生物DNA重组技术的基本工具省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

基因工程基因工程专题专题1第1页每每100kg 猪或牛胰腺中仅可提取猪或牛胰腺中仅可提取45g。1979年，美国将年，美国将人胰岛素基因人胰岛素基因重组到重组到大肠杆菌大肠杆菌内，内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药v 据WTO调查：全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素思索思索：转基因技术转基因技术转基因技术转基因技术实现了实现了实现了实现了一个生物一个生物一个生物一个生物一些一些一些一些性状性状性状性状在在在在另一个生物另一个生物另一个生物另一个生物中中中中表示表示表示表示。这些性状表示与我们学过这些性状表示与我们学过这些性状表示与我们学过这些性状表示与我们学过基因什么过程相关？基因什么过程相关？基因什么过程相关？基因什么过程相关？密码子在生物界是！密码子在生物界是！密码子在生物界是！密码子在生物界是！DNA(DNA(基因基因基因基因)mRNA mRNA 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(性状性状性状性状)转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译通用通用第2页基因工程产物基因工程产物第3页什么叫基因工程？什么叫基因工程？基因工程是指基因工程是指按照人们愿望按照人们愿望，进行严，进行严格设计，并经过格设计，并经过体外体外DNA重组和转基因等重组和转基因等技术，赋予生物以新遗传特征，从而创造技术，赋予生物以新遗传特征，从而创造出更符合人们需要新生物类型和生物产品。出更符合人们需要新生物类型和生物产品。因为基因工程是在因为基因工程是在DNA分子水平分子水平上进行设上进行设计和施工，所以又叫做计和施工，所以又叫做DNA重组技术重组技术。基因工程概念基因工程概念第4页问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一个能够合成毒蛋白基因。个能够合成毒蛋白基因。让细菌毒蛋白基因在棉让细菌毒蛋白基因在棉花细胞中表示，可培育出抵花细胞中表示，可培育出抵抗棉铃虫害抗虫棉。抗棉铃虫害抗虫棉。想一想想一想需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉第5页基因工程培育抗虫棉简明过程：基因工程培育抗虫棉简明过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花普通棉花(无抗虫特征无抗虫特征)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因经过运载体导入经过运载体导入经过运载体导入经过运载体导入转基因棉花含转基因棉花含抗虫基因抗虫基因转基因棉花产生转基因棉花产生伴胞晶体伴胞晶体转基因棉花有转基因棉花有抗虫特征抗虫特征第6页基因工程培育抗虫棉关键步骤：基因工程培育抗虫棉关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞第7页处理培育抗虫棉关键步骤需要哪些工具？处理培育抗虫棉关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞基因进入受体细胞载体载体1.11.1、DNADNA重组技术基本工具重组技术基本工具第8页一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”v1.1.主要起源：主要起源：v种类与命名：种类与命名：v作用特点：作用特点：v4.4.限制酶识别序列限制酶识别序列v5.5.作用结果：作用结果：识别双链识别双链识别双链识别双链DNADNA分子某种分子某种分子某种分子某种特定特定特定特定核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸序列，而且使每条链中序列，而且使每条链中序列，而且使每条链中序列，而且使每条链中特定部位特定部位特定部位特定部位两个核苷酸之两个核苷酸之两个核苷酸之两个核苷酸之间间间间磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端Go onGo on大多数限制酶识别序列由大多数限制酶识别序列由大多数限制酶识别序列由大多数限制酶识别序列由6 6 6 6个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成少数识别序列由少数识别序列由少数识别序列由少数识别序列由4 4 4 4、5 5 5 5或或或或8 8 8 8个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成第9页寻根问底寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中作用是是你能推测限制酶存在于原核生物中作用是是什么吗？什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA入侵入侵，但，但生物在长久进化过程中形成了一套完善防御生物在长久进化过程中形成了一套完善防御机制，以预防外来病原物侵害。机制，以预防外来病原物侵害。限制酶限制酶就是就是细菌一个细菌一个防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNA侵入时，侵入时，会利用限制酶会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以确保本掉，以确保本身安全。所以，限制酶在原核生物中主要起身安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源到切割外源DNA、使之失效使之失效，从而到达，从而到达保护保护本身本身目标。目标。Go backGo back第10页种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。E EcocoR RS Smama粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（EscherichiaEscherichia coli coli R R）Go backGo back练习：流感嗜血杆菌练习：流感嗜血杆菌d d菌株菌株(Haemophilus influenzae d)Haemophilus influenzae d)中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分别命名为别命名为:Hind、Hind和和Hind第11页磷酸二酯键 T12345 A12345HHHHHO T12345 A12345HHHHOH2O+第12页O第13页限制酶DNA解旋酶v区分限制性内切酶与限制性内切酶与DNA解旋酶区分解旋酶区分切割特定核苷酸序列磷切割特定核苷酸序列磷酸二酯键酸二酯键将将DNADNA两条链氢键打两条链氢键打开形成两条单链开形成两条单链限制酶DNA水解酶v区分限制性内切酶与限制性内切酶与DNA水解酶区分水解酶区分切割特定核苷酸序列磷切割特定核苷酸序列磷酸二酯键，形成片段酸二酯键，形成片段DNA.DNA.切割磷酸二酯键，形成切割磷酸二酯键，形成单个脱氧核苷酸。单个脱氧核苷酸。Go backGo back第14页限制酶识别序列：限制酶识别序列：能被限制性内切酶特能被限制性内切酶特异性识别切割部位都异性识别切割部位都含有含有回文序列回文序列：在切割部位，一条链在切割部位，一条链正向正向读碱基次序与另读碱基次序与另一条链一条链反向反向读次序完读次序完全全一致一致。