体：是状态超出气液共存时最高压力和最高温度下是状态超出气液共存时最高压力和最高温度下物质特有点物质特有点临界点后流体临界点后流体。通常有二氧化碳（。通常有二氧化碳（COCO2 2 ）、）、氮气氮气 （N N2 2 ）、氧化二氮）、氧化二氮 （N N2 2 O O）、乙烯）、乙烯 （C C2 2 H H4 4）、三）、三氟甲烷氟甲烷 （CHFCHF3 3 ）等。）等。第78页第79页超临界流体（超临界流体（SCF）特征）特征物质状态物质状态 密度（密度（g/cm3）粘度粘度(g/cm/s)扩散系数扩散系数(cm2/s)气态(0.6-2)10-3(1-3)10-4 0.1-0.4液态0.6-1.6(0.2-3)10-2(0.2-2)10-5SCF0.2-0.9(1-9)10-4(2-7)10-4 由以上特征能够看出，由以上特征能够看出，超临界流体兼有液体和气体双重超临界流体兼有液体和气体双重特征，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，特征，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，能够更加快地完成传质，到达平衡，促进高效分离过程实能够更加快地完成传质，到达平衡，促进高效分离过程实现现。第80页v超临界流体超临界流体密度靠近液体密度靠近液体，所以含有与液体，所以含有与液体相近溶解能力。相近溶解能力。v超临界流体超临界流体粘度和扩散系数又与气体相近似粘度和扩散系数又与气体相近似，而溶剂低黏度和高扩散系数性质是有利于传而溶剂低黏度和高扩散系数性质是有利于传质。质。v因为以上特点，超临界流体能够快速渗透到因为以上特点，超临界流体能够快速渗透到物体内部溶解目标物质，快速到达萃取平衡。物体内部溶解目标物质，快速到达萃取平衡。第81页二、二、超临界流体萃取原理超临界流体萃取原理 物质之间溶解能力主要取决于物质分子之间相同性，一物质之间溶解能力主要取决于物质分子之间相同性，一是分子结构相同，二是分子间作用力相同是分子结构相同，二是分子间作用力相同。而分子结构之间。而分子结构之间相同相溶在很大程度上也能够归结到作用能相同上。真空或相同相溶在很大程度上也能够归结到作用能相同上。真空或萃取剂分子密度极低时，溶剂对溶质作用能极小，溶质溶解萃取剂分子密度极低时，溶剂对溶质作用能极小，溶质溶解度也就极小了。度也就极小了。真空真空“溶解溶解”物质能力极低。加入超临界气体萃取溶剂物质能力极低。加入超临界气体萃取溶剂（靠近于液体密度），溶质溶解度与真空中溶解度相比，大（靠近于液体密度），溶质溶解度与真空中溶解度相比，大幅度增加（一亿多倍）。幅度增加（一亿多倍）。第82页第83页在超临界流体萃取中，主要是溶剂流体在超临界流体萃取中，主要是溶剂流体密度密度大大幅度增加造成溶剂对溶质幅度增加造成溶剂对溶质作用力大幅度增加作用力大幅度增加，从而，从而形成了溶解物质能力，这个特征给溶剂流体回收、形成了溶解物质能力，这个特征给溶剂流体回收、溶剂与溶质分离带来方便。溶剂与溶质分离带来方便。在超临界萃取后在超临界萃取后分离操作中，可在与萃取温度分离操作中，可在与萃取温度相同条件下，降低压力使溶剂密度下降，引发其溶相同条件下，降低压力使溶剂密度下降，引发其溶解物质能力下降，就能够方便地进行萃取物与溶剂解物质能力下降，就能够方便地进行萃取物与溶剂分离。分离。第84页提升提升萃取剂选择性萃取剂选择性基本标准是：基本标准是：按按相同相溶标准相同相溶标准，选取超临界流体与被萃，选取超临界流体与被萃取物质取物质化学性质越相同，溶解能力就越大。化学性质越相同，溶解能力就越大。从操作角度看，使用超临界流体为萃取剂从操作角度看，使用超临界流体为萃取剂时时操作温度越靠近临界温度，溶解能力也越操作温度越靠近临界温度，溶解能力也越大。大。第85页惯用萃取剂惯用萃取剂v极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难）极性萃取剂：乙