生物化学简明教程第四版酶省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第五章 酶(enzyme)第1页酶发展历史酶发展历史1837年，瑞典化学家Berzelius认为发酵是活细胞造成，首先想到催化作用。1857年Pasteur认为酒发酵是酵母(yeast)细胞生命活动结果，细胞破裂则失去发酵作用。1878年Kuhne提出了enzyme，源于希腊语酵母中(in yeast)，汉字：酵素 酶1897年Buchner弟兄用不含酵母细胞提取液完成了发酵，证实酶无生命，只是一个化学物质。Eduard Buchner是第一位提出酵素能够独立出细胞而产生作用，获19诺贝尔化学奖。1926年Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，首次证实酶是蛋白质。1930年Northrop得到胃蛋白酶结晶。1946年Sumner和Northrop取得诺贝尔化学奖。1965年Blake对溶菌酶进行了X-射线衍射分析，酶活性中心催化机理取得了直接而详细解释。1982年Cech发觉个别RNA含有自我催化作用，提出Ribozyme概念。第2页The Nobel Prize in Chemistry 1907for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation (1897)Eduard Buchner 第3页The Nobel Prize in Chemistry 1946for his discovery that enzymes can be crystallized (1926)for their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form James Batcheller Sumner John Howard Northrop Wendell Meredith Stanley 第4页The Nobel Prize in Chemistry 1972for his work on ribonuclease,especially concerning the connection between the amino acid sequence and the biologically active conformation for their contribution to the understanding of the connection between chemical structure and catalytic activity of the active centre of the ribonuclease molecule Christian B.Anfinsen Stanford Moore William H.Stein 第5页The Nobel Prize in Chemistry 1989for their discovery of catalytic properties of RNA (1982)Sidney Altman Thomas R.Cech 第6页酶是生物酶是生物催化剂。催化剂。酶概念第7页酶化学本质绝大多数是蛋白质绝大多数是蛋白质以后发觉有些核酸也含有催化活性以后发觉有些核酸也含有催化活性如：如：L19RNA，核糖核酸酶，核糖核酸酶Pribozyme：核酶：核酶第8页酶催化特征1、催化效率高；2、对环境原因敏感；3、酶活性含有调整性;4、专一性。第9页酶催化效率：比化学催化剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。例 2H2O22H2O+O2 反 应活化能非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol第10页N+3H2熔铁催化剂300-600，200-800Atm2NH3酶对环境原因敏感Legume Nodules第11页酶作用专一性酶作用专一性酶作用专一性结构专一性结构专一性绝对专一性绝对专一性基团专一性基团专一性立体异构专一性立体异构专一性旋光异构专一性旋光异构专一性几何异构专一性几何异构专一性第12页绝对专一性绝对专一性第13页酯酶-葡萄糖苷酶基团专一性基团专一性第14页胰蛋白酶作用位点胰蛋白酶作用位点第15页旋光异构专一性旋光异构专一性第16页（反丁烯二酸）（反丁烯二酸）几何异构专一性几何异构专一性第17页酶分类1.氧化还原酶:A+BH2AH2+B2.转移酶：AR+BA+BR3.水解酶：AB+H2OAOH+BH4.裂解酶ABA+B5.异构酶6.合成酶ABA+B+ATPAB+ADP+Pi第18页六大类酶催化反应性质 1氧化还原酶类（oxido-reductases）（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2。2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）邻苯二酚邻苯醌例：第19页（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢 A2H+B A+B2H 例：乳酸丙酮酸乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）第20页2转移酶类（transferases）催化基团转移 谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：酮戊二酸氨基转移酶）例：第21页3水解酶类（hydrolases）AB+H2O AOH+BH 例：-葡萄糖苷酶第22页4裂合酶类（lyases）从底物移去一个基团而形成双键或逆反应 AB A+B 例：第23页5异构酶类（isomerase）催化异构化反应 例：第24页6合成酶类（synthetases,也称ligases连接酶类）将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。例：第25页酶命名1习惯名称（recommended name）（1）底物：如蛋白酶，脂肪酶（2）反应性质：如脱氢酶，装转氨酶（3）底物和反应性质：如琥珀酸脱氢酶（4）起源或其它特点：如胃蛋白酶 命名依据：第26页1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提出酶命名和分类方法。