Go backGo back第15页EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Go backGo back第16页EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端重复演示重复演示重复演示重复演示Go backGo back第17页什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开被限制酶切开DNA两条单链切口，带两条单链切口，带有几个有几个伸出核苷酸伸出核苷酸，它们之间恰好，它们之间恰好互补配互补配对对，这么切口叫，这么切口叫黏性末端黏性末端。第18页Sma平末端平末端平末端平末端第19页要想取得某个特定性状基因必须要用限制酶要想取得某个特定性状基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。假如把两种起源不一样假如把两种起源不一样DNA用同一个限制酶用同一个限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同黏性相同黏性(平平)末端末端，然后让二者，然后让二者黏性黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎能够合成重起来，就似乎能够合成重组组DNA分子了。分子了。思索思索?第20页GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG不一样起源不一样起源不一样起源不一样起源DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不一样种起源将不一样种起源将不一样种起源将不一样种起源DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段GGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG酶切酶切酶切酶切GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG同一个同一个第21页DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶v区分1v区分2相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为何为何?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已经有核酸片段上，接到已经有核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸经过磷酸经过磷酸经过磷酸经过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上双链上两个两个缺口同时连接缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板第22页 可把黏性末端之间可把黏性末端之间缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开两个核苷酸之间磷酸二酯键恢复被限制酶切开两个核苷酸之间磷酸二酯键恢复被限制酶切开两个核苷酸之间磷酸二酯键恢复被限制酶切开两个核苷酸之间磷酸二酯键第23页T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间缝隙平末端之间缝隙“缝合缝合”起起来，但效率较低来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶第24页二、“分子缝合针”DNA连接酶作用作用:把切下来把切下来DNA片段拼接成新片段拼接成新DNA，即将，即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成第25页类型：类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶起源起源起源起源功效功效功效功效大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差异差异差异差异第26页三、“分子运输车”基因进入受体细胞载体载体需要条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表示有一些标识基因，便于筛选惯用运载体：细菌质粒 噬菌体衍生物或一些动植物病毒假如目标基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想效果吗？作为分子运输车载体，假如没有切割位点将会怎样？霍乱菌质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子霍乱菌质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？运输车吗？v目基因有没有进入受体细胞，如何去发现？v 第27页惯用载体：质粒惯用载体：质粒能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入目标基因插入目标基因插入目标基因插入目标基因一起复制一起复制一起复制一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标识基因存有标识基因存有标识基因存有标识基因存在，可用含氨在，可用含氨在，可用含氨在，可用含氨苄青霉素培养苄青霉素培养苄青霉素培养苄青霉素培养基判别基判别基判别基判别第28页第29页思索与探究思索与探究 P7（2）为何限制酶不剪切细菌本身为何限制酶不剪切细菌本身DNA？经过长久进化，细菌中含有某种限制经过长久进化，细菌中含有某种限制酶细胞，其酶细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这种限这种限制酶制酶识别切割序列识别切割序列；或者经过甲基化酶；或者经过甲基化酶将将甲基转移甲基转移到所到所识别序列识别序列碱基上，使碱基上，使限制酶限制酶不能将其切开不能将其切开。这么，尽管细菌中含有某。这么，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使本身种限制酶也不会使本身DNADNA被切断，而且被切断，而且能够预防外源能够预防外源DNADNA入侵。入侵。第30页3、天然、天然DNA分子能够直接用做基因工程分子能够直接用做基因工程载体吗？为何？载体吗？为何？提醒：提醒：提醒：提醒：基因工程中作为载体使用基因工程中作为载体使用基因工程中作为载体使用基因工程中作为载体使用DNADNA分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒（plasmidplasmid），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体DNADNA之外之外之外之外一个能够自我复制、双链闭环裸露一个能够自我复制、双链闭环裸露一个能够自我复制、双链闭环裸露一个能够自我复制、双链闭环裸露DNADNA分子。分子。分子。分子。