生物芯片原理省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、 生物芯片原理生物芯片原理 principle of biochip 医学院病毒所医学院病毒所第1页本章提要本章提要l生物芯片介绍生物芯片介绍l生物芯片分类生物芯片分类l基因芯片基本原理、流程与应用基因芯片基本原理、流程与应用l蛋白质芯片及应用蛋白质芯片及应用第2页第一节第一节 生物芯片介绍生物芯片介绍 一、一、什么是生物芯片什么是生物芯片 生生物物芯芯片片主主要要指指经经过过平平面面微微细细加加工工技技术术,在在固固体体芯芯片片等等载载体体上上微微型型生生物物化化学学分分析析系系统统,以以实实现现对对细细胞胞、蛋蛋白白质质、核核酸酸以以及及其其它它生生物物组组分分准准确确、快快速速、大大信信
2、息息量量检检测测第3页芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子,能快速准确地检测细胞、蛋白生物分子,能快速准确地检测细胞、蛋白质、质、DNA及其它生物组分,并获取样品及其它生物组分,并获取样品中相关信息,其效率是传统检测方法成百中相关信息,其效率是传统检测方法成百上千倍。上千倍。第4页生物芯片分析过程生物芯片分析过程试样处理试样处理点阵固定点阵固定反应或杂交芯片制作标识洗涤检测扫描检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标识光化学检测电化学检测计算处理第5页 基因芯片基因芯片最大优点在于其高通量最大优点在于其高通量。传统方法。传统方法检测众多基因要经历屡次试验
3、而且自动化程检测众多基因要经历屡次试验而且自动化程度低,因而每次试验之间是存在系统误差。度低,因而每次试验之间是存在系统误差。基因芯片能够克服这个缺点,基因芯片能够克服这个缺点,众多基因探针众多基因探针标识、杂交等过程是在一次试验过程中完成,标识、杂交等过程是在一次试验过程中完成,而且自动化程度高,数据客观可靠而且自动化程度高,数据客观可靠第6页l1996年美国年美国Affymetrix企业成功地制作出世界企业成功地制作出世界上首批用于药品筛选和试验室试验用生物芯片,上首批用于药品筛选和试验室试验用生物芯片,并制作出对应芯片系统。另外,美国并制作出对应芯片系统。另外,美国Hyseq企企业、业、
4、Aurora企业、企业、Nanogen企业、企业、Incyte企业企业等也在主动开展等也在主动开展DNA芯片研究工作。近二年,芯片研究工作。近二年,摩托罗拉、惠普、摩托罗拉、惠普、IBM等跨国企业也相继投以等跨国企业也相继投以巨款加入生物芯片研究开发。巨款加入生物芯片研究开发。第7页l我国是从一九九七年开始对生物芯片研究。l中国医药生物技术协会生物芯片分会在北京成立。l中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五大生物芯片研发和产业化基地。l我国生物芯片产业还未形成统一技术标准,不规范。在产品认证认可方面也存在与国际通例不接轨情况。第8页l生物芯片技术是生物芯片技术是20世纪世纪90年代以来,影
5、响年代以来,影响最为深远重大科技进展。它是继大规模集最为深远重大科技进展。它是继大规模集成电路之后又一次含有深远意义科学技术成电路之后又一次含有深远意义科学技术革命。革命。l该技术被评为该技术被评为1998年度世界十大科技进展年度世界十大科技进展之一。之一。第9页发展趋势发展趋势 缩微芯片试验室缩微芯片试验室 生物芯片研究领域一生物芯片研究领域一个热点,它是将传统生物化学样品制备、个热点,它是将传统生物化学样品制备、生化反应、检测三个步骤集于一体,缩生化反应、检测三个步骤集于一体,缩小组成芯片上试验室系统小组成芯片上试验室系统第10页第二节第二节 生物芯片分类生物芯片分类第11页普通分类第12
6、页 信息生物芯片和功效生物芯片信息生物芯片和功效生物芯片第13页第三节基因芯片基本原理与流程第三节基因芯片基本原理与流程第14页 基基因因芯芯片片技技术术是是指指经经过过微微阵阵列列(Microarray)(Microarray)技技术术将将高高密密度度DNADNA片片段段阵阵列列经经过过高高速速机机器器人人或或原原位位合合成成方方式式以以一一定定次次序序或或排排列列方方式式使使其其附附着着在在如如玻玻璃璃片片等等固固相相表表面面,以以荧荧光光标标识识DNADNA探探针针,借借助助碱碱基基互互补补杂交原理,进行大量基因表示及检测等研究技术。杂交原理,进行大量基因表示及检测等研究技术。第15页基
7、因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern and Northern Southern and Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMacroarrayMacroarray第16页RNADNA1DNA2ProbeSouthernhybridizationNorthernhybridizationHybridization of Nucleic Acids第17页Amino acid sequenceGLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC-Nuclei
