生物技术2班王淼课件市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生物技术2班王淼第1页危害人类健康HBV第2页乙肝病毒探秘乙肝病毒是较小病毒之一，需在电子显微镜下放大几十万倍才能见到。乙肝病毒为直径42纳米（毫微米）双层园形颗粒（医学上称戴恩氏颗粒），它结构可比喻为一个鸡蛋，乙肝病毒外衣如同鸡蛋外壳，医学上把它称为乙肝表面抗原（HBsAg)；乙肝病毒关键部分相当于鸡蛋中卵黄，医学上称为乙肝关键抗原（HBcAg)乙肝病毒侵入人体肝脏时，把外衣扔在肝细胞膜外，而关键部分则长躯直入，在肝细胞核内开起了“病毒加工厂”。第3页显微镜下乙肝病毒第4页乙肝病毒在肝细胞核内栖息繁衍（医学称为复制），分别复制出乙肝表面抗原与关键抗原，二者在肝细胞内又组装成新一代乙肝病毒颗粒，并从肝细胞转移到血液中，随血液循环漫游全身各脏器。因为病毒外壳复制多于病毒关键复制，多出外壳大量释放到血液中，即可检出乙肝表面抗原阳性。乙肝关键抗原因深藏在肝细胞里，或被表面抗原紧紧包裹，所以在血液中难以测到。但它经常将一个片段释放出来，医学上把这个片段叫做e抗原(HBeAg)。所以，乙肝病毒在肝内繁殖复制时，血液中可查出表面抗原、e抗原，以及机体针对关键抗原而产生关键抗体（抗-HBc）。这三种标志物均阳性简称为“三阳”。第5页乙肝病毒对肝细胞并无直接损伤作用。肝细胞损伤是否，与人体免疫功效相关。人体有去除异己、保护本身抗病机构“免疫系统”。因为乙肝病毒关键部分盘踞在肝细胞核内，所以免疫系统要去除乙肝病毒，往往会同时破坏肝细胞。轻则表现为急性黄疸型或无黄疸型肝炎，重则表现为重症肝炎，重复发作则表现为慢性肝炎，成为肝硬化、肝癌根源。一部分人免疫系统与乙肝病毒“和平共处”，任其栖息繁衍，自生自灭，因而不产生免疫反应，肝细胞完整无损，肝功效正常，这就成为乙肝病毒携带者。第6页多数人感染乙肝病毒后，因为体内免疫系统作用，逐步产生能与表面抗原结合抗体，即乙肝表面抗体（抗-HBs）。其作用是中和表面抗原，使病毒无法继续装配完整病毒而繁殖下去所以，表面抗体阳性出现，说明人体对乙肝病毒已产生了足够抵抗力，并能预防乙肝病毒再次感染和发病。人体感染乙肝病毒后，经4-24周潜伏期，即出现不一样程度临床症状及类型。大多数为无任何症状隐性感染及仅有轻微不适亚临床感染者，而出现显著肝炎症状患者及成为慢性肝病毒携带者仅为少数。乙肝患者主要临床表现为肝区疼痛、肝脏肿大、黄疸、肝功效异常等。急性期普通连续1-2个月逐步痊愈。但也有10-20%病人可发展成慢性肝炎，其中少数发展成肝硬化或肝癌。第7页乙肝病毒特征（）含有顽强抵抗力对热、对低温、对干燥、对紫外线及普通浓度化学消毒剂，都能耐受；在零下度时可存活年；在度时可存活天，在度时依然能存活小时，酒精、来苏儿、碘酒等对它不起作用。不过，加热到度分钟可使其失去传染活性，对过氧乙酸、漂白粉、新洁尔灭敏感。第8页（）嗜肝性一旦入侵人体，就要侵袭肝脏，并在那里定居繁衍后代，这就是它们嗜肝性。据研究，这是因为肝细胞表面有一个“受体”缘故，专门接收。大量集中于肝细胞内，并在其中复制，不停侵袭，诱发肝细胞发生免疫损伤。第9页（）轻度泛嗜性所谓泛嗜性就是非肝脏组织它也侵袭，比如胆管上皮细胞、胰腺上皮细胞、肾小管细胞、胃黏膜细胞及血液中单核细胞等，侵入这些地方也可致病，如相关性肾炎、性糖尿病等。但这些泛嗜性并不一定会发生，很多人没有泛嗜性损害，所以说是“轻度”泛嗜性。主要还是侵袭肝脏。第10页（）严格种属特征到当前为止，只有些人、黑猩猩、长臂猿、狒狒对易于感染，即使在吸血昆虫体内检验到踪迹，但只是暂时“居住”而已，普通不会在它们体内复制和增殖。第11页（）感染慢性化我国感染有显著慢性化倾向，尤其是胎儿期及幼儿期感染，多为慢性化过程，长久携带，体内呈“免疫耐受”状态，不能将病毒去除，这个过程可长达年或更久，是主要传染源。