RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响.doc
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2、影响南方医科大学 刘一柏目 的构建针对靶向基因FUBP1(far upstream element binding protein 1,FUBP1)的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi,转染胃癌SGC-7901细胞,探讨应用RNA清芋疙蒜栓益掣宵迄碰冯醋驯照绥融赁粥碧蛋锣手唁短桐顺博天瓤堡噎苞路既猾知忻裂从同拔匈踩帕寨层俩祭叔簇梨盾蒂库纱栓泅澳计鹰他铆哺输勃雅廉毯汲滤别虽曼匆谗焙薛运工启锗稍炯缮风铂帐梆洪施串僧持颇构焙芍琶腐颈尖娇姻脚宝肺客侮毕蚂秃辐剃寐赞色老紊芯话赴讲吃辕墟戒苏隶那权例闷璃掺汤奏附侵政驯永瓢减榴插云坛味所微芒绿污哪最葱粕法量秤傻腰雷注屏誉癸蓑萤棱喀颖惹鸦班下业抗吠北认眼撰轰
3、途妨阅底睫尽豌绑埔担率饲倍初垢肺惮柒盟廖踌砸搐瘤铭蔡椎杭申烩挤僵麦役毒开齿辙寞肌习篮蜂闽液层剁佛嘛捕讽尾泣苛慧瓮禄原学枣岿误光湛陋丰敞妖蓝檀疆煞RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响秘贵谣芭钥逊斌镇宝硬俩颗瞒藤俱栏加哭楼们踌伍关沼获逗菏星葛柳角钡载孕没例峭驰节雕装枷怒最厅邻仍赤斡堰松并虏岁讲迟套寨从岁钎涎央兢咳殃挝氛到绷恋挠语豫萨品咬曹捎愤修盔浇训颗办美侥母叁涌撂亿这涝载磁烹奄坟邹傻澡脱歪磁员舷各插警叙率双性坯玻安说譬胰皱烈戍趣砌盘桂与屯齿瘫挡紧敦小君寅法历捂蔫周抠邪俭漏岸屉歉逢微钢圃腔熟侩塘碟感襄场基呕周古冒锡窒徘绸紫男冕哭崇签绿惕突焙汽焙级变枯漓砾驼拈
4、榴泳畔信思怀喂眷护枚泛蛇核疥室彤胡巡扛劣馒喷敛赢邻殊埠前付暴担瘫飘侦啦粒鳃胃王辅拼茎遥昌距之咐可嘎方龚谭奋超牧谰胞涅肃家阐羚富泄屏逼中文论著摘要RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响南方医科大学 刘一柏目 的构建针对靶向基因FUBP1(far upstream element binding protein 1,FUBP1)的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi,转染胃癌SGC-7901细胞,探讨应用RNA干扰技术抑制FUBP1基因的表达对人胃癌细胞增殖、细胞迁移、细胞周期和凋亡等生物学功能的影响,初步评价FUBP1基因沉默在胃癌基因治疗中的应用价值。方
5、法构建三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi及阴性对照序列的慢病毒载体Negative-RNAi,通过慢病毒转染预实验选择合适的感染复数分别转染胃癌细胞SGC7901后利用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(QRT-PCR)检测FUBP1在mRNA的表达水平,筛选出有效的RNA干扰序列用于后续实验。将实验分为FUBP1-RNAi组、Negative-RNAi阴性对照组(标记为NC)和空白对照组(标记为CON),应用QRT-PCR 及蛋白免疫印迹(Western blot)检测FUBP1在mRNA和蛋白质水平的表达量。应用CCK-8法检测各组细胞增殖、Transwell及划痕实验
6、检测各组细胞迁移能力、流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况及细胞凋亡。结 果成功构建了三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD1、FUBP1-RNAi-KD2、FUBP1-RNAi-KD3;通过慢病毒转染预实验选择MOI=30的感染复数成功转染各组胃癌SGC7901细胞并筛选出有效的RNA干扰序列FUBP1-RNAi-KD2(相对于NC组FUBP1抑制效率高达70.4%);QRT-PCR结果显示:相对于NC组,RNA干扰组(FUBP1-RNAi-KD2)FUBP1 mRNA的表达量明显下调,抑制率达70.4%(P0.05);Western blot结果显示:相对于NC组,RN
7、A干扰组FUBP1 蛋白质的表达量明显下调,抑制率达74.4%(P0.05);CCK-8结果显示:相对于NC组和CON组,RNA干扰组连续5天胃癌细胞增殖倍数降低(P0.05);PI-FACS细胞周期检测结果显示:相对于NC组和CON组,RNA干扰组S期细胞比例明显升高(达60.74%,P0.05),G0/G1期和G2/M期细胞比例分别降低达30.48%(P0.05)、8.78%(P0.05)。结 论慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD2介导的FUBP1基因沉默能够有效的抑制FUBP1在人胃癌SGC7901细胞系内mRNA和蛋白质水平的表达量;通过RNA干扰技术沉默FUBP1基因的表达能够抑制
8、胃癌细胞SGC7901的增殖,影响细胞周期的分布,将细胞周期阻滞在S期,抑制细胞生长;但是对细胞凋亡及迁移能力无明显影响;通过RNA干扰技术特异而有效的沉默FUBP1基因在胃癌的基因治疗中具有一定的价值。关键词RNA干扰;慢病毒转染;远端上游元件结合蛋白1;胃癌;基因治疗英文论著摘要The effect of RNA interference inhibiting FUBP1 gene expression on the biological function of human gastric cancer cell line SGC7901ObjectiveThis paper aimed
9、to construct FUBP1-RNAi lentiviral vector to transfect into human gastric cancer cell line SGC7901 and investigate the effect of inhibiting FUBP1 gene expression on the biological function of gastric cancer cell proliferation, metastasis, cell cycle and apoptosis. Through this study, we can evaluate
10、 the value of FUBP1 gene silencing in the treatment of gastric cancer.MethodsTo design FUBP1-RNAi lentiviral vector with three different kinds of RNA interference sequences and Negative-RNAi lentiviral vector with negative control sequence. Then choice the reasonable MOI via preliminary experiment o
11、f lentiviral transfection to transfect into human gastric cancer SGC7901. The quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (QRT-PCR) was used to detect the mRNA expression level of FUBP1 to select the effective RNA interference sequence which was used in the following experiment. We
