新型NF-κB抑制剂Clitocine抑制耐药性肿瘤细胞的分子机制研究学习资料.docx

此文档收集于网络，如有侵权请联系网站删除浙江大学博士学位论文新型NF-B抑制剂Clitocine抑制耐药性肿瘤细胞的分子机制 研究姓名：孙建国申请学位级别：博士专业：生化与分子生物学指导教师：吴平；刘非燕20120603此文档仅供学习和交流浙江大学博士学位论文新型NFKB抑制剂Clitocine抑制耐药性肿瘤细胞 的分子机制研究摘要化疗是癌症临床治疗的重要手段，化疗药物通过直接杀死肿瘤细胞或者抑制 肿瘤细胞的分裂增殖，促进细胞分化来达到治疗效果。化疗的缺陷是无差别地对 正常细胞的杀伤作用。此外，肿瘤细胞对化疗药物的耐药性也是目前癌症治疗的 一个主要障碍，近90的转移性和复发癌症病人治疗失败都是由于耐药性引起的。因此寻找高效低毒的抗肿瘤药物以及逆转肿瘤细胞的耐药性(Drug Resistance)是治疗癌症的两个重要课题。本研究从蘑菇中提取到一种天然药物 成分Clitocine(克力托辛)，并发现该化合物能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。更 为重要的是我们首次报道了Clitocine能有效诱导耐药性肿瘤细胞的凋亡以及逆 转肿瘤细胞的多药耐药性本文从分子生物学水平揭示了Clitocine的抗肿瘤生 物活性的分子机理，并首次确定了该化合物是NF-r,B的抑制剂，这一发现暗示 了Clitocine可能具备更加广泛的生物活性。本文的主要研究结果如下：1、Clitocine能够诱导肿瘤细胞凋亡采用M订法检测Clitocine对肿瘤细胞的毒性，结果显示该化合物对多种肿瘤细胞包括肝癌细胞HepG2、R-HepG2(耐 药性IqepG2)和SMMC7721、官颈癌细胞HeLa、胃癌细胞SGC7901、子官癌 细胞MESSA和MESSADx5(耐药性MESSA)以及乳腺癌细胞MCF7和 Bcap37等都表现出较高的活性抑制作用，其中对肝癌的毒性最大。而且Clitocine 对敏感性HepG2细胞和耐药性RHepG2细胞的毒性很相近。进一步实验结果显 示Clitocine能够诱导耐药性肝癌细胞凋亡，包括出现DNA片段化(DNAladder)、 磷脂酰丝氨酸(PS)外翻、Caspase激活、线粒体膜崩溃以及PARP的剪切等一系列凋亡的典型特征。此外，Clitocine诱导的肝癌细胞凋亡涉及细胞外与细胞内两条信号通路。2，Clitoeine诱导的细胞凋亡通过Bcl-2家族成员受到调控蛋白免疫印迹 (Western Blot)结果显示，Clitocine能够使Bcl2家族成员抑凋亡蛋白Bcl2下 调而促凋亡蛋白Bad上调。利用RNA干扰技术(RNAi)表明Bad的上调是 Clitocine诱导耐药性肝癌细胞凋亡的重要原因。浙江大学博士学位论文3、Clitocine能够下调P糖蛋白的表达以逆转耐药性肿瘤细胞的耐药性本文 选用的两株耐药性细胞株R-HepG2和MESSADx5都是细胞膜泵P糖蛋白 (Pglycoprotein)过表达的，该蛋白的过表达是很多肿瘤细胞产生耐药性的重要原 因；我们的数据显示Clitocine能够显著降低P糖蛋白的表达水平。将Clitocine 与阿霉素(Doxorubicin)配伍使用可有效增强耐药性细胞对阿霉素的敏感性，大 幅提高低浓度下阿霉素对耐药性肿瘤细胞的杀伤作用。流式细胞术的数据显示， Clitocine能够增加阿霉素在细胞内的积累。因此，我们推测Clitocine能够逆转肿 瘤细胞的耐药性与P一糖蛋白的表达被抑制密切相关。4、Clitocine通过下调NFKB抑制P糖蛋白的表达荧光定量PCR的数据显 示，Clitocine下调了P糖蛋白编码基因MDRl的mRNA水平。我们推测Clitocine 是在转录水平调控MDRI基因的表达。因此，我们克隆了P糖蛋白编码基因 MDRl的启动子序列，并构建萤光素酶基因报告系统。利用将启动子分段分析的 方法，确认Clitocine调控MDRl基因表达的特定启动子区域。结合转录因子预 测软件分析，得到NFrd3可能是Clitocine的作用靶点。染色质免疫共沉淀(CHIP) 技术确认了NFKB能够直接结合到我们确认的启动子调控区域，结合位点的点 突变以及NFKB的过表达能够逆转Clitoeine的调控作用。5、Clitocine能够抑制NFK1B的激活Clitocine能够抑制阿霉素诱导的NFr,B 表达的增加，并降低NFrB重要下游基因凋亡抑制蛋白家族成员XIAP的表达。 利用电泳迁移率实验(EMSA)，我们发现Clitocine能够有效抑制NF心的激活 以及活化NFr,B向细胞核内的转运。6、Ciitocine能够在动物模型中抑制耐药性肿瘤细胞的生长将耐药性肿瘤 细胞RHepG2接种到裸鼠皮下形成肿瘤，Clitocine能够显著抑制肿瘤细胞的生 长。此外利用剥离的肿瘤组织进行免疫组织化学实验，结果表明Clitocine能够 在体内抑制P糖蛋白的以及NFrB的表达。概括起来，Clitocine能够有效诱导耐药性肿瘤细胞的凋亡，并通过抑制 NF-rB的来下调P耱蛋白的表达，进而逆转肿瘤细胞的耐药性。我们首次证明 了Clitocine是一种NFrd3的新型抑制剂，这说明该化合物可能具有较为广泛的 生物活性，具备了重要了应用前景。