第12页（）基因变异性是极度易变异病毒之一，它四个基因组（、）均可变异，变异是病毒特征，但往往给诊疗和治疗带来困难。（）致癌性现在已经必定，是肝癌主要病因，约肝癌有乙肝背景。有些人观察发觉，年乙肝病毒感染史者，约有发生癌变。癌变原因是基因整合到肝细胞基因上，发生突变，造成肝癌。第13页乙肝病毒复制之谜在医学上，病毒繁殖被称之为“复制”，这是因为它不像细胞和寄生虫那样经过细胞核分裂等方式繁殖，而是像我们铸造机器零件一样，按照一定模具复制出来。在复制过程中，有两个很主要原因：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个原因，乙肝病毒就不能复制。第14页大量复制乙肝病毒第15页HBV长久携带者，假如HBV-DNA与肝细胞DNA发生整合，人体免疫卫士不能对其识别，不产生攻击和追捕。这类HBV患者，在治疗方案上：在主动提升本身免疫力同时，还需打破免疫耐受。第16页乙肝病毒复制“催化剂”叫做乙肝病毒DNA聚合酶(HBVDNA-P)。这种酶存在于乙肝病毒内核，与乙肝病毒关键抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)和病毒基因(DNA)共同组成乙肝病毒关键。它作用就是催化乙肝病毒基因按照一定模板复制出DNA链。没有这种聚合酶作用，乙肝病毒复制就会停顿。所以，抑制乙肝病毒DNA聚合酶药品，即可直接抑制乙肝病毒复制。第17页乙肝病毒复制“原始模板”是cccDNA。这种原始模板是怎样形成呢？乙肝病毒基因组(DNA)是由两条螺旋DNA链围成一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整环状；另一条长度较短正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状DNA链要以负链为模板，在催化剂乙肝病毒DNA聚合酶作用下延长，最终形成完整环状。这时乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状双股DNA。我们把这种DNA称做共价闭合环状DNA(即cccDNA)，似乎能够把它看作是病毒复制原始模板。模板形成后，按照模板形状复制新病毒基因就很轻易了。病毒基因会以其中一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中酶和DNA聚合酶催化，一段基因又一段基因地复制，形成负链、正链。最终再装配到一起形成新乙肝病毒DNA颗粒。第18页有些人把cccDNA比做乙肝病毒复制“种子”，我却认为把它比做“野草根”更为适合。俗话说：“拔草轻易，除根难”，这种cccDNA是乙肝病毒复制中主要中间产物，一旦它在肝细胞核内形成，就含有了高度稳定性，可长久存在于肝细胞内，不但起着刚才所说“模板”作用，而且还像深深扎根在泥土里野草一样极难完全去除。不论用什么抗病毒药品，不论胞浆内DNA受到多大抑制，也不论用药时间有多久，均极难去除这种cccDNA。只要肝细胞内有极少许cccDNA，当停药后，核内cccDNA又可再次成为病毒复制模型，继续复制乙肝病毒DNA。这么就造成了一些抗病毒药品停药后“反跳现象”。第19页乙肝病毒复制也有“冬眠”时候。当感染机体乙肝病毒处于e抗原阴性、e抗体阳性“小三阳”状态时，就是乙肝病毒复制冬眠期。这时，乙肝病毒几乎无复制，它野草根cccDNA深深地隐藏在肝细胞核内处于休眠状态。但这种状态病毒还可能“复活”，可能因为某种原因诱发其重新转变为e抗原阳性病毒复制状态。在乙肝病毒冬眠期，病人病情相对平稳，传染性也很小，但当前全部抗病毒药品也对藏在细胞深处休眠病毒基因也奈何不得。