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第五章第五章 生物技术原理生物技术原理 第1页二十一世纪是生命科学与生物技术世纪，生物技术被世界各国视为一项高新技术，广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工能源等各行各业，正在对人类社会生活产生深远影响。第2页传统生物技术传统生物技术:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶当代生物技术当代生物技术:20:20世纪世纪7070年代末年代末8080年代初年代初,基因工程基因工程 生物技术生物技术生生物物技技术术也也称称为为生生物物工工程程，是是指指以以当当代代生生命命科科学学为为基基础础，结结合合其其它它基基础础学学科科科科学学原原理理，采采取取先先进进工工程程技技术术伎伎俩俩，改改造造或或重重新新设设计计细细胞胞遗遗传传物物质质，按按照照预预先先设设计计改改造造生生物物体体，取取得得优优良良品品质质动动物物、植植物物和和微微生生物物品品系系，或或加加工工生生物物原原料料，为为人人类类生生产产出出所所需需产产品品，到到达达提提升升社社会会生生产力和生活质量目标。产力和生活质量目标。基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程蛋白质工程蛋白质工程生物技术生物技术第3页第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第三节第三节 酶工程酶工程第四节第四节 发酵工程发酵工程第五节第五节 蛋白质工程蛋白质工程第六节第六节 分子杂交与遗传标识分子杂交与遗传标识 生物技术发展日新月异，新结果层出不穷，了解生物技术原生物技术发展日新月异，新结果层出不穷，了解生物技术原理有利于了解和利用生物技术为社会服务。理有利于了解和利用生物技术为社会服务。意在经过本章学习，到达了解生物技术基本原理目标。意在经过本章学习，到达了解生物技术基本原理目标。第4页第一节第一节 基因工程操作原理（基因工程操作原理（P133P133）n一、什么是基因工程一、什么是基因工程n二、基因工程操作技术及原理二、基因工程操作技术及原理第5页一、一、什么是基因工程什么是基因工程v概念概念：也叫也叫基因操作基因操作遗传工程遗传工程重组重组DNA技术技术v基因工程主要原理基因工程主要原理v基因工程四个步骤基因工程四个步骤用人工方法，把生物遗传物质分离出来，在体外进用人工方法，把生物遗传物质分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表行基因切割、连接、重组、转移和表达技术。达技术。克隆目标基因，取得所需要克隆目标基因，取得所需要DNA特异片段。特异片段。与与DNA载体连接成重组载体连接成重组DNA。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第6页（一）核酸分子提取技术（一）核酸分子提取技术（二）电泳技术（二）电泳技术（三）各种酶使用（三）各种酶使用（四）基因克隆（四）基因克隆（五）体外重组（五）体外重组（六）载体构建（六）载体构建（七）转化（七）转化（八）重组体筛选与判定（八）重组体筛选与判定（九）培育新型品种（九）培育新型品种二、基因工程操作技术及原理二、基因工程操作技术及原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第7页v分类：分类：v方法：方法：（一）核酸分子提取技术（一）核酸分子提取技术RNARNA提取提取总总DNADNA提取提取质粒质粒DNADNA提取提取 首先首先，粉碎组织细胞；，粉碎组织细胞；其次其次，DNADNA用乙醇等进行沉淀；用乙醇等进行沉淀；最终最终，用苯酚、氯仿等洗涤，用苯酚、氯仿等洗涤 纯化。纯化。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第8页（二）电泳技术（二）电泳技术带电物质在电场中向相反电极移动现象称为电泳。带电物质在电场中向相反电极移动现象称为电泳。各种生物大分子在一定各种生物大分子在一定pHpH值条件下，能够解离成带值条件下，能够解离成带电荷离子，在电场中会向相反电极移动。电荷离子，在电场中会向相反电极移动。v分类：分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。场凝胶电泳。v概念：概念：第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第9页总总RNARNA总总DNADNA质粒质粒DNADNA第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第10页第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（三）各种酶使用（三）各种酶使用1 1、限制性内切酶使用、限制性内切酶使用v分类分类：型酶、型酶、型酶型酶和和型酶。型酶。