是否任何质粒都能够作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都能够作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都能够作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都能够作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用载体必需满足以下条件：思索与探究思索与探究 P7第31页1 1）载体载体载体载体DNADNA必需有必需有必需有必需有一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶切割位点，方便目标基因切割位点，方便目标基因切割位点，方便目标基因切割位点，方便目标基因能够插入到载体上去。这些供目标基因插入限制酶切点所处位能够插入到载体上去。这些供目标基因插入限制酶切点所处位能够插入到载体上去。这些供目标基因插入限制酶切点所处位能够插入到载体上去。这些供目标基因插入限制酶切点所处位置，还必须是置，还必须是置，还必须是置，还必须是在质粒本身需要基因片段之外在质粒本身需要基因片段之外在质粒本身需要基因片段之外在质粒本身需要基因片段之外，这么才不至于因，这么才不至于因，这么才不至于因，这么才不至于因目标基因插入而失活。目标基因插入而失活。目标基因插入而失活。目标基因插入而失活。2 2）载体载体载体载体DNADNA必需具备必需具备必需具备必需具备自我复制能力自我复制能力自我复制能力自我复制能力，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体上随染色体上随染色体DNADNA复制而同时复制复制而同时复制复制而同时复制复制而同时复制。3 3）载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需带有标识基因带有标识基因带有标识基因带有标识基因，方便重组后进行重组子筛选。，方便重组后进行重组子筛选。，方便重组后进行重组子筛选。，方便重组后进行重组子筛选。4 4）载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需是安全是安全是安全是安全，不会对受体细胞有害，或不能进入到，不会对受体细胞有害，或不能进入到，不会对受体细胞有害，或不能进入到，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外其它生物细胞中去。除受体细胞外其它生物细胞中去。除受体细胞外其它生物细胞中去。除受体细胞外其它生物细胞中去。5 5）载体载体载体载体DNADNA分子分子分子分子大小应适合大小应适合大小应适合大小应适合，方便提取和在体外进行操作，太，方便提取和在体外进行操作，太，方便提取和在体外进行操作，太，方便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在质粒实际上自然存在质粒实际上自然存在质粒实际上自然存在质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。第32页4、DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA本事吗？本事吗？迄今为止，所发觉迄今为止，所发觉DNA连接酶都连接酶都不不含有含有连接单链连接单链DNA能力，至于原因，现能力，至于原因，现在还不清楚，可能未来会发觉能够连接在还不清楚，可能未来会发觉能够连接单链单链DNA酶。酶。思索与探究思索与探究 P7第33页1.在基因工程中，切割运载体和含有目标基因DNA片段，需使用（）A.同种限制酶 B.两种限制酶C.同种连接酶 D.两种连接酶A课堂练习课堂练习第34页2.不属于质粒被选为基因运载体理由是不属于质粒被选为基因运载体理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、含有标识基因、含有标识基因 D、它是环状、它是环状DNAD课堂练习课堂练习第35页3.以下说法正确是以下说法正确是 （）A、全全部部限限制制酶酶只只能能识识别别一一个个特特定定核核苷苷酸酸序序列列 B、质粒是基因工程中唯一运载体、质粒是基因工程中唯一运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备条条件件之之一一是是：含含有有多多个个限制酶切点，方便与外源基因连接限制酶切点，方便与外源基因连接 D、基因控制性状都能在后代表现出来、基因控制性状都能在后代表现出来C课堂练习课堂练习第36页下课了!第37页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论达尔文达尔文达尔文达尔文提出提出提出提出生物进化论生物进化论生物进化论生物进化论第38页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论孟德尔孟德尔孟德尔孟德尔提出基因提出基因提出基因提出基因分离定律分离定律分离定律分离定律和和和和自由组合定律自由组合定律自由组合定律自由组合定律第39页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论 摩尔根摩尔根摩尔根摩尔根证实证实证实证实基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上，并提出基，并提出基，并提出基，并提出基因因因因连锁交换定律连锁交换定律连锁交换定律连锁交换定律。第40页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 艾弗里艾弗里艾弗里艾弗里证实证实证实证实DNADNA是遗传物质是遗传物质是遗传物质是遗传物质，DNADNA可从可从可从可从一个生物个体一个生物个体一个生物个体一个生物个体转移转移转移转移到另一个生物个体。到另一个生物个体。到另一个生物个体。到另一个生物个体。第41页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 沃森沃森沃森沃森、克里克克里克克里克克里克提出提出提出提出DNADNA双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构模型。模型。模型。模型。第42页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松、斯塔尔斯塔尔斯塔尔斯塔尔证实证实证实证实DNADNADNADNA半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制第43页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论克里克克里克克里克克里克等提出等提出等提出等提出中心法则中心法则中心法则中心法则DNADNARNARNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译逆转录逆转录逆转录逆转录复制复制复制复制第44页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 1963196319631963年年年年尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格和和和和马太马太马太马太破译编码氨基酸破译编码氨基酸破译编码氨基酸破译编码氨基酸遗遗遗遗传密码传密码传密码传密码，19661966年年年年霍拉纳霍拉纳霍拉纳霍拉纳用试验加以证实。用试验加以证实。用试验加以证实。用试验加以证实。第45页基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路1)基因转移载体发觉基因转移载体发觉2)工具酶发觉工具酶发觉3)DNA合成和测序技术创造合成和测序技术创造4)DNA体外重组实现体外重组实现5)重组重组DNA表示试验成功表示试验成功6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7)PCR技术创造技术创造第46页