所以，在这一时期使用何种抗病毒药品都是徒劳。人类从发觉乙肝病毒颗粒，到解开病毒复制之迷，又到现在抑制病毒DNA聚合酶药品发觉，一步一步地前进。相信很快，斩草除根药品、反抗“冬眠期”病毒药品将会出现，人类终究会战胜乙肝病毒一顽敌。第20页HBV在体内持久携带，易造成免疫功效紊乱，警觉肝脏相关疾病发生。所以不论有没有症状都需要定时检验。第21页乙肝病毒感染病毒模型研究新进展体外模型体内模型第22页一、体外模型乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染有高度种属和组织特异性，它只感染人和类人猿。其原因是病毒黏附以及病毒DNA转录及复制对细胞有严格要求1。体外培养人和类人猿原代肝细胞能够支持HBV复制，但细胞维持时间不长。能在体外长久培养肝源性肿瘤细胞株2.2.15是应用最广泛乙型肝炎细胞模型。将含有HBV基因组（个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联）重组载体质粒转染HepG2细胞，经G418筛选，得到克隆能稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒，可检测到细胞内DNA和RNA，但无cccDNA。2.2.15细胞模型存在问题是：HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不一样，且不能被去除；病毒复制水平不能人为改变；病毒复制水平低。第23页为克服HBV细胞膜屏障，人们借用其它病毒感染能力，把HBV导入到靶细胞。Delaney等2报道了一个抗HBV药品体外筛选系统，即HBV-杆状病毒-HepG2系统。利用杆状病毒AutographaCalifornia将含有复制能力HBV基因组导入到HepG2细胞，检测到高水平HBV表示，包含细胞内和细胞外HBVDNA和RNA，以及cccDNA和各种HBV抗原。病毒表示水平和病毒感染量（MOI）有量效关系。该系统能够控制感染时间，在病毒复制期间或之前对细胞进行处理。用该系统对拉米夫定药效进行评价，发觉拉米夫定能够降低细胞内复制中间体和细胞外HBVDNA,而且能够抑制cccDNA表示，这在以前系统中是不能观察到。拉米夫定作用有剂量和时间依赖性3。他们还用此模型检测了药品对HBV变异株作用4。第24页不过，杆状病毒系统也有缺点：(1)杆状病毒进入哺乳动物细胞是经过非特异内涵体摄取而不是受体介导方式；(2)杆状病毒感染每个细胞内有多个HBV拷贝；(3)杆状病毒介导基因转移限制在一定种属，更主要是不能作为动物体内试验方法。He等5采取Ad-HBV1.3-HepG2系统以腺病毒为载体，将1.3倍HBV转入包装细胞，再将包装好病毒感染HepG2细胞，能够产生高水平HBV表示。该系统利用细菌内同源重组法5，将含有同源性两个质粒pAdEasy和pAdTrack-CMV共转化E.coliBJ5183细胞，使腺病毒载体和目标基因HBV1.3连为一体。HBV1.3除含完整HBV基因组外，在5端还多出一段HBV序列，即ENHI和ENHII,XORF.PolyA1第25页转基因小鼠试验证实HBV1.3比HBV1.1和HBV1.2更高地表示HBV6。质粒pAdEasy含有不完整腺病毒Ad5基因，缺失E1区(1-3533)和E3区(28130-30820)，E1区对于病毒复制是必需，293细胞能够补充E1区。质粒pAdTrack-CMV含有目标基因HBV1.3,CMV开启子，绿色荧光蛋白基因（GFP），卡那霉素Kan,Pacl位点，pmel位点，在pmel两侧分别为两臂，左臂含Ad5第34931-35935核苷酸，右臂含Ad5第3534-5790核苷酸，两臂介导和pAdEasy同源重组。