v概念概念：是一类能识别是一类能识别双链双链DNADNA中特殊核苷酸序中特殊核苷酸序列，并在适当条件下使列，并在适当条件下使每一条链一定位点上磷每一条链一定位点上磷酸二酯键断开，产生含酸二酯键断开，产生含有有3-OH3-OH基团和基团和5-P5-P基基团团DNADNA片段内切脱氧核糖片段内切脱氧核糖核酸酶。核酸酶。第11页用用质粒质粒构建构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理重组重组DNADNA分子分子第12页用用噬菌体噬菌体DNADNA构建构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理重组重组DNADNA分子分子第13页限制性内切酶造成限制性内切酶造成粘性末端粘性末端有利于重组有利于重组DNA DNA 分分子构建子构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第14页2 2、DNADNA连接酶使用连接酶使用vDNA连接酶连接酶能够催化含有能够催化含有3-OH基团和基团和5-P基团基团DNA片段之间形成片段之间形成磷酸二酯键。磷酸二酯键。在基因克隆中在基因克隆中用来连接载体用来连接载体与目标基因。与目标基因。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第15页vDNA聚合酶能够使单核苷酸经过磷酸二酯键加在寡核苷酸聚合酶能够使单核苷酸经过磷酸二酯键加在寡核苷酸3-OH端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是含有耐热性质端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是含有耐热性质DNA聚合酶分离极大促进了基因等聚合酶分离极大促进了基因等DNA片段体外合成与扩增技术发片段体外合成与扩增技术发展。展。3 3、DNADNA聚合酶使用聚合酶使用第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第16页4 4、逆转录酶使用、逆转录酶使用v逆转录酶能够逆转录酶能够RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA，即，即cDNAcDNA（互（互补补DNADNA）。在基因）。在基因克隆中惯用来构克隆中惯用来构建建cDNAcDNA文库。文库。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第17页（四）基因克隆（四）基因克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第18页553333555 5 333 3 55+变性变性(94)复性复性(55)5 5 33P P1 13355+P2+P P1 1P2合成（合成（7272）PCR普通用普通用PCR PCR 扩增扩增方法，依据已知方法，依据已知基因序列设计引基因序列设计引物来克隆基因。物来克隆基因。1、克隆已知基、克隆已知基因序列基因因序列基因第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第19页第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理v在某种植物在某种植物同源基因被克同源基因被克隆条件下，可隆条件下，可先构建先构建cDNA cDNA 文库或基因组文库或基因组文库，然后以文库，然后以该基因（或部该基因（或部分序列）为探分序列）为探针来筛选目标针来筛选目标基因克隆。基因克隆。第20页v作图克隆技术是伴随分子标识作图克隆技术是伴随分子标识图谱建立而发展起来基因克隆技图谱建立而发展起来基因克隆技术。依据连锁图谱定位基因来克术。依据连锁图谱定位基因来克隆目标基因。克隆植物分子连锁隆目标基因。克隆植物分子连锁图谱定位基因，可采取作图克隆图谱定位基因，可采取作图克隆策略。作图克隆是从连锁标识出策略。作图克隆是从连锁标识出发，经过大片段克隆（发，经过大片段克隆（BACBAC或或YACYAC库）染色体步移抵达靶基因。库）染色体步移抵达靶基因。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理3 3、作图克隆、作图克隆v依据基因产物蛋白质克隆基因。首先依据已知生化缺点或特征确认与该依据基因产物蛋白质克隆基因。首先依据已知生化缺点或特征确认与该功效相关蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备对应抗体；或测定其氨基酸功效相关蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备对应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能序列，推测可能mRNAmRNA序列，依据序列，依据mRNAmRNA序列设计对应核苷酸探针或寡核苷酸序列设计对应核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行PCRPCR扩增。