关键词：Clitocine；肿瘤细胞；细胞凋亡；Bad；多药耐药；P糖蛋白；NF1cBII浙江大学博上学位论文The suppression effect of clitocine in drug resistant cancer cellsas a novel NFKB inhibitor AbstractChemotherapy is a very important meRo_s during cancer clinical treatmentThe chemotherapeutic agents Call be used to treat tumor by killing cRncer cells directly, inhibiting cRncer cells proliferation and growth or activating cancer cells to differentiationHowever,these toxic agents are unable to distinguish the cancer cells and normal cellsSo，chemotherapy always brings in some side effect during clinical application such as too toxic to patients Further more cancer cells Can also develop drug resistance to drugs during chemotherapyResistance to chemotherapeutic drugsis currently a major problem in cancer therapy,accounting for treatment failure inover 90of human patients with metastatic or recurrent cancel Therefore，it is urgent to find novel anticancer agents which Can kill cancer cells with higher efficiency and significantly circumvent their drug resistanceHere，we extracted a natural compound clitocine from mushroom Leucopaxillus giganteus and further study initially indicated that the compound Can effectively inhibit the proliferation of many human cancer cell lines and overcome drug resistance in drug resistant CanCelcellsAt the present,we revealed the biological activities of clitocine and the underlying molecular mechanism as follows：1Clitocine can induce apoptosis in human cancer cellsThe anti-proliferationeffect of clitocine on human cancer cell lines was assessed by the MTT assay,including hepatoma HepG2，RHepG2(drug resistant HepG2)and SMMC772 1 cells， human cervical cancer HeLa cells，human gastric cancer SGC790 1 cells，human uterine cancer MES-SA and MES-SADx5 cells，human breast carcinoma MCF7and Bcap3 7 cellsThe compound exerted hi曲est cytotoxicity in hepatoma cells and the toxicity is similar in both sensitive and drug resistant cellsFurther study showed that citcocine Can induce apoptosis in hepatoma R-HepG2 cells which was confirmedby DNA ladder,PS externalization，caspase activation,mitochondria disruption andP!f蝴cleavageAdditionally,both intrinsic and extrinsic signaling pathways wereinvolved in the apoptosis induced by clitocine in R-HepG2 cells2Bcl-2 family members regulated the apoptosis induced by clitocineThe data of western