高中生物第章基因工程第节基因工程的操作程序目的基因的获得基因表达载体的构建同步备课教学案.doc

专题课件
第1课时　目的基因的获得、基因表达载体的构建
[目标导读]　1.阅读教材P72～74图文，掌握获取目的基因的两种方法。2.结合教材P77图4－11，理解基因表达载体的构建过程。
[重难点击]　1.目的基因的含义及常用获取方法。2.基因表达载体的构建。3.大肠杆菌质粒DNA的提取。

抑制疾病传播的转基因蚊子巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！
一、目的基因的获得

1．目的基因：是指人们所需要的进行研究的基因，如抗虫基因、抗病基因等。
2．获取目的基因的方法
(1)化学合成法
①概念：利用化学反应直接合成基因。
②适用条件：已知核苷酸序列的、相对分子质量较小的目的基因。
③仪器：DNA自动合成仪。
④缺点：成本昂贵，不适用于序列未知的目的基因。
(2)从基因组中直接分离法——鸟枪法(如图所示)

(3)PCR扩增：在掌握了目的基因的部分或全部信息后，可以设计引物，利用DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因。
(4)反转录法
以mRNA为模板，借助反转录酶，通过PCR仪合成与mRNA序列互补的DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的目的基因。

如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。据图分析：

1．图示分别是哪种方法？是在体内还是体外进行的？
答案　三种方法分别是：反转录法、直接分离法和化学合成法，都是在体外进行的。
2．三种方法都需要酶，分别是哪些酶？
答案　方法a需要反转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制性内切酶；方法c需要DNA聚合酶。
3．三种方法获取的目的基因的碱基对的排列顺序都相同吗？
答案　不都相同。方法b得到的是天然基因，方法a得到的目的基因和天然基因相比不含内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种。

1．下列获得目的基因的方法中需要模板链的是(　　)
①化学合成法　②鸟枪法　③反转录法　④PCR扩增目的基因
A．①② B．②③ C．③④ D．①③
答案　C
解析　化学合成法是利用DNA自动合成仪合成已知核苷酸序列的较小的基因。鸟枪法是用很多个限制性内切酶去切割DNA获得目的基因，和化学合成法一样不需要模板。反转录法利用mRNA作为模板反转录出一条单链DNA，然后以这条单链的DNA为模板合成出双链的DNA，也是目的基因。PCR技术也需要模板。
2．下列属于PCR技术的条件的是(　　)
①单链的脱氧核糖核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段　③脱氧核糖核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制性内切酶
A．①②③⑤ B．①②③⑥
C．①②③⑤⑦ D．①②④⑤⑦
答案　B
解析　PCR技术需要一对引物，即一对单链的脱氧核糖核苷酸序列引物，①正确；PCR技术需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正确；需要脱氧核糖核苷酸作为原料，③正确；核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④错误；采用PCR合成DNA时，不需要DNA连接酶，而需要DNA聚合酶，⑤错误、⑥正确；体外合成DNA时，不需要限制性内切酶，⑦错误。
知识拓展　PCR技术的基本原理和过程
(1)原理：DNA双链复制。
(2)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
(3)过程
第一步：加热至94～98 ℃，DNA解链为单链；
第二步：冷却至40～60 ℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至72 ℃左右，热稳定DNA聚合酶(TaqDNA酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
(4)结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
二、基因表达载体的构建

1．实验：大肠杆菌质粒DNA的提取
(1)实验原理
释放

(2)方法步骤
①在超净工作台上(或在酒精灯旁)，取1 mL含质粒的大肠杆菌菌液，接种于100 mL LB培养基中，于37 ℃摇床振荡培养8～10 h，如无摇床可每0.5 h用手摇晃一次。
②取1.4 mL菌液于1.5 mL EP管中，以10 000 rpm离心0.5 min，弃上清液。
③加0.1 mL预冷的溶液Ⅰ，充分混合。
④加入0.2 mL溶液Ⅱ轻轻翻转混匀，静置5 min(溶液Ⅱ要现配现用)。
⑤再加入0.15 mL预冷溶液Ⅲ，轻轻翻转混匀，静置5 min。
⑥以10 000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管中。
⑦加入等体积预冷的异丙醇或乙醇，混匀后静置于冰箱的冷冻室20～30 min。
⑧10 000 rpm离心15 min，弃上清液。待沉淀稍干后，溶于50 μL蒸馏水中。
⑨取两支试管，分别加入1 mL蒸馏水，其中的一支加入提取的质粒DNA溶液，向两支试管中各加入1 mL二苯胺，混匀后，放入沸水中加热5 min。
⑩待试管冷却后，观察两支试管中溶液颜色的变化发现，加入提取的质粒DNA的溶液变蓝，另一个不变色。
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的原因
①单个基因或DNA片段导入另一生物体的细胞后，往往会被细胞内的防御系统消灭掉，降低了目的基因的表达效率。
②将目的基因和运载体一起进入受体细胞，可以保护目的基因不被受体细胞识别并破坏。
(2)构建过程
①用限制性内切酶切割质粒，使环状质粒出现一个切口，露出DNA末端。
②用同样的限制性内切酶切割目的基因，暴露出两个与质粒相同的DNA末端。
③用DNA连接酶使质粒和目的基因结合成新的环状质粒DNA分子表达载体。