扩增。2 2、功效克隆、功效克隆第21页第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（1 1）消减杂交法）消减杂交法（2 2）DNA DNA 标签法标签法（3 3）差异显示技术）差异显示技术包含：包含：mRNA mRNA 差异显示法等。差异显示法等。（4 4）缺点互补和反义）缺点互补和反义mRNAmRNA技术技术（5 5）cDNAcDNA微阵列和基因芯片技术微阵列和基因芯片技术4、表型差异克隆表型差异克隆v利用表型差异或组织器官特异表示产生差异来克隆基因。利用表型差异或组织器官特异表示产生差异来克隆基因。第22页 利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系能够分离能与已知靶蛋白质相隆基因，如酵母双杂交体系能够分离能与已知靶蛋白质相互作用蛋白质编码基因。互作用蛋白质编码基因。5、染色体大片段基因克隆、染色体大片段基因克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第23页第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理是将带有目标基因外源是将带有目标基因外源DNA片段连接到能够自我复制片段连接到能够自我复制并含有选择标识载体分子上，形成重组并含有选择标识载体分子上，形成重组DNA分子。分子。（五）体外重组（五）体外重组第24页 理想运载体理想运载体是质粒，当给它是质粒，当给它安装一段外来安装一段外来 DNADNA片段后，它片段后，它依然如故地进行依然如故地进行自我复制。自我复制。（六）载体构建（六）载体构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第25页（1）农杆菌介导转化）农杆菌介导转化法：法：将外植体放入农杆将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后组织和抗性芽，生根后抗性植株移栽至营养钵抗性植株移栽至营养钵培养。培养。（七）转化（七）转化1、植物转基因技术、植物转基因技术第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第26页又称又称微弹轰击法微弹轰击法。其。其基本原理基本原理是将外源是将外源DNADNA包被包被在微小金粒或钨粒表面，然后在高压作用下，在微小金粒或钨粒表面，然后在高压作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上外源微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上外源DNADNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表示，从而实现基因转化，示，从而实现基因转化，（2）基因枪法）基因枪法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第27页 利用植物在开花、受精过程中形成花粉管通道，将外源利用植物在开花、受精过程中形成花粉管通道，将外源DNADNA导入受精卵细胞，并深入地被整合到受体细胞基因组中，伴随导入受精卵细胞，并深入地被整合到受体细胞基因组中，伴随受精卵发育而成为带转基因新个体。受精卵发育而成为带转基因新个体。（3）花粉管通道法）花粉管通道法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理8080年代早期周光宇年代早期周光宇转基因抗虫棉转基因抗虫棉不依赖组织培养不依赖组织培养第28页首先制备植首先制备植物原生质体，游物原生质体，游离出细胞，在倒离出细胞，在倒置显微镜和显微置显微镜和显微操作器帮助下，操作器帮助下，将目标基因将目标基因DNA经过微管注射到经过微管注射到受体细胞中。受体细胞中。（4）微注射法）微注射法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第29页 在在短短时时间间高高压压直直流流电电脉脉冲冲冲冲击击下下，能能够够使使原原生生质质膜膜分分子子疏疏松松，形形成成暂暂时时性性直直径径为为3 34 4 nmnm小小孔孔，但但对对原原生生质质体体生生活活力力影影响响不不大大。这这时时，存存在在于于原原生生质质体体周周围围溶溶液液中中外外源源DNADNA，就就能能够够经经过过这这种种小小孔进入原生质体，实现基因直接转移。孔进入原生质体，实现基因直接转移。（5）电穿孔法）电穿孔法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理 原生质体在短时间微束激光照射下，可在质膜表面形成面积约原生质体在短时间微束激光照射下，可在质膜表面形成面积约0.25 m0.25 m2 2左右小孔，使左右小孔，使DNADNA分子进入细胞分子进入细胞。