2系统名称（系统名称（systematic name）（1）标明底物，催化反应性质（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸+丙酮酸丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶 脂肪脂肪+H2O 脂酸脂酸+甘油甘油 脂肪水解酶 第27页酶编号:用4个阿拉伯数字编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1 第28页酶组成 1单纯酶类 2结合酶类 全酶全酶=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子金属离子小分子有机化合物辅酶（coenzyme）辅基（prosthetic group）第29页依据酶蛋白分子特点将酶分成三类 1单体酶（monomeric enzyme）2寡聚酶（oligomeric enzyme）3多酶复合物（multienzyme complex）第30页单体酶单体酶只有只有1条多肽链酶。条多肽链酶。第31页寡聚酶寡聚酶由几个亚基组成酶，亚基之间以非共价键连接。由几个亚基组成酶，亚基之间以非共价键连接。第32页多酶络合物多酶络合物几个酶嵌合而成络合物，几个酶嵌合而成络合物，这些酶功效相关，催化这些酶功效相关，催化一系列连续反应一系列连续反应第33页活性部位活性部位（活性中心）（活性中心）结合基团催化基团酶结构与功效关系酶结构与功效关系酶活性中心（active center）(binding group)(catalytic group)第34页Glu和Asp-COOH组成酶活性中心氨基酸侧链基团主要有组成酶活性中心氨基酸侧链基团主要有Lys-NH2His咪唑基Ser-OHCys-SHTyr侧链基团第35页Active sites may include distant residues.(A)Ribbon diagram of the enzyme lysozyme with several components of the active site shown in color.(B)A schematic representation of the primary structure of lysozyme shows that the active site is composed of residues that come from different parts of the polypeptide chain.活性中心中基团，在一级结构中可能相距较远活性中心中基团，在一级结构中可能相距较远第36页必需基团必需基团活性中心基团都是必需基团活性中心基团都是必需基团活性中心以外基团呢？活性中心以外基团呢？第37页底底 物物 活性中心以外活性中心以外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 第38页胰凝乳蛋白酶His57,Asp102,Ser195组成活性中心Ile16,His57,Asp102,Asp194,Ser195是酶表现活性所必需第39页Enzyme inhibition by diisopropylphosphofluoridate(DIPF),a group-specific reagent.DIPF can inhibit an enzyme by covalently modifying a crucial serine residueSer195必需基团被化学修饰后果：必需基团被化学修饰后果：乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶第40页第41页酶原激活酶原激活胃蛋白酶原(pepsinogen)胰蛋白酶原(trypsinogen)胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen)酶原(zymogen)：不具催化活性酶前体酶原激活：某种物质作用于酶原使之转变为有活 性酶过程。第42页胃蛋白酶原（胃蛋白酶原（pepsinogen）激活）激活 使活性中心得以暴露出来使活性中心得以暴露出来第43页赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝S SS SS SS S464618183 3甘甘异异缬缬组组丝丝S SS SS SS S肠激酶肠激酶肠激酶肠激酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶活性中心活性中心活性中心活性中心胰蛋白酶原激活胰蛋白酶原激活第44页3、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）激活）激活 Three-dimensional structure of chymotrypsin.The three chains are shown in ribbon form in orange,blue,and green.The side chains of the catalytic triad residues,including serine 195,are shown as ball-and-stick representations,as are two intrastrand and interstrand disulfide bonds.第45页酶原激活意义？第46页 同工酶同工酶(isoenzyme or isozyme)同一个属或同一个体不一样组织或同一组织，同一细胞中存在着含有不一样分子形式但却催化相同化学反应酶，称为同工酶。第47页乳酸 丙酮酸 LDH5骨骼肌:乳酸 丙酮酸 心肌:LDH1乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）第48页 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）1、组成和电泳行为 HHHH(LDH1)HHHM(LDH2)HHMM(LDH3)HMMM(LDH4)MMMM(LDH5)第49页不一样分子形式同工酶催化相同化学反应为何会这么？为何会这么？因为它们活性部位在结构上相同或极为相同。因为它们活性部位在结构上相同或极为相同。第50页酶催化作用机理酶催化作用机理活化分子（处于过渡态分子）活化分子（处于过渡态分子）活化能活化能第51页降低反应所需活化能降低反应所需活化能 E+SESEPP+E中间产物学说中间产物学说第52页第53页光谱吸收带645583561 548530498E+E+H2O2+E+H2O2+AH2+E：过氧化物酶中间络合物证据中间络合物证据H2O2+AH2A+2H2O过氧化物酶第54页锁钥学说（锁钥学说（lock and Key theory）1894年 Fischer 提出诱导契合学说（诱导契合学说（induced-fit theory）1958年 Koshland提出第55页羧肽酶诱导契合模式羧肽酶诱导契合模式 底物底物第56页1、邻近定向效应；、邻近定向效应；2、“张力张力”和和“形变形变”；3、酸碱催化；、酸碱催化；4、共价催化、共价催化;5、金属离子催化。