将pAdTrack-CMV用pmel酶线性化后，和环状pAdEasy共转化E.coliBJ5183细胞，利用卡那霉素抗性筛选重组体，再用限制酶pacI.speI.BamH1消化证实；重组成功质粒用pac1线性化，然后用脂质体法转染包装细胞293(人胚肾细胞)。观察绿色荧光蛋白表示，能够计算转染效率。第26页该载体含有以下优点：()含有大部分腺病毒基因组序列腺病毒骨架质粒，于超螺旋形式应用而不需要进行酶切处理；()重组是在含有高效同源重组机制细菌内进行而不是哺乳动物细胞内，省掉了连接步骤；()能够插入达10kb目标基因，而且能够在同一病毒内插入多个基因；()腺病毒骨架质粒上整合了绿色荧光蛋白基因，能够直接观察转染和感染效率，使得腺病毒监测问题变得更轻易5。Sprinzl等7利用AdHBV1.3，将293细胞包装好病毒感染数种原代肝细胞和HepG2细胞，取得成功。分别用Ad-HBV1.3感染人原代肝细胞，小鼠肝细胞，大鼠肝细胞，树鼠句肝细胞，以及鸭肝细胞和HepG2细胞，应用Southern杂交检测出细胞内HBVDNA，cccDNA,用northern杂交检测到3.5kb、2.4kb和2.1kbHBVRNA。用westernblot检测到HBV各种抗原。应用斑点杂交方法检测到培养基或血清中HBV颗粒。该系统使HBV能够感染跨种各种细胞，包含小鼠，大鼠，树鼠句肝细胞，甚至包含禽类鸭肝细胞。以DHBV代替HBV也能得到相同结果。和2.2.15系统相比，它含有高效转移、表示HBV，可对HBV突变和表示进行人为控制等优点；和杆状病毒系统相比，它不存在种属障碍，能够用做体内试验，而且表示水平更高。第27页二、体内模型类人猿和黑猩猩作为HBV感染模型已得到公认，但价格昂贵，难以推广。土拨鼠肝炎病毒（WHV）慢性感染土拨鼠能够发展为严重肝炎和肝肿瘤，和人感染HBV后发病过程非常相同。给新生土拨鼠接种WHV,可取得慢性WHV感染土拨鼠模型。慢性WHV携带土拨鼠平均寿命为29个月，最终几乎全部都发展为肝肿瘤。土拨鼠还可作为抗病毒药品临床前评价工具，研究药品药效、药品动力学以及毒理，也可用作评价免疫治疗疗效8。用土拨鼠局限是：它们感染肝炎病毒为WHV，和HBV有一定差异，使对乙型肝炎发病机理和机体应答研究受到限制。第28页研究发觉树鼠句能够感染HBV，严瑞琪等9发觉HBV感染树鼠句HBsAg血症者47%，平均连续7周，HBVDNA阳性率51%，连续41周以上；肝细胞HBVDNA阳性率67%，并存在复制型HBVDNA。用感染HBV树鼠句血清可连续传代感染。但国外报道有所不一样，将新生树鼠句和成年树鼠句腹腔接种HBV阳性患者血清，都在血清中检测到HBsAg,24周后血清中检测到抗HBs,抗HBc，抗HBe，而HBsAg消失，类似急性肝炎病程。说明在树鼠句感染HBV是一过性，HBV复制和表示水平不高。第29页Sprinzl等7利用Ad-DHBV1.3系统，将293细胞包装好病毒颗粒以尾静脉接种小鼠，5d后处死小鼠，8只小鼠中有7只肝脏中用Southernblot检测出复制型DHBV,用PCR检测出全部小鼠血清中有DHBV,都没有腺病毒DNA。用这些鼠血清能够感染原代鸭肝细胞，而且和DHBV阳性鸭血清感染效率相当。说明DHBV也能够经过腺病毒转移到小鼠肝脏并支持DHBV体内复制。近年来HBV转基因小鼠受到重视。将HBV目标基因显微注射到小鼠受精卵，产生稳定整合HBV小鼠。在目标基因选取上，能够是HBV全长或超出其基因组1.3倍HBV，也能够是HBV片段，如前s、s、c和x基因，用于研究各基因及其表示产物在HBV生活史中作用。HBV转基因小鼠不但能够研究HBV感染过程和感染后免疫病理改变10，还有利于发展新抗病毒治疗方法。