（6 6）微束激光打孔法）微束激光打孔法第30页 世界上主要有世界上主要有4 4类已报道方法：类已报道方法：1 1）融融正正当当，包包含含精精子子融融介介法法，微微细细胞胞介导融合等。介导融合等。2 2）化化学学法法，包包含含DNA-DNA-磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀法法、DEAE-DEAE-葡聚糖法、染色体介导法。葡聚糖法、染色体介导法。3 3）物物理理法法，包包含含显显微微注注射射法法、电电脉脉冲冲法、细胞冻存法等。法、细胞冻存法等。4 4）病病毒毒感感染染法法，包包含含重重组组DNADNA病病毒毒感感染染、重组重组RNARNA病毒感染等。病毒感染等。真正成熟方法真正成熟方法显微注射显微注射DNADNA法法精子介导法精子介导法核移植法核移植法2、转基因动物技术、转基因动物技术第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第31页核显微注射法核显微注射法是转基因技术中是转基因技术中最惯用方法最惯用方法。它是在显微镜下将外。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞原核内，源基因注射到受精卵细胞原核内，注射外源基因与胚胎基因组融注射外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最终移植到受体母畜子宫内发育，合，然后进行体外培养，最终移植到受体母畜子宫内发育，这么这么分娩动物体内每一个细胞都含有新分娩动物体内每一个细胞都含有新DNA DNA 片段。片段。（1 1）核显微注射法）核显微注射法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理缺点：缺点：效率低效率低表示结果不确定性表示结果不确定性动物利用率低等动物利用率低等在反刍动物：繁殖周期长，较强时间限制、需要大量受体动物。在反刍动物：繁殖周期长，较强时间限制、需要大量受体动物。第32页精精子子介介导导基基因因转转移移是是把把精精子子作作适适当当处处理理后后，使使其其含含有有携携带带外外源源基基因因能能力力。然然后后，用用携携带带有有外外源源基基因因精精子给母畜授精。子给母畜授精。优优点点：成成本本很很低低，只只有有显显微注射法成本微注射法成本1 11010。因因为为它它不不包包括括对对动动物物进进行行手手术术处处理理，所所以以，能能够够用用生产牛群或羊群进行试验。生产牛群或羊群进行试验。（2 2）精子介导基因转移）精子介导基因转移第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第33页先把外源基因与供体先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞核移植到受体细胞去核去核卵母细胞，组成重建胚，卵母细胞，组成重建胚，再把其移植到假孕母体，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得待其妊娠、分娩，便可得到转基因克隆动物。到转基因克隆动物。（3 3）核移植转基因法）核移植转基因法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第34页v遗传检测法遗传检测法v物理检测法物理检测法v菌落或噬菌斑杂交筛选法菌落或噬菌斑杂交筛选法v免疫化学检测法免疫化学检测法vDNA蛋白质筛选法蛋白质筛选法v转译筛选法等转译筛选法等（八）重组体筛选与判定（八）重组体筛选与判定技术方法技术方法:第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第35页草甘磷是一个广谱除草剂，将含有抗草甘磷草甘磷是一个广谱除草剂，将含有抗草甘磷EP2SPEP2SP合成合成酶突变基因引入植物，就可使植物取得抗除草剂特征，酶突变基因引入植物，就可使植物取得抗除草剂特征，使大田作物便于除草，农业操作简便。使大田作物便于除草，农业操作简便。（九）培育新型品种（九）培育新型品种第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第36页在食品工业方面在食品工业方面可提升微生物菌种可提升微生物菌种性能，经过基因工性能，经过基因工程改造面包酵母中程改造面包酵母中麦芽糖透性酶和麦麦芽糖透性酶和麦芽糖酶含量比普通芽糖酶含量比普通面包酵母高，产生面包酵母高，产生二氧化碳气体量也二氧化碳气体量也较高，可制作出更较高，可制作出更松软可口面包。松软可口面包。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第37页 凝乳酶凝乳酶传统方法传统方法是从小牛胃中提取，是从小牛胃中提取，成本高，产量低，成本高，产量低，20 20 世纪世纪80 80 年代以年代以来，将凝乳酶原基来，将凝乳酶原基因导入大肠杆菌，因导入大肠杆菌，成功地进行了大规成功地进行了大规模生产。模生产。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第38页美国基因重组抗霜菌，洒在植物上可抗霜冻。美国基因重组抗霜菌，洒在植物上可抗霜冻。