、金属离子催化。使酶具高催化效率原因使酶具高催化效率原因第57页两个反应分子，它们反应基团相互靠近。两个反应分子，它们反应基团相互靠近。邻近效应邻近效应ABABABABAB第58页指酶催化基团与底物反应基团之间定向。指酶催化基团与底物反应基团之间定向。定向效应定向效应第59页第60页张力效应和底物形变（张力效应和底物形变（strain and distortion）第61页酸碱催化（酸碱催化（acid-base catalysis）第62页共价催化（共价催化（covalent catalysis）共价催化共价催化 亲电子催化亲电子催化 亲核催化亲核催化第63页酶促反应速度测定酶促反应动力学酶促反应动力学测定反应时间越长越好吗？测定反应时间越长越好吗？应该测定反应初速度应该测定反应初速度研究影响酶促反应速度原因研究影响酶促反应速度原因即底物消耗量很小（普通在即底物消耗量很小（普通在即底物消耗量很小（普通在即底物消耗量很小（普通在5 5 以内）时反应速度以内）时反应速度以内）时反应速度以内）时反应速度第64页酶浓度与反应速度关系酶浓度与反应速度关系vE当当S足够大时，则足够大时，则v=kE第65页底物浓度与反应速度关系底物浓度与反应速度关系第66页当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。SSV VVmaxVmax第67页伴随底物浓度增高伴随底物浓度增高反应速度不再成正百分比加速；反反应速度不再成正百分比加速；反应为混合级反应。应为混合级反应。SSV VVmaxVmax第68页当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应SSV VVmaxVmax第69页（米氏方程）（米氏方程）第70页k2k3k2k3=令：（米氏常数）（米氏常数）k2k3k3Et=E+ESk3k3第71页米氏常数意义米氏常数意义当当时：时：所以，米氏常数涵义是：当反应速度为最大反应所以，米氏常数涵义是：当反应速度为最大反应速度二分之一时，底物浓度速度二分之一时，底物浓度第72页Km是酶一个特征性常数只与酶性质相关，与酶浓度无关第73页当酶能催化几个不一样底物时，当酶能催化几个不一样底物时，Km值一样吗？值一样吗？如己糖激酶：以葡萄糖为底物时，如己糖激酶：以葡萄糖为底物时，km=0.15mmol/L 以果糖为底物时，以果糖为底物时，km=1.5mmol/L哪个是最适底物？哪个是最适底物？第74页Km除了与底物类别相关外，还与哪些原因相关？除了与底物类别相关外，还与哪些原因相关？pH温度温度但与酶浓度和底物浓度无关但与酶浓度和底物浓度无关所以所以km值是酶一个特征性常数值是酶一个特征性常数第75页怎样测定米氏常数？怎样测定米氏常数？（1）v对对S作图作图 第76页双倒数作图法（双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）作图法）米氏方程转换 第77页pH对酶作用影响对酶作用影响第78页pH影响反应速度原因影响反应速度原因 (1)pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物 解离状态。(2)过高、过低pH造成酶蛋白变性。第79页因为它除了受到底物种类、温度、时间等影响外、还受底物浓度、酶浓度等原因影响。例:碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0 酶最适酶最适pH不是一个固定常数不是一个固定常数第80页温度对酶反应速度影响温度对酶反应速度影响 第81页它随底物种类、浓度,溶液离子强度,pH,反应时间等影响。最适温度与最适最适温度与最适pH一样，也不是一个固定常数一样，也不是一个固定常数第82页激活剂（activator）对酶反应速度影响 酶激活剂：能提升酶活力物质1.无机离子 金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等 2.有机小分子:如Cys、GSH等3.含有蛋白质性质大分子，如一些蛋白激活。第83页抑制剂(inhibitor)影响 抑制作用（inhibition）：使酶必需基团化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失去活性物质第84页1、不可逆抑制作用(irreversible inhibition)2、可逆抑制作用(reversible inhibition)（2）非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition)（1）竞争性抑制作用(competitive inhibition)第85页1、不可逆抑制作用（irreversible inhibition）E+I EI例:DFP（DIFP）对胰凝乳蛋白酶抑制 抑制剂与酶分子上一些基团共价结合第86页2、可逆抑制作用(reversible inhibition)（1）竞争性抑制作用（）竞争性抑制作用（competitive inhibition）E+I EI 第87页例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用 抑制剂结构与某抑制剂结构与某种底物结构类似种底物结构类似第88页竞争性抑制作用动力学方程竞争性抑制作用动力学方程EI+S no reaction 推导出方程 第89页竞争性抑制作用动力学方程特征 当 I 0时，方程还原成米氏方程。当 I 时，1/2Vmax第90页竞争性抑制应用竞争性抑制应用H2NCOO-H2NSO2NH2对-氨基苯甲酸对-氨基苯磺酰胺第91页（2）非竞争性抑制作用（）非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition）E+S ES ESI E+I EI ESI 第92页非竞争性抑制作用动力学方程非竞争性抑制作用动力学方程第93页非竞争性抑制作用动力学方程特征非竞争性抑制作用动力学方程特征当I0 I 第94页酶别构效应酶别构效应别构酶(allosteric enzyme)特点：有多亚基有两个中心：活性中心和别构中心活性中心别构中心别构中心活性中心含有别构效应(allosteric effect)第95页别构调整物(allosteric effector)能与别构酶结合并能调整其活性物质 别构调整物类型底物或底物类似物小分子代谢产物别构激活剂（正效应物）别构抑制剂（负效应物）第96页协同效应(cooperative effect)正协同效应负协同效应一个效应物分子与别构酶别构中心结合后，对第二个效应物分子结合所产生影响。