8、c acid sequenceSynthesizingoligonucleotidePROBE GGGGACGAGTCCTCCGTTCTThe nucleic acid sequence isDeduced from amino acid sequenceChemical synthesisPreparation of Traditional Nucleic Acid Probe第18页基因芯片分类基因芯片分类l按芯片制备方法分类按芯片制备方法分类 原位合成芯片(原位合成芯片(synthetic genechip)DNA微阵列芯片(微阵列芯片(DNA microarray)l按探针分类按探针分
9、类 寡核苷酸阵列寡核苷酸阵列 DNA阵列阵列 基因芯片基因芯片 cDNA芯片芯片 RNA芯片芯片第19页Types of DNA Chips第20页生物芯片原理l生物芯片利用空间位置固定事先已知核酸、蛋生物芯片利用空间位置固定事先已知核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物分子白质、脂质和碳水化合物分子l芯片技术对固定相分子要求较高,要求生物分芯片技术对固定相分子要求较高,要求生物分子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性稳子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性稳定。定。l在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结合所亲和分子,预防其在杂交洗涤过程中被冲合所亲和分子,
10、预防其在杂交洗涤过程中被冲洗掉,确保检测信息准确可靠。洗掉,确保检测信息准确可靠。第21页l制作芯片片基材料首先必须有很好制作芯片片基材料首先必须有很好光学性质,光学性质,能利用能利用光进行透射和反射检测光进行透射和反射检测l芯片表面含有能够进行化学反应芯片表面含有能够进行化学反应活性基团,活性基团,方便生物方便生物分子偶联而固定分子偶联而固定l芯片表面活性化学基团有足够芯片表面活性化学基团有足够吸附能力,吸附能力,要能结合最要能结合最正确容量生物分子正确容量生物分子l芯片要有很好稳定性,含有一定抗压能力,而且在生芯片要有很好稳定性,含有一定抗压能力,而且在生物分子杂交反应过程中要处于物分子杂
11、交反应过程中要处于惰性状态,惰性状态,不会发生其不会发生其它化学反应或其它物质吸附它化学反应或其它物质吸附l生物芯片要有很好生物芯片要有很好兼容性,兼容性,能够广泛应用于生物学检能够广泛应用于生物学检测和研究测和研究芯片片基第22页生物分子与芯片结合l生物芯片表面活性基团形成生物芯片表面活性基团形成特异亲和生物分特异亲和生物分子位点,子位点,用来吸附和固定生物活性分子,比用来吸附和固定生物活性分子,比如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等l依据芯片基片表面活性基团类型,芯片能够依据芯片基片表面活性基团类型,芯片能够分为分为氨基片、醛基片、环氧乙基片和氨基片、醛基片、环氧乙
12、基片和N一羟一羟基琥珀酰亚胺酯片基琥珀酰亚胺酯片l依据不一样需要来选取芯片,如对大分子依据不一样需要来选取芯片,如对大分子DNA吸附要用氨基片,对寡聚核苷梭或小片吸附要用氨基片,对寡聚核苷梭或小片段段DNA要用醛基片要用醛基片第23页a.氨基片氨基片 表面为氨基,直接与核酸分子磷酸基团靠电表面为氨基,直接与核酸分子磷酸基团靠电荷作用相结合荷作用相结合b.醛基片醛基片 表面醛基直接与生物分子氨基共价结合表面醛基直接与生物分子氨基共价结合第24页c.环氧已基片环氧已基片 表面环氧已基直接与生物分子氨基表面环氧已基直接与生物分子氨基共价结合;共价结合;d.N-羟基琥珀酰亚胺酯片羟基琥珀酰亚胺酯片 表
13、面表面N-羟基琥珀酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯基直接与生物分子氨基共价结合。酯基直接与生物分子氨基共价结合。第25页DNA Chip TechnologylSolid support.glass,plastic,metal,silicon.lMiniaturized array of DNA(genetic material)lWork on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationlHybridized probes(DNA molecules)are fluorescently labeled第26页Comparison of DNA
14、Chip Technologies Sensitivity of DNA chip assaysSensitivity of DNA chip assaysn nProbe and target DNA/RNA ComplexityProbe and target DNA/RNA Complexityn nChip surface(autofluorescence and non-spec.bkg)Chip surface(autofluorescence and non-spec.bkg)n nAttachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&A