当前，基因工程作物主要有玉米、大豆、水稻、当前，基因工程作物主要有玉米、大豆、水稻、棉花、马铃薯、番茄、烟草等。棉花、马铃薯、番茄、烟草等。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第39页第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第40页“多多莉莉”轰轰动动了了世世界界；“克克隆隆人人”让让人人匪匪夷夷所所思思；将将人人类类干干细细胞胞加加到到动动物物早早期期发发育育胚胚胎胎中中，造造成成猪猪体体内内流流人血，老鼠长着人类脑细胞，小鼠背上长人耳人血，老鼠长着人类脑细胞，小鼠背上长人耳。第二节第二节 细胞工程操作原理（细胞工程操作原理（P139P139）一、什么是细胞工程一、什么是细胞工程二、细胞工程技术与原理二、细胞工程技术与原理第41页细胞工程：细胞工程：按照人按照人们需要和科学设计们需要和科学设计改变细胞遗传基础，改变细胞遗传基础，并经过无菌操作，并经过无菌操作，细胞融合，核质移细胞融合，核质移植，染色体移植以植，染色体移植以及组织和细胞培养及组织和细胞培养等技术，重组细胞等技术，重组细胞结构和内含物，以结构和内含物，以改变生物结构和功改变生物结构和功效，快速繁殖和培效，快速繁殖和培养出人们所需要新养出人们所需要新物种生物工程技术。物种生物工程技术。一、什么是细胞工程一、什么是细胞工程第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第42页（一）细胞融合技术（一）细胞融合技术细胞融合，细胞融合，又称细胞杂交：是指在离体条件下用人工方法使又称细胞杂交：是指在离体条件下用人工方法使两个或两个以上细胞相互接触后，造成细胞合并形成一个新细两个或两个以上细胞相互接触后，造成细胞合并形成一个新细胞过程。胞过程。二、细胞工程技术与原理二、细胞工程技术与原理第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理自然融合自然融合人工诱导融合人工诱导融合通常所说细胞融合指人工诱导融合。通常所说细胞融合指人工诱导融合。第43页1 1、制备原生质体、制备原生质体2 2、诱导细胞融合、诱导细胞融合 3 3、筛选杂合细胞、筛选杂合细胞 细胞融合技术主要步骤细胞融合技术主要步骤:第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第44页克克隆隆技技术术：从从同同一一个个亲亲代代细细胞胞形形成成一一组组细细胞胞，形形成成大大量量子子细细胞胞无无性性繁繁殖殖过过程程，这这些些子子细细胞胞和和亲亲代代细细胞胞完完全全相相同同，多多莉莉 诞诞生生意意味味着着人人类类能能够够利利用用动动物物一一个个组组织织细细胞胞“复复印印”出大量相同生命体，这个过程称为克隆技术。出大量相同生命体，这个过程称为克隆技术。（二）克隆技术（二）克隆技术第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第45页生物克隆原理第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第46页 染色体工程是按染色体工程是按照预先设计，添加、照预先设计，添加、消除或替换同种或异消除或替换同种或异种染色体全部或一部种染色体全部或一部分，从而到达定向改分，从而到达定向改变生物遗传性状或选变生物遗传性状或选育新品种目标。育新品种目标。比如，向小麦中比如，向小麦中添加黑麦染色体形成添加黑麦染色体形成小黑麦附加系、代换小黑麦附加系、代换系等，为染色体研究系等，为染色体研究和育种提供新材料。和育种提供新材料。（三）染色体工程（三）染色体工程第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第47页 将动物一个早期胚将动物一个早期胚胎如胎如8 8细胞胚取出并在动细胞胚取出并在动物体外进行分割后，把物体外进行分割后，把分割胚胎都移植到母体分割胚胎都移植到母体内，结果得到由多个胚内，结果得到由多个胚胎细胞克隆而成生物。胎细胞克隆而成生物。（五）胚胎分割和移植技术（五）胚胎分割和移植技术第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理 细胞质工程又称细胞拆合工程，是经过物理或化学方细胞质工程又称细胞拆合工程，是经过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不一样细胞间核质重新法将细胞质与细胞核分开，再进行不一样细胞间核质重新组合，细胞质置换重建成新细胞。组合，细胞质置换重建成新细胞。（四）细胞质工程（四）细胞质工程第48页 细胞核转移技术就是细胞核转移技术就是将一个细胞细胞核取出，将一个细胞细胞核取出，移入另外一个除去了细胞移入另外一个除去了细胞核细胞中，组成一个完整核细胞中，组成一个完整细胞。细胞。该技术是体细胞克隆该技术是体细胞克隆技术基础。技术基础。