第30页HBV转基因小鼠试验发觉在慢性HBV携带者因为一个抗原提呈细胞（树突状细胞）功效缺点和缺乏一些必要细胞因子，不能有效提呈HBsAg,不能去除病毒，造成连续感染11。不过在全部HBV转基因小鼠都不能检测到细胞内cccDNA,而cccDNA是前基因组及各种长度RNA转录模板，在HBV复制过程中起着非常主要作用，而当前抗病毒治疗主要是在反转录和复制水平抑制病毒DNA，而且HBV是整合在宿主染色体上，没有经过和靶细胞受体结合穿透过程，与自然感染不一样，应用也受到限制。第31页为克服转基因鼠缺点，人们寻求一个模拟HBV自然感染动物模型。Dandri等12将UPA转基因小鼠和RAG-2基因剔除小鼠杂交，得到后代被移植入人肝细胞。因为UPA是一个纤维蛋白酶原激活剂，它选择性地在肝细胞表示，使肝细胞中蛋白质水解，造成UPA小鼠体内肝细胞连续损伤，产生肝再生刺激信号，有利于外源肝细胞存活。而RAG-2基因剔除小鼠因为缺失重组活化基因RAG-2,T细胞和B细胞不能成熟第32页不具备完整体液和细胞免疫功效，对外源肝细胞不排斥。二者杂交后代兼有以上两种特征，能够支持HBV感染和表示。试验中采取脾内注射人肝细胞悬液，在小鼠血清和肝脏中均检测到HBV各种抗原和复制中间体。该模型能够用于HBV感染过程和治疗研究，以及肝癌发生机理，但因采取是免疫缺点鼠，不能作为机体和病毒相互作用尤其是免疫去除机理研究。另外，人肝细胞移植效率很低，只占小鼠肝脏15%，而采取一样方法移植土拨鼠肝细胞，则可占小鼠肝脏90%以上，可能和移植肝细胞活力高低相关。第33页从已经有HBV体内外模型看来，Ad-HBV1.3-HepG2系统是较为理想，能够用做体内体外试验，研究HBV生物学，判断抗乙型肝炎药品及其它治疗伎俩疗效，不过不能用作研究病毒黏附，致癌机制等。HBV体内体外模型还需要深入探索。第34页乙肝病毒四种传输路径母婴传输血液传输性接触传输日常生活接触传输第35页第36页母婴传输在我国，母婴传输是造成人群乙肝病毒高携带率主要原因。孕妇若是乙肝病人或乙肝病毒携带者，就可经过胎盘、分娩过程中母血、羊水或产后乳汁、唾液等将乙肝病毒传染给自己孩子，这就是通常所说母婴传输。乙肝母婴传输能够发生在分娩过程中，因为孕妇血液和子宫颈、阴道分泌液中都含有乙肝病毒，胎儿分娩时或因胎盘剥离、绒毛破损，母血可直接向胎儿渗透，再因新生儿皮肤矫嫩，分娩时可能有擦伤，经接触或吞咽产道中血和分泌物而感染。剖腹产也不能幸免，因剖腹产时也有胎盘剥离过程，胎儿也要经过含有母血子宫切口。另外，产后在喂养过程中，也可造成乙肝病毒感染，因为母乳及其唾液中都可含有乙肝病毒。当前研究经过对乙肝病毒（HBV）进行分子水平研究，证实孕妇被感染单个核细胞可经过胎盘传给胎儿传输机制，深入说明，HBV宫内感染是母婴间传输最主要路径，当前办法难以阻断对新生儿感染。第37页血液传输 乙肝病毒经过输血、注射及伤口污染等路径传输。假如献血者为乙肝病毒携带者，就会经过输血使受血者感染乙肝病毒。现已证实，只要给人注入千万分之一毫升含有乙肝传染性血液，即可引发感染，注入万分之一毫升就会发病。所以，乙肝病人或病毒携带者使用过注射器，假如没有严格消毒或仅换一个针头而不换针筒再给他人注射，就会造成传染。尤其在街头拔牙、耳垂穿孔、纹身等，因为器械未经彻底消毒而传输乙肝危险性最大。另外，与他人共用牙刷、剃须刀也轻易传输乙肝病毒第38页性接触传输乙肝病人或病毒携带者唾液、精液、阴道分泌物均含有乙肝病毒，所以，夫妻中一方带乙肝病毒时，可经过性生活传给对方；性乱和卖淫嫖娼者更易传输。第39页日常生活接触传输在家庭、学校内和集体生活过程中，因亲密接触乙肝病人或病毒携带者而引发传输。当含有乙肝病毒唾液、汗液、尿液、精液、月经血、阴道分泌物和鼻腔分泌物等体液污染了食具、茶具、牙刷、手帕、衣服、现金等，均可引发乙型肝炎传输。第40页第41页