blot assay indicated that clitocine Can downregulate the Bcl2 level and upregulate the Bad levelFurthermore，the Bad played an indispensable role inIlI浙江大学博士学位论文apoptosis induced by clitocine confirmed by using siRNA to silence the Bad mRNA 3Clitocine can circumvent drug resistance of R-HepG2 cells by downregulating Pglycoprotein expressionDrug resistant R-HepG2 cells presented very low sensitivity to doxorubicinHowever,combine using of clitocine and low dosedoxorubicin Can effectively kill cancer cellsThe data from flow cytometry indicatedthat clitocine significantly increased the doxorubicin accumulation in the cancer cells More interestingly,we found that elitocine Can inhibit the P-glycoprotein expression in botll two drug resistant cancer cells R-HepG2 and MES-SDx5 which wereP-glycoprotein overexpressed4Clitocine inhibited P-glycopritein expression via downregulation NFgB Cloned the Pglycoprotein coding gene MDRl promoter to construct the dual reporter luciferase systemTruncation analysis of MDRl promoter sequence was performed todetermine the regulatory region of clitocineCombining computational analysis for the putative transcription factor binding sites，it Was conftrmed that NFr33 may be thetarget through which clitocine regulated the MDRl expressionAdditionally,the binding of NF-rB to the putative binding site within the MDRl promoter Was confirmed by chromatin immunoprecipitaition(CHIP)assayPoint mutation in the putative binding site of NF-rd3 and overexpression of this transcriptional factor Caninterestingly counteracted the clitocine effect on P-gP in R-HepG2 cells5Clitocine could inhibit the activation of NFKB by doxorubicinClitocine could also suppress the expression of NF-r,B and itsdownstream genes such as XIAP even in presence of doxorubicin in RD cellsMore importantly,clitocine significantly overcome the activation of NFrB by doxorubicin which Was characterized as nucleartranslocation of NFrB6Clitocine can inhibit the tumor growth in animal modelIn order to find out if clitocine Was also able to suppress the tumor growth in vivo，a nude mouse animal model subcutaneously injected with R-HepG2 cells Was employedAfter solid tumor formation,the tumors were treated with clitocineOur compound Can effectively inhibit the tumor growthOn the other