（六）细胞核转移技术（六）细胞核转移技术第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第49页（七）干细胞工程（七）干细胞工程第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理干细胞工程干细胞工程是利用干细是利用干细胞增殖特征，多分化潜能及胞增殖特征，多分化潜能及其增殖分化高度有序性，经其增殖分化高度有序性，经过体外培养干细胞、诱导干过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化或利用转基因细胞定向分化或利用转基因技术处理干细胞以改变其特技术处理干细胞以改变其特征方法。征方法。第50页（八）大规模细胞（八）大规模细胞组织培养技术组织培养技术第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第51页第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第52页第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第53页生物体生物体机器机器酶酶复杂高效化学反应。复杂高效化学反应。胃分泌胃蛋白酶胃分泌胃蛋白酶胰脏分泌淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶胰脏分泌淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶第三节第三节 酶工程（酶工程（P142P142）一、酶工程概念和内容一、酶工程概念和内容二、酶分析技术二、酶分析技术三、三、酶生产酶生产四、四、酶提取和分离纯化酶提取和分离纯化五、五、酶固定化方法酶固定化方法六、六、酶应用酶应用 第54页酶酶是一个在生物体内含有新陈是一个在生物体内含有新陈代谢催化剂作用蛋白质。含有代谢催化剂作用蛋白质。含有反应效率高、条件温和、反应反应效率高、条件温和、反应产物污染小、能耗低和反应易产物污染小、能耗低和反应易控制等特点。控制等特点。酶工程酶工程又称酶工艺学，就是利又称酶工艺学，就是利用酶催化作用，利用酶或者微用酶催化作用，利用酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞生物细胞，动植物细胞，细胞器等，经过工程学伎俩，在一器等，经过工程学伎俩，在一定生物反应器中，将对应原料定生物反应器中，将对应原料转化成所需要产品。转化成所需要产品。一、酶工程概念和内容一、酶工程概念和内容第三节第三节 酶工程酶工程第55页酶工程应用主要集中于食酶工程应用主要集中于食品工业、轻工业、医药工业和品工业、轻工业、医药工业和临床诊疗等方面。临床诊疗等方面。对传统化学工对传统化学工业改造和业改造和“三废三废”处处理等含有很大潜力。理等含有很大潜力。第三节第三节 酶工程酶工程第56页n酶工作效率很高，酶工作效率很高，-淀粉酶在淀粉酶在6015分钟分钟可使两吨淀粉转化为糊精，可使两吨淀粉转化为糊精，若用酸水解须在若用酸水解须在14O15O高温耐酸设备中最高温耐酸设备中最少进行少进行2小时。小时。n当前，人们把酶工程分为当前，人们把酶工程分为生物酶工程和化学酶工程生物酶工程和化学酶工程。第三节第三节 酶工程酶工程第57页 主要任务是：主要任务是：(1)(1)采取基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物采取基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物反应器大量生产酶。当前已成功地生产了反应器大量生产酶。当前已成功地生产了 lOO lOO各种酶。各种酶。(2)(2)经过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传经过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶性修饰酶(突变酶突变酶)。(3)(3)设计新酶基因，合成自然界不曾有新酶。即使生物酶工设计新酶基因，合成自然界不曾有新酶。即使生物酶工程技术发展尚处于幼年时代，但它将开创从分子水平依据程技术发展尚处于幼年时代，但它将开创从分子水平依据遗传设计蓝图，创造出超自然生物机器新时代。遗传设计蓝图，创造出超自然生物机器新时代。1 1、生物酶工程、生物酶工程第三节第三节 酶工程酶工程第58页2 2、化学酶工程、化学酶工程(1)(1)自然酶，自然酶，是指由生物材料中分离出来酶。是指由生物材料中分离出来酶。(2)(2)化学修饰酶化学修饰酶又称又称“生物分子工程生物分子工程”，是，是经过对酶分子实施经过对酶分子实施“手术手术”以到达改构和改以到达改构和改性目标。性目标。(3)(3)固定化酶固定化酶，是将酶分子经过吸附、交联、，是将酶分子经过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶作用。含有能重复使用、产物易纯而发挥酶作用。含有能重复使用、产物易纯化、可用微电脑控制，实施自动化连续化生化、可用微电脑控制，实施自动化连续化生产等优点。产等优点。