结合下图重组质粒的构建过程分析：

1．图中①和②分别用到哪种酶？
答案　①用限制性内切酶，②用DNA连接酶。
2．同一种限制性内切酶切割后的质粒和目的基因片段混合后，是不是一定是质粒和目的基因结合？
答案　不一定。也可能发生质粒的自我环化或者目的基因的自我环化。
3．重组质粒上除了具有目的基因外，为了方便监测和筛选，还应具备哪种基因？
答案　遗传报告基因。

3．下列关于图中P、Q、R、S、G的描述，正确的是(　　)

A．P代表的是质粒RNA，S代表的是外源DNA
B．Q表示限制性内切酶的作用，R表示RNA聚合酶的作用
C．G是RNA与DNA形成的重组质粒
D．G是转基因形成的重组质粒DNA
答案　D
解析　质粒是很小的环状DNA分子，因此P是质粒DNA，S是外源DNA，G是质粒和外源DNA通过DNA连接酶连接而成的重组质粒；质粒和外源DNA需要经过同一种限制性内切酶切割出相同的黏性末端。
4．如图为基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是(　　)

A．氨苄青霉素抗性基因 B．启动子
C．限制酶 D．DNA连接酶
答案　B
解析　启动子是该表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程。氨苄青霉素抗性基因可以作为报告基因，但不是必须用它作报告基因。限制酶和DNA连接酶都不是表达载体所需要的。
知识拓展　基因表达载体的构成

目的基因的获得

基因表达载体的构建

1．在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得无关的是(　　)
A．辐射诱变法 B．从cDNA中获取
C．反转录法 D．人工合成法
答案　A
2．如图为用于基因工程的一个质粒示意图。用EcoRⅠ限制性内切酶切割目的基因和该质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培养基中培养：a—无抗生素的培养基，b—含四环素的培养基，c—含氨苄青霉素的培养基，d—含四环素和氨苄青霉素的培养基。含重组质粒的大肠杆菌能生长的是(　　)

A．a B．a和c
C．a和b D．b和c
答案　B
3．不属于目的基因与运载体结合过程的是(　　)
A．用一定的限制性内切酶切割质粒，露出黏性末端
B．用同种限制性内切酶切割目的基因，露出黏性末端
C．将切下的目的基因插入质粒的切口处
D．将重组DNA引入到受体细胞中进行扩增
答案　D
4．下列哪项不是表达载体所必需的组成(　　)
A．目的基因 B．启动子
C．终止子 D．抗青霉素基因
答案　D
5．下面是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。

请据图回答：
(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在________________的催化下，合成互补的单链DNA，然后在__________________作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的____________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________________序列，再通过化学方法合成所需基因。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有__________、__________、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(3)由A和运载体B拼接形成的C通常称为______________________。
答案　(1)反转录酶　DNA聚合酶　氨基酸　脱氧核糖核苷酸　(2)引物　模板(A基因)　(3)基因表达载体
解析　(1)利用反转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在反转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核糖核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物等条件。(3)目的基因和运载体结合，形成基因表达载体。
课时作业
[基础过关]
1．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是(　　)
A．结构简单，操作方便
B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少
D．性状稳定，变异少
答案　B
2．从浩瀚的“基因海洋”中获得特定目的基因的方法有(　　)
①从供体细胞的基因组中直接分离基因　②从受体细胞的基因组中直接分离基因　③化学合成法　④复制
A．①② B．①③ C．③④ D．②④
答案　B
解析　基因工程获取目的基因的方法有两种：一是化学合成法；二是从基因组中直接分离法。
3．下列有关PCR技术的说法，不正确的是(　　)
A．PCR技术的原理是DNA双链复制
B．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
C．PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
D．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
答案　B
解析　PCR扩增中不使用解旋酶，是利用高温破坏氢键解开双链DNA的，B错误。
4．下列对基因表达载体构建的叙述，不正确的是(　　)
A．需要限制性内切酶和DNA连接酶等特殊工具
B．基因表达载体中有的含有启动子和密码子
C．标记基因不一定是抗生素抗性基因
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
答案　B
解析　基因表达载体是目的基因与运载体的结合，在此过程中需用同一种限制性内切酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来，A正确；基因表达载体含有启动子、终止子、标记基因和目的基因，密码子位于mRNA上，B错误；抗生素抗性基因可作为标记基因，但标记基因不都是抗生素抗性基因，C正确；基因表达载体的构建是基因工程的核心，在细胞外进行，使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，D正确。
5．由于质粒与目的基因具有相同的黏性末端，结合过程中不可能出现下列哪种情况(　　)
A．可能形成环状的外源DNA
B．可能形成环状的载体DNA
C．可能出现重组DNA
D．只出现重组DNA
答案　D
6．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是(　　)
①一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
A．②③ B．①④
C．①② D．③④
答案　B
解析　一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及报告基因等。由于目的基因的不同，所以构建的基因表达载体也是不同的。其中，启动子是与RNA聚合酶结合的位点，控制着转录的开始；而终止子控制着转录的结束。
[能力提升]
7．有关基因工程的叙述，正确的是(　　)
A．限制性内切酶只在获取目的基因时才用
B．重组质粒的形成是在细胞内完成的
C．质粒都可以作为运载体
D．蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索
答案　D
8．小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(　　)
①设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
②用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
③PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
④一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
A．①④ B．②③
C．②④ D．④
答案　C
解析　要考虑表达载体相关序列，从而保证目的基因能与表达载体相连接及正常表达；只要设计出目的基因的引物，接下来即可自动进行；需要特殊的耐高温的DNA聚合酶，从细胞内提取的DNA聚合酶不耐高温；选择特定合适的受体细胞，从而保证目的基因能表达出所需产物。C正确。
9．如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、Apa Ⅰ为四种限制性内切酶。下列说法错误的是(　　)