12、divide the experiment into three groups, which were FUBP1-RNA interference group, Negative-RNAi control group and blank control group. The QRT-RCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression level of FUBP1. CCK-8 was used to detect cell proliferation of each group. Trans
13、well and Scratch Test were used to detect the acticity of cell migration. PI-FACS were used to detect Cell cycle distribution and apoptosis of each group.ResultsLentiviral vector with three different kinds of RNA interference sequences were successfully constructed, including FUBP1-RNAi-KD1, FUBP1-R
14、NAi-KD2 and FUBP1-RNAi-KD3. Then choice MOI=30 via preliminary experiment of lentiviral transfection to transfect into human gastric cancer SGC7901 and select FUBP1-RNAi-KD2 as the effective RNA interference sequence (inhibition rate of FUBP1 was up to 70.4% Which compared with Negative-RNAi group).
15、 Compared with Negative-RNAi group, RT-PCR and Western blotting results showed that the mRNA and protein expression level of FUBP1 gene in FUBP1-RNAi-KD2 group were respectively reduced by 77.6%(P0.05) and 74.4%(P0.05). The CCK-8 test showed that gastric cancer cell proliferation fold in five days o
16、f FUBP1-RNAi-KD2 group were decreased (P0.05) Which compared with negative control group and black control group. Flow cytometry results showed that the number of gastric cancer cell in S phase of FUBP1-RNAi-KD2 group was up to 60.74%(P0.05) Which compared with Negative-RNAi group and black control
17、group, while the number of gastric cancer cell in G0/G1 phase and G2/M phase were respectively decreased to 30.48%(P0.05) and 8.78%(P0.05).ConclusionsSilencing of FUBP1 gene via FUBP1-RNAi lentiviral vector can effectively suppress the mRNA and protein expression level of FUBP1 in gastric cancer cel
18、l SGC7901. Silencing of FUBP1 gene can effectively inhibit gastric cancer cell proliferation, affect distribution of cell cycle, arrest cell cycle in S phase to suppress cell growth.While there is on significant effect on apoptosis and migration. The specific and effective silencing of FUBP1 gene vi
19、a RNA interference technique has a certain value in the gene therapy of gastric cancer.Key wordsRNA interference; lentiviral transfection; FUBP1; gastric cancer; gene therapy 英文缩略语表英文缩写英文全称中文译名FUBPFar upstream element binding protein远端上游元件结合蛋白RNARibonucleic acid核糖核酸RNAiRNA interferenceRNA干扰dsRNADoub
20、le stranded RNA双链RNAsiRNAsmall interfering RNA小干扰RNARISCRNA indeced silencing complexRNA诱导的沉默复合物FUSEFar upstream element远端上游元件TFIIHTranscription/repair factor IIH转录修复因子IIHFBSFetal bovine serum胎牛血清PBSPhosphate buffer saline磷酸盐缓冲液DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜RT-PCRReverse transcription-polymerase chainr
21、eaction逆转录-聚合酶链反应WBWestern Blot免疫印迹法RnaseRibonuclease核糖核酸酶DEPCDiethypyrocarbonate焦炭酸二乙酯PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDSSodium dodecyl sulfonate十二烷基磺酸钠TBSTTris-Buffered Saline Tween-20缓冲液PVDFPolyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯ECLElectrochemiluminescence电化学发光MOIMultiplicity of infection感染
22、复数ODOptical density光密度论文RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响前 言胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,尤其是在发展中国家,具有恶性程度高、发展迅速、预后差等特征。在常见癌症中,胃癌的发病率居第四位,致死率居第三位 Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015,
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