(4)(4)人工合成酶人工合成酶，模拟酶催化功效，用化学，模拟酶催化功效，用化学方法合成含有专一性催化剂。方法合成含有专一性催化剂。第三节第三节 酶工程酶工程第59页包含包含酶试剂盒、酶酶试剂盒、酶联免疫、酶标基因探针、联免疫、酶标基因探针、酶传感器酶传感器等等，已经在等等，已经在临床诊疗、生物工艺过临床诊疗、生物工艺过程分析与监控、环境监程分析与监控、环境监测、检疫、生命科学研测、检疫、生命科学研究等方面逐步取代传统究等方面逐步取代传统化学分析法。化学分析法。二、酶分析技术二、酶分析技术第三节第三节 酶工程酶工程酶在分析生物技术领域应用也很广。酶在分析生物技术领域应用也很广。第60页提取法、发酵法和化学合成法提取法、发酵法和化学合成法1 1、提取法：、提取法：直接从动植物或微生直接从动植物或微生物细胞或组织中将酶提取出来。物细胞或组织中将酶提取出来。2 2、发酵法：、发酵法：经过微生物发酵来经过微生物发酵来取得人们所需要酶。取得人们所需要酶。3 3、化学合成法：、化学合成法：采取化学合成方采取化学合成方法取得酶。不过，成本比较高，而法取得酶。不过，成本比较高，而且只能合成已知化学结构酶。且只能合成已知化学结构酶。三、酶生产三、酶生产第三节第三节 酶工程酶工程第61页 1 1、细胞破碎处理、细胞破碎处理机械破碎法：机械破碎法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎。利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎。物理破碎法：物理破碎法：利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎。利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎。化学破碎法：化学破碎法：利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜结构遭到破坏或透性发生改变。胞膜，使细胞膜结构遭到破坏或透性发生改变。酶学破碎法：酶学破碎法：选取适当酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液选取适当酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎。中将原生质体破碎。四、酶提取和分离纯化四、酶提取和分离纯化第三节第三节 酶工程酶工程2 2、酶提取、酶提取过柱法过柱法盐溶液提取法盐溶液提取法碱溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法等有机溶剂提取法等3 3、分离、分离酶分离纯化方法很多，可利用酶相对分子酶分离纯化方法很多，可利用酶相对分子质量大小进行分离纯化，如经过透析方法质量大小进行分离纯化，如经过透析方法分离酶等。分离酶等。第62页1 1、载载体体结结正正当当 载载体体结结正正当当是是指指将将酶酶固固定定到到非非水水溶溶性性载载体体上方法。上方法。物理吸附法、离子结正当、共价结正当。物理吸附法、离子结正当、共价结正当。2 2、交联法：、交联法：经过双功效试剂，将酶和酶联结成网状结构方经过双功效试剂，将酶和酶联结成网状结构方法。交联法使用交联剂是戊二醛等水溶性化合物。法。交联法使用交联剂是戊二醛等水溶性化合物。3 3、包埋法、包埋法 ：将酶包裹在多孔载体中。：将酶包裹在多孔载体中。五、酶固定化方法五、酶固定化方法 第三节第三节 酶工程酶工程酶固定化方法酶固定化方法不下百种，归不下百种，归纳起来大致能纳起来大致能够分为三类：够分为三类：第63页（1 1）高果糖浆）高果糖浆 葡萄糖葡萄糖经过异构化经过异构化果糖。果糖。生产上实际上只有生产上实际上只有42%42%45%45%，其余依然是葡萄糖。，其余依然是葡萄糖。把果葡糖浆中果糖和葡萄糖分离，将分离出来葡萄糖再次把果葡糖浆中果糖和葡萄糖分离，将分离出来葡萄糖再次进行异构化，如此重复屡次，最终混合物中果糖含量能够到达进行异构化，如此重复屡次，最终混合物中果糖含量能够到达70%70%90%90%，形成高果糖浆。，形成高果糖浆。六、酶应用六、酶应用第三节第三节 酶工程酶工程第64页加酶洗衣粉中添加了各种酶制剂，如碱性蛋白酶制剂和碱加酶洗衣粉中添加了各种酶制剂，如碱性蛋白酶制剂和碱性脂肪酶制剂等。性脂肪酶制剂等。对人体没有毒害作用对人体没有毒害作用不会污染环境。不会污染环境。（2）加酶洗衣粉）加酶洗衣粉第三节第三节 酶工程酶工程第65页 肌肉组织中含有胶原蛋白，因为存在着交联键而使肌肉含有肌肉组织中含有胶原蛋白，因为存在着交联键而使肌肉含有很强机械强度。用嫩肉粉处理年老畜禽肌肉，能够使这类肌肉中很强机械强度。用嫩肉粉处理年老畜禽肌肉，能够使这类肌肉中胶原蛋白水解，使肌肉变软而且易于烹调。胶原蛋白水解，使肌肉变软而且易于烹调。第三节第三节 酶工程酶工程（3 3）嫩肉粉）嫩肉粉木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或米曲霉蛋白酶制成。木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或米曲霉蛋白酶制成。