hand，immunohistochemistry assay showed that the expressions ofNFrd3 p65 and PgP were bol suppressed by clitocine in vivo Taken together，Clitocine Can induce apoptosis in multidrug resistant cancer cellsIV浙江大学博士学位论文effectively and suppress the P-glycoprotein expression via inhibiting NFrBAll our data indicated that Clitocine may possess various biological activities as a novel NFrB inhibitor and reveal a potential application in futureKeywords：clitocine，apoptosis，Bad，drugresistance，P-glycoprotein，NFr,BV浙江大学博士学位论文致谢博士生涯的五年即将过去，这五年，正是人一生中最美好的时间，专业水平在此期间逐渐提高，思想日渐成熟，入也到了而立之年回顾这段时间，感触良 多，突然发现需要感谢的人实在是太多，或许不能一一带到，但是希望我感恩的 心能让每一个帮助过我的人都体会到。首先感谢我的导师吴平和刘非燕老师，能够师从二位教授，是我莫大的荣幸 二位老师学术造诣渊博、治学态度严谨、对学术充满着忘我的敬业精神。吴老师 在百忙之下抽出时间对我进行科研上的指导，教导我严谨治学，献身科研。刘老 师是我的良师益友，不仅在科研上与我平等交流并给予我很重要的指导，同时在 科研环境以及生活方面也为我提供了很好的条件。我的博士科研生涯是在二位导 师的悉心指导下完成，从选题到设计技术路线以及解决实验中遇到的问题，二位 老师都给予了莫大的帮助。再次感谢二位老师对我的帮助，我想如果没有他们就 没有我现在的成长。同时感谢我在香港中文大学的导师冯国培和郭添德二位教授。在中大研究学-j期间，二位导师给了我巨大的帮助，冯教授的风度翩翩以及高尚的人格给我留 下了极其深刻的印象。事务繁忙的冯教授，仍然每周抽出半天时间召开实验室组 会，倾听我们的实验进展，在科研上给予有益的指导。在港期间，郭教授直接指 导我的课题研究，他以良好的科研背景和渊博的专业知识对我进行了完整系统的 科研训练，为我今后的科研生涯奠定了重要的基础，在此表达我十分的感谢和敬 意。此外非常感谢我硕士期间的导师席永梅老师，席老师人非常好，科研上能够 给予我帮助，也能设身处地为学生的发展考虑，她是我科研的领路人，在此一并 表达我的谢意。回望过去的五年，遇见的人，碰到的事，似流水又不能让人忘怀。借此机会， 感谢我的同窗石东燕、王大辉、郑道琼和罗可望；中大的同学AtYee、Chilam、 Esmond以及Chole在研究思路、实验设计以及实验中给予的无私帮助。感谢我 的师弟师妹李夏、李华、周丽娜和宗晨对我的热心帮助。特别感谢我的家人，父母生我养我二十余载，即使在家庭最艰难的时候，也 毫无保留地支持我的学业，倾听我的怨言、分享我的快乐。也谢谢爱我的姐姐、 姐夫，他们无私的帮助让我感激万分。浙江大学博士学位论文最后向所有帮助过我的师长、同学和朋友致以最真挚的感谢。同时向参加本 论文评阅、评议和答辩委员会的全体专家、教授及为论文答辩辛勤工作的人员致 以崇高的敬意!谢谢!孙建国2012年5月于浙大紫金港U浙江大学博士学位论文英文缩略词(ABBREVIATION)英文缩写英文全名中文全名PSPhosphatidylserine磷脂酰丝氨酸PARPpoly ADP-ribose polymerase聚腺苷二磷酸核糖聚合酶Bcl2B-cell lymphoma 2B细胞淋巴瘤2BADBcl2相关的死亡促进因子DOXDoxorubicin阿霉素P-gpP-glycoproteinP糖蛋白NFrBnucle竺胁or kappa-lightehainenhancer of核转录因子柚aetivatedB cells”“1“一CHIPChromatin ImmunoPrecipitation染色质免疫共沉淀EMSAElectrophoretic mobility shift assay电泳迁移实验X从PXlinked inhibitor of apoptosis proteinX连锁凋亡抑制蛋白ERKl2Extraeellular signaling-regulating kinasel2胞外信号调节激酶12ICElaofka蟹a li蛳polypeptide gene核转录因子rB抑制蛋白a”“1“。 “”。