15、ttachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)crosshyb.)n nHybridization efficiency(lots of factors)Hybridization efficiency(lots of factors)n nDetection technology(signal type,efficiency,noise)Detection technology(signal type,efficiency,noise)Oligo-Chip Oligo-Chip cDNA-Chip cDNA-Chip Gen
16、omic Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 8 n or 20 n 50,000 n 50,000 nsequencingsequencingexpressionexpressionexpressionexpressiongenomic analysisgenomic analysis第27页基因芯片原理基因芯片原理 依据双螺旋原理,核酸分子杂交依据双螺旋原理,核酸分子杂交技术,在靶标样品与探针之间进行选技术,在靶标样品与探针之间进行选择性反应,将反应一方,探针固定在择性反应,将反应一方,探针固定在芯片上,另一方,荧光标识制备好芯片上,另一方,荧光标识制备好cDNA,
17、分别标识绿色,分别标识绿色Cy3和红色和红色Cy5经过流路或加至芯片上。经过流路或加至芯片上。第28页基基 因因 芯芯 片片 流流 程程样品制备样品制备芯片制备芯片制备杂交杂交杂交信号检测杂交信号检测数据分析数据分析第29页Each spot contains known DNAComplementary DNA hybridizeSignal appearsBiochip Based on Hybridization第30页试验流程第31页第32页第33页影响杂交反应原因影响杂交反应原因 1 探针浓度探针浓度 其浓度差异对信号有影响,浓度高信其浓度差异对信号有影响,浓度高信号强。号强。2 阳
18、离子阳离子 阳离子存在可提升异源杂交双链生成速阳离子存在可提升异源杂交双链生成速度。度。3 温度温度 ONA2542 C,cDNA 5570 C 4 序列组成序列组成 芯片上一次产生上万个异源杂交反应,芯片上一次产生上万个异源杂交反应,应选择最协调条件。应选择最协调条件。5 高灵敏度监测系统,阅读仪。高灵敏度监测系统,阅读仪。第34页 基因芯片检测原理 荧光扫描成像用激光激发芯片上样品发射荧荧光扫描成像用激光激发芯片上样品发射荧光,严格配正确杂交分子,其热力学稳定性较光,严格配正确杂交分子,其热力学稳定性较高,荧光强;而不完全杂交分子热力学稳定性高,荧光强;而不完全杂交分子热力学稳定性低,荧光
19、信号弱;不杂交无荧光。不一样位点低,荧光信号弱;不杂交无荧光。不一样位点信号被扫描后由计算机软件处理,并对每个点信号被扫描后由计算机软件处理,并对每个点荧光强度数字化后进行分析。荧光强度数字化后进行分析。第35页基因芯片数据分析 图像分析,图像分析,Ratio值分析,基因聚类分析值分析,基因聚类分析 图像分析图像分析 激光扫描仪得到扫描图像文件经过划格,激光扫描仪得到扫描图像文件经过划格,确定杂交斑点位置,然后经过过滤背景噪音,提取确定杂交斑点位置,然后经过过滤背景噪音,提取得到荧光信号强度值,最终以数据列表形式输出。得到荧光信号强度值,最终以数据列表形式输出。这一系列工作都是依靠软件来完成,
20、如这一系列工作都是依靠软件来完成,如Biodiscovery,Imagene 7.0分析软件。分析软件。第36页 Ratio值分析值分析 在惯用双色荧光芯片系统下,各杂交斑点两色在惯用双色荧光芯片系统下,各杂交斑点两色荧光荧光cy3cy5比值又称比值又称R/G值。普通认为值。普通认为RG值值在在0.52.0范围内基因不存在显著表示差异,该范范围内基因不存在显著表示差异,该范围之外则认为基因表示出现显著改变。围之外则认为基因表示出现显著改变。因为试验条件不一样,该域值范围会依据置信区因为试验条件不一样,该域值范围会依据置信区间进行调整。处理后得到信息能够依据需要以各种间进行调整。处理后得到信息能
21、够依据需要以各种形式输出,如柱形图、饼形图、点图、原始匡像拼形式输出,如柱形图、饼形图、点图、原始匡像拼图等。将每个信号斑点全部相关信息如位标、基因图等。将每个信号斑点全部相关信息如位标、基因名称、克隆号、名称、克隆号、PCR结果、信号强度、结果、信号强度、Ratio值等值等自动关联并依据需要筛选数据。自动关联并依据需要筛选数据。第37页 聚类分析聚类分析 clustering analysis 从生物芯片图像分析中可得到大量数据,要从从生物芯片图像分析中可得到大量数据,要从中提取所需要信息就必须对这些数据统计分析。经中提取所需要信息就必须对这些数据统计分析。经过建立各种数学模型,分析芯片图像
22、数据生物学意过建立各种数学模型,分析芯片图像数据生物学意义。义。聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类处理,其方法为直接比较样本中各种特征数据,将处理,其方法为直接比较样本中各种特征数据,将特征相近归为一类,差异较大归为不一样类。特征相近归为一类,差异较大归为不一样类。第38页四四 生物芯片制作生物芯片制作基本方法基本方法 点样法和原位合成法点样法和原位合成法 原位合成法原位合成法 原位光刻合成原位光刻合成 压电打印法压电打印法第39页 点样法点样法 这一方法相对技术要求不高,是最这一方法相对技术要求不高,是最惯用方法。点样法是将预先合成好探针、惯用方
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