第66页 传感器又叫变送器，是一类能将某一个被测物理量变传感器又叫变送器，是一类能将某一个被测物理量变换成便于传送和处理另一个物理量（通常为电量）器件或换成便于传送和处理另一个物理量（通常为电量）器件或装置。比如，验钞器就是一个比较简单传感器。装置。比如，验钞器就是一个比较简单传感器。第三节第三节 酶工程酶工程（4 4）酶传感器）酶传感器第67页菠菠萝萝蛋蛋白白酶酶、纤纤维维素素酶酶、淀淀粉粉酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶等等-胃胃分泌功效障碍。分泌功效障碍。L-L-天冬酰胺酶、白喉毒素天冬酰胺酶、白喉毒素-抗肿瘤，抗肿瘤，胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶-治疗炎症，治疗炎症，激肽释放酶激肽释放酶-降血压，降血压，尿激酶尿激酶-溶解血凝块。溶解血凝块。第三节第三节 酶工程酶工程（5 5）医药医疗）医药医疗第68页 18571857年年，法法国国微微生生物物学学家家巴巴斯斯德德发发觉觉了了发发酵酵原原理理，人人们们才才认认识识到到发发酵酵是是微微生生物物活动结果。活动结果。第四节第四节 发酵工程（发酵工程（P147P147）一、发酵工程概念和内容一、发酵工程概念和内容二、发酵工程操作技术二、发酵工程操作技术三、发酵工程应用三、发酵工程应用四、发酵工程产品四、发酵工程产品氨基酸氨基酸第69页 发酵工程：发酵工程：是指利用微生物特定性状，经过当代化工程是指利用微生物特定性状，经过当代化工程技术，在生物反应器中生产有用物质一个技术系统，或直接技术，在生物反应器中生产有用物质一个技术系统，或直接把微生物应用于工业生产过程一个新技术。把微生物应用于工业生产过程一个新技术。发酵工程内容包含菌种选育、培养基配制、灭菌、扩大发酵工程内容包含菌种选育、培养基配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品分离提纯等方面。培养和接种、发酵过程和产品分离提纯等方面。一、发酵工程概念和内容一、发酵工程概念和内容第四节第四节 发酵工程发酵工程第70页2 2、发发酵酵工工艺艺：:主主要要指指在在最最适适发发酵酵条条件件下下，发发酵酵罐罐中中大大量量培培养养细细胞胞和和生生产产代代谢产物工艺技术。谢产物工艺技术。3 3、下下游游工工程程：:指指从从发发酵酵液中分离和纯化产品技术。液中分离和纯化产品技术。第四节第四节 发酵工程发酵工程发酵工程由三部分组成发酵工程由三部分组成：1 1、上游工程上游工程:包含利用常规方法、基因工程方法、包含利用常规方法、基因工程方法、细胞工程方法等选育优良种株，最适发酵条件（细胞工程方法等选育优良种株，最适发酵条件（pHpH、温度、溶氧和营养组成）确实定，营养物准备等。温度、溶氧和营养组成）确实定，营养物准备等。第71页(一一)菌种选育菌种选育：自然选育、自然选育、诱变诱变育种育种，比如，在，比如，在1943年刚开始生产年刚开始生产青霉素时，青霉素产量只有青霉素时，青霉素产量只有20g/mL左右，经过长久诱变育种，左右，经过长久诱变育种，如今青霉素产量已到达如今青霉素产量已到达85000g/mL以上。以上。（二）培养基配制（二）培养基配制适当培养基对适当培养基对细菌生长非常主要。细菌生长非常主要。（三）灭菌（三）灭菌发酵工程中所用菌种发酵工程中所用菌种大多是单一纯种。大多是单一纯种。（四）扩大培养和接种（四）扩大培养和接种在大规模在大规模发酵生产中，需要屡次扩大培养。发酵生产中，需要屡次扩大培养。二、发酵工程操作技术二、发酵工程操作技术第四节第四节 发酵工程发酵工程第72页 这是发酵工程中心阶段和生产过程。在这个阶段，这是发酵工程中心阶段和生产过程。在这个阶段，除了要随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度等，除了要随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度等，以了解发酵进程外，还要及时添加必需培养基组分，以了解发酵进程外，还要及时添加必需培养基组分，以满足菌种营养需要。同时，要严格控制温度、以满足菌种营养需要。同时，要严格控制温度、pHpH值、值、溶氧、通气量与转速等发酵条件。溶氧、通气量与转速等发酵条件。第四节第四节 发酵工程发酵工程（五）发酵过程（五）发酵过程 20 20世纪世纪6060年代，年代，生物学家将计算机应生物学家将计算机应用到发酵工程中，实用到发酵工程中，实现了对温度、现了对温度、pHpH值、值、通气量、转速等自动通气量、转速等自动统计和自动控制。统计和自动控制。第73页未转基因酵母转基因酵母第四节第四节 发酵工程发酵工程第74页转基因高产转基因高产胡萝卜素胡萝卜素可食酵母体系中试生产可食酵母体系中试生产转基因酵母转基因酵母430-1290ug/g胡萝卜胡萝卜31ug/g第四节第四节 发酵工程发酵工程第75页胰岛素10001000磅牛胰磅牛胰 10 10 克胰岛素克胰岛素200200升发酵液升发酵液 10 10 克胰岛素克胰岛素干扰素12001200升人血升人