4”nuclear factorinhibitoralphaenhancer in B-cellsCMLChronic myelogenous(or myeloid)leukemia慢性粒细胞白血病 MAPKsMitogen-activated protein(MAP)kinases有丝分裂原激活蛋白激酶 COXCyclooxygenase环氧合酶TOPolDNA Topoisomerases IDNA拓扑异构酶I VEGFVascular endothelial growth factor表皮生长因子 TGF转化生长因子HCCHepatoeeilular carcinima肝癌ATCCAmerican Type Culture Collection美国模式培养物集存库FBSFetal bovine serum胎牛血清 DM匣MEagleS minimal essential medium基础培养基 PBSPhosphate buffered saline磷酸缓冲液LGBLower Gel Buffer分离胶缓冲液UGBUpper Gel Buffer浓缩胶缓冲液AmpAmpicillin氨苄青霉素PlPropidium iodide碘化丙啶PMSFphenylmethylsulfonyl fluoride苯甲基磺醯化氟III浙江大学博士学位论文siRNASmall interference RNA小干扰RNA HPLCHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱 IC50half maximal inhibitory concentration半数抑制指数 MDRMultidrug Resistance多药耐药性ABCATP-bmding cassetteATP结合盒子敞PAdenosine triphosphate腺嘌呤核苷三磷酸HDACHistone deacetylase组蛋白乙酰基转移酶NCBI翌篓竺苎；cen呛rforBiotechnology美国生物技术信息中心。mromlatlonODO叩cal density光密度RNaseRNA ensymeRNA酶PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应bpBase pair碱基对dNTPsdATP，dGTP，dCTP and drrP mixer四种核昔酸混合物cDNAcomplementary DNA互补DNAPFAparaformaldehyde多聚甲醛BSAAlbumin from bovine serum牛血清白蛋白DAPI4,6-diamidino-2-phenylindole4，6二脒基2苯基吲哚FITCFluorescein Isothiocyanate异硫氰酸荧光素RBITCAIpha-IAntichymotrypsin红色荧光素罗丹明W浙江大学博士学位论文 文献综述第一章文献综述 11前言蘑菇是真菌的新鲜孢子子实体，通常产生于高于地面、土壤或者它们食物来 源的那部分。据估计，目前地球上约有15万的蘑菇品种，然而，只有10左右(约 15，000种被命名)已经在科学上被认识。从历史上看，食用茵很早就应用在中国、 韩国、欧洲以及日本饮食中。蘑菇的成分分析表明，作为低热量成分和食物原材 料蘑菇是B族维生素，如核黄素，烟酸和泛酸的良好来源。在亚洲国家，尤其是在中国，数百年来蘑菇也被用于传统中药用来预防或治 疗各种疾病。至少有700种蘑菇被发现具备一定的治疗活性，其中便包括抗肿瘤 活性。现在药用菇类的治疗效果正在赢得广泛的注意。在一些国家，尤其是在中 国、日本和韩国，正依靠蘑菇提取物进行现代临床应用。在许多蘑菇中提取到一 系列具备生物活性如抗癌性的药物。具有抗肿瘤和免疫调节功能的多糖是研究得 最透彻的，最具有潜力的抗蘑菇提取物【11。其中，灵芝类(Ganoderma)具备了最长的药物应用历史。在中国，被称为灵芝(Ganodermalucidum；G lucidum)， 而日本作为reishi。最近一些研究表明，灵芝能够通过不同的分子机制对多种肿 瘤细胞株表现出显著的抗癌活性【“1。药用蘑菇的抗癌作用在体内和体外已经被证明【5】在中国和日本，共有三种 蘑菇被用来生产医药级别的癌症治疗药物。从这些真菌提取的多糖以商品名云芝 或PSK(源自Trametes versicolor,theXurkey tail”mushroom)，香菇(源自Lentinus edodes，the shiitake mushroom)和Sonifilan(源自Schizophyllum commune，the split-gill polypore)被销售。将来很可能将开发出更多的蘑菇和蘑菇来源的天然化合物作为抗癌治疗药物。本文，我们进行了全面的文献综述，并总结了蘑菇和蘑菇提取物的抗癌活性及其潜在的分子机制，为我们进一步研究蘑菇提取物克力托辛做好前期理论工作。12蘑菇和蘑菇提取物的抗癌活性121癌变抑制和癌症预防 据统计，在2010年全美发生1,529，560例的癌症新病例和569，490例因癌症死浙江大学博士学位论文 文献综述亡的病例。然而，据估计至少有三分之一的癌症病例是可以预防的。事实上，预 防是控制癌症的最具成本效益的长期战略。有一个很有意思的现象，在一些地区 特别是在东亚，绝经前后的妇女患乳腺癌的风险的降低与膳食中新鲜和干香菇的 摄入量呈相关性。一些流行病学研究也建立了蘑菇食用量与癌症之间的关联it-s 可能是蘑菇和蘑菇提取物的免疫调节活性在预防癌症的功能中起到了至关重要 的作用。研究表明蘑菇和蘑菇提取物在体内和体外实验模型中表现出对癌症的预防 活性【9，101。日本研究人员对日本最常用的可食用和药用蘑菇真姬菇(Hypsizygus marmoreus)的研究为蘑菇预防癌症的作用提供了一个很好的例子【51。在每天喂养的食物中包含5的真姬菇的36只小鼠中，只有3只小鼠在强致癌物甲基胆 (methylcholanthrene)作用下发生癌变，而对照组中有21只小鼠发生癌变。