第97页别构酶举例 大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶（E.coli aspartate transcarbamylase,ATCase）第98页 ATCase催化化学反应CO2+Glu+ATP第99页 ATCase活性调整机理活性调整机理 有催化活性构象 无催化活性构象 第100页+ATP+ATP+ATP+ATP+CTP +CTP +CTP +CTP 别构酶形曲线别构酶形曲线别构酶形曲线别构酶形曲线S S S S V V V V 1/2Vmax-第101页酶活力测定注意事项：注意事项：1、测定反应初速度、测定反应初速度2、在一套固定条件下进行、在一套固定条件下进行测定方法测定方法第102页酶活力（酶活力（enzyme activity）在一定条件下，分钟能转化在一定条件下，分钟能转化mol底物酶量称底物酶量称为一个酶单位为一个酶单位(U)。第103页酶比活力（酶比活力（specific activity，也称比活性），也称比活性）指每指每mg蛋白质所含有酶活力，普通用蛋白质所含有酶活力，普通用 U/mg蛋白质来表示，能够用比活力来表蛋白质来表示，能够用比活力来表示酶纯度。示酶纯度。比活力比活力=酶活力（酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每比活力有时也可用每g或每或每ml酶含多少个活力酶含多少个活力单位来表示。单位来表示。第104页酶制备酶制备提取提取纯化纯化保留保留思索题：思索题：从从肝细胞中提取一个蛋白水解酶粗提液肝细胞中提取一个蛋白水解酶粗提液300ml含有含有150mg蛋白质，总活力为蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化步单位。经过一系列纯化步骤以后得到骤以后得到4ml酶制品酶制品(含有含有0.08mg蛋白蛋白)，总活力为，总活力为288单位，整个纯化过程收率是多少？单位，整个纯化过程收率是多少？纯化了多少倍？纯化了多少倍？第105页酶应用（临床方面）酶应用（临床方面）消化类：胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶酶等抗炎净创类：胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等血凝和解凝类：凝血酶促使血液凝固，预防微血管出血。纤维蛋白溶解酶作用是溶解血块，治疗血栓静脉 炎、冠状动脉栓塞等解毒类：如青霉素酶能够分解青霉素分子中一内酰胺环，使变 成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引发过敏反应。第106页Allosteric inhibitorsbind specificallyto the T state andmake it harder forsubstrate to switchenzyme into theR state.Allosteric activatorsbind specifically to theR state and pull moreof the enzyme into themore active R state.ALLOSTERIC EFFECTORS bind specifically to either the T or the R states.Heterotropic(nonsubstrate)activators bind to and stabilize the R state,while heterotropic inhibitors bind preferentially to the T state.第107页TTRTRR+S+STTRRRT+S+S序变模型序变模型(simple sequential model)齐变模型齐变模型(concerted model)第108页Simple sequential model for a tetrameric allosteric enzyme.The binding of a ligand(L)to a subunit changes the conformation of that particular subunit from the T(square)to the R(circle)form.This transition affects the affinity of the other subunits for the ligand.第109页2、可逆共价修饰调整、可逆共价修饰调整可逆共价修饰可逆共价修饰(covalent modification)方式：方式：可逆磷酸化(phosphorylation)可逆腺苷酰化(adenylylation)尿苷酰化(uridylylation)甲基化(methylation)第110页COVALENT MODIFICATION IS A MEANS OF REGULATING ENZYME ACTIVITYPhosphorylation Is a Highly Effective Means of Regulating the Activities of Target Proteins第111页第112页第113页糖原磷酸化酶磷酸化酶b(活性低)磷酸化酶a(活性高)糖原磷酸化酶b糖原磷酸化酶a磷酸化酶激酶2ATP2ADP磷酸化酶磷酸酶2Pi2H2O第114页酶活力和比活力表示方式（1）酶活力（enzyme activity）酶活力定义：在一定条件下，分钟能转化mol底物酶量 酶活力大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit,U）酶单位定义 1961年国际酶单位（IU）1972年Katal（简称Kat）单位 第115页（2）酶比活力（specific activity，也称比活性）比活力：指每mg蛋白质所含有酶活力，普通用 U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶纯度。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。第116页酶分离纯化和活力测定酶分离纯化和活力测定纯化普通标准纯化普通标准第117页