A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制性内切酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
答案　B
解析　图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制性内切酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
10．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个(　　)

A．8 B．6 C．4 D．2
答案　A
解析　由图分析可知：X基因第一次复制得到两个两种DNA分子：①和②；X基因第二次复制得到四个四种DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第三次复制得到八个五种DNA分子：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤得到4个⑤。从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个⑤。
11．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性内切酶切割DNA分子后会产生__________末端。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
…G　　　　AATTC…
…CTTAA　　　　G…
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_____________________________________。
(3)反转录作用的模板是____________，产物是____________。若要在体外获得大量反转录产物，可采用____________________________________。
(4)基因工程中除质粒外，______________和______________也可作为运载体。
答案　(1)黏性　(2)切割产生的DNA片段黏性末端与EcoRⅠ切割产生的相同　(3)mRNA(或RNA)　DNA　DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因　(4)噬菌体　动植物病毒
解析　(1)DNA分子经限制性内切酶切割会产生黏性末端。(2)为了保证目的基因与运载体相连，用另一种限制性内切酶切割后形成的黏性末端必须与EcoRⅠ切割形成的黏性末端相同。(4)反转录的模板是mRNA，产物是DNA。大量扩增反转录产物可使用DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因。(5)在基因工程中使用的运载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
12．HIV属于反转录病毒，是艾滋病的病原体。用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的________，以其作为模板，在______________的作用下合成________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。
答案　RNA　反转录酶　cDNA(或DNA)
解析　HIV是RNA病毒，其核酸是单链RNA，而在基因工程中构建目的基因表达载体时，运载体一般用的是质粒，为双链DNA，故先用反转录酶催化HIV的RNA反转录为DNA分子，再进行基因工程操作。
13．很久以前，科学家在土壤中发现了某种细菌能制造一种对昆虫有毒的蛋白质，当时许多人就想把编码这一蛋白质的基因(抗虫基因)转移到农作物中，以降低昆虫对农作物造成的危害。20世纪90年代，美国科学家采用基因工程技术首次培育出抗虫玉米新品种。下图为这一转基因玉米的主要培育过程。

(1)获得特定目的基因的途径除了从该细菌中直接分离抗虫基因外，还可以____________。将目的基因与运载体结合时必须用____________酶和DNA连接酶。在基因工程中，最常用的运载体是____________，而作为运载体必须具备相应的条件，例如，应具有____________以便进行筛选。
(2)由转基因玉米细胞经过____________形成愈伤组织，然后发育成胚状体和试管苗。若要制备转基因玉米的人工种子，可选择上述实验过程中的______________再包裹合适的__________等。
答案　(1)化学合成　同种限制性内切　质粒　报告基因　(2)脱分化(或去分化)　胚状体　人造种皮
[真题体验]
14．(2015·重庆，6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　)
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
答案　C
解析　人肝细胞不能合成胰岛素，则人肝细胞中不含有胰岛素的mRNA，不能通过反转录获得人胰岛素基因，A错误；表达载体的复制启动于复制起点，胰岛素基因的表达启动于启动子，B错误；抗生素抗性基因是标记基因，可用于筛选含胰岛素基因的受体细胞，C正确；启动子在转录过程中起作用，终止密码子在翻译过程中起作用，D错误。