研究 人员认为是食用菌的免疫调节能力起的作用。122诱导凋亡和抑制肿瘤细胞增殖 细胞凋亡是在发育和衰老过程中的一种自发现象，是包括各种正常细胞的翻转，免疫系统的发育和功能，胚胎发育和化学诱导的细胞死亡过程的关键机制。研究人员一般认为逃避凋亡是几乎所有类型的癌症的六个关键的细胞生理变化 之一，并指示了细胞的恶性生长【】。因此，设计或者发现能够诱导肿瘤细胞凋亡 的药物可能对治疗癌症有效。许多文献报道了多种蘑菇的凋亡诱导能力，如：灵 芝(G lucidum)【3，4，121、琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)【131、榆黄蘑(Pleurotuscitrinopileatus)141、紫色秃马勃(C口胁f胁lilacina)1 51、地 菌(Albatrellus confluens)116和猴头菇，纪fz删erinaceu$)【1刀。这些过程包括一系列死亡受体的信号激活或者线粒体介导的细胞I勾caspase信号通路的激活，或者某个胱甘肽(GSH)消耗相关的复杂信号通路的激活或失活，如AK嘴号通路。除了凋亡诱导能力，一些蘑菇和蘑菇提取物能够通过细胞周期阻滞的方式抑 制某些肿瘤细胞的增殖【1891。奇果菌素(Grifolin)，一种从地花菌(Albatrellus Confluens，彳Confluens)内提取的天然产物，能够通过抑制胞外信号调节激酶12 (Extracellular signaling-regulating kinasel2；ERKl2)或者胞外信号调节激酶信号 通路来来诱导细胞周期阻滞在G1期【191。事实上，细胞周期阻滞和凋亡是相互之间的补充，两者都是癌细胞在细胞损伤和压力下的反应【20】。浙江大学博士学位论文文献综述123免疫调节癌细胞能够通过一系列机制实现过度增殖并能在宿主的正常免疫系统监控 下存活下来，通常这个免疫系统能够辨认并杀死这些细胞。在患病及其治疗期间， 免疫系统通常都是被压制的。例如，对癌细胞进行化疗和放疗的过程中通常会压 制患者的免疫系统。因此，需要发展新的有效的方法以促进抗癌的免疫细胞的活 性并克服癌细胞对免疫监视的逃离211。免疫调节性药物与传统治疗的结合能够克 服对病人免疫系统的副作用。有认为蘑菇来源的多糖如蘑菇多糖(1entinan)与 其他能带来强烈副作用的治疗手段如化疗和手术的结合能够产生很好的效果，临 床研究为我们提供了充分的证据以证实这个观点【8，221。在癌症治疗的过程中，癌细胞的转移是一个最重大的挑战，而蘑菇提取物对 肿瘤转移的预防作用已被许多研究小组所研究【23。251。Hispolon是一种来自桑黄的 酚类活性化合物，能够通过抑制粘着斑激酶(FAK)信号通路和P13KAkt和Ras 同源基因家族的成员(RhoA的)活性来减少尿激酶型纤溶酶原激活物(UPA)、 基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达并最终表现 为对SKHepl细胞的转移的抑制【251。这些结果表明，蘑菇提取物可作为一个高度 侵袭性肿瘤细胞的发生和转移的化学预防剂。124抗氧化作用 自由基已被证明在多种各种疾病包括炎症有关的疾病、癌症以及老化过程的发病机制中发挥了重要作用26,27。最近的一项研究显示，通过猝灭自由基的抗氧化作用有助于预防这些疾病【2刀。一些抗氧化剂如维生素A、维生素C、维生素E 和超氧化物歧化酶能够通过防止自由基氧化敏感的生物分子或减少自由基的形 成来减缓衰老过程。一些蘑菇和蘑菇提取物，在肿瘤细胞中表现出抗氧化活性。 白桦茸(Inonotus obliquus)的子实体已经在传统医药领域被用来治疗癌症。两 种蘑菇nonoblins和phelligridins的甲醇提取物能够显著净化 2，2azinobis(3一ethylbenzo thiazoline6sulphonic acid(ABTS)的阳离子自由基和 2，2diphenyl一1-picrylhydrazyl(DPPH)的自由基，而对超氧阴离子自由基表现为中 度抑制幽1。从姬松茸(Agaricus brasiliensis)子实体提取的纯化合物能够通过改 善肝过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，抑制肿瘤的生长291浙江大学博士学位论文文献综述表11蘑菇和蘑菇提取物的生物活性Biological effectMushroom(extract)Refert：lltet(酝，刑吾镩口h删dwnSilva 2006；Jang Han et a120 1 0；Zhao。Ye etal，2011EmllusptacidusLitlLuo et a12009 Pleurotus cilrDcopi知atusChen，Wang et al，2009 Ca&aria tilacmaTsay,Chung et a12009Albatrdlus confluensLuo，“etal2010Apoptosis-inducingAgarjcus blaz翻K斌Moon et a12009ac6vity-DaedaleaYassin,Wasser et a12008gibbosaIrassin，Wasser et a12008Antrodia camphorateYang，Kuo etal 2011Pleuro