年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计样本.doc
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1、序言淀粉酶属于水解酶类,是水解淀粉和糖原酶类总称。通常经过淀粉酶催化水解织物上淀粉浆料,因为淀粉酶高效性及专一性,酶退浆退浆率高,退浆快,污染少,产品比酸法、碱法更柔软,且不损伤纤维。这类酶广泛存在于动、植物和微生物中,几乎全部动物、植物和微生物全部含有淀粉酶。 淀粉酶是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广泛类酶。尤其是20世纪60年代以来因为淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中大规模应用,它需要量和日俱增,到现在为止,其产量几乎占到整个酶制剂50以上,销售金额占到5560。根据水解淀粉方法不向,关键淀粉酶有淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。淀粉酶已经成为工业应用中
2、最为关键酶之一,而且大量微生物能够用以高效生产淀粉酶,不过酶大规模商业化生产仍然局限于多个特定真菌和细菌中。对于高效淀粉酶需求越来越多,这能够经过对现有酶化学改良或通白质工艺改良得到。得益于现代生物技术发展,淀粉酶在制药方面关键性日益凸显。当然,食品和淀粉工业仍然是关键市场,淀粉酶在这些领域需求仍然是最大。中性淀粉酶是现在使用最广泛一个酶,关键利用于发酵、食品、医药、纺织及造纸工业。就中国而言通常采取液态深层发酵法生产,但发酵水平低,过滤困难,使其发展受到了较大限制。本课题中以枯草杆菌为试验菌株,采取液体摇瓶发酵,并在培养基中添加发酵助剂如 Na和Tween80等来提升酶活。枯草芽孢杆菌可利用
3、蛋白质、多个糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。有菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶关键生产菌。枯草芽孢杆菌菌体本身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类,可在消化道中和动物体内消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败有机物中,易在枯草浸汁中繁殖。1. 菌种选育1.1 菌种选育及制备不管是在过去、现在和未来,微生物是多种生物活性产物丰富资源。在发酵前期,微生物选择至关关键,此课题设计是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性淀粉酶整体过程。选择性分离步骤通常是:含微生物材料采集标本材料预处理菌种分离富集培养菌种初选菌种复选性能判定菌种保藏。1.1.1 含微生物材料选择土壤是微生物聚集最丰富场所,菜园
4、和农田耕作层土壤含有丰富有机物常以细菌和放线菌居多,因为枯草芽孢杆菌生活在中性环境中,能够采集中性土壤。 采土时先用小铲除去表土,取515深处土样,选好35点,每点取土10g混在一起装入灭过菌牛皮纸袋,并统计时间、地点、植被等情况。1.1.2 预处理在培养过程中以淀粉作为唯一或关键碳源,控制pH在 6.77.2。那些在所采取条件下最适适用于淀粉代谢微生物最终将占优势,并可在淀粉琼脂糖平板上分离到产生中性淀粉酶菌株。1.1.3 所需菌种纯化和分离可用平板划线法进行菌种分离。方法以下:用接种管蘸取少许经增殖培养后菌液,在含无菌固体培养基平板表面上进行规则划线,操作时由右向左轻轻划线,划线时平板面和
5、接种环成3040,以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,线条要平行密集,使两线不能重合,充足利用表面积,划线时接种环不要嵌入板内划破培养基,密集含菌样品,经过多划线稀释,使菌体在平板培养基上逐步分离成单个菌株,经培养繁殖成单个菌落,反复进行几次平板划线分离,可得枯草芽孢杆菌野生菌株。1.1.4 菌株培养常见培养基配方:1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+1520g琼脂+5gNaCl。本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基,在37保温箱中培养,至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。1.1.5 菌落选择初筛采取透明圈法,方法为在培养基里接入淀粉天青,接入含菌样品后,可在菌落周围清楚地观察到淡蓝色晕环,
6、初筛选出微生物经过菌株性状试验后已确定含有一定生产能力菌株还要进行复筛。方法:将初筛后少数菌株接种于40 ml 锥形瓶内液体培养基中,110次/min 往复式摇床式震荡培养,得到摇瓶种子。1.2 诱变育种诱变育种能够利用物理、化学原因诱导遗传特征发生变异,再从变异群体中选择符合大家某种要求如高产个体,进而培育成新品种或种质。诱变育种操作程序以下:出发菌株纯化培养液细胞或孢子悬液诱变剂处理中间培养平板分离初筛复筛生产性能试验菌种保藏。1.2.1 出发菌株选择因为野生型菌株生产性能较差,通常采取经历过生产条件考验菌株,即经过液体培养摇瓶种子,这类菌株一定生产性状,对生产环境有很好适应性,正突变可能
7、性也很大。1.2.2 菌悬液制备细菌通常要求处于对数生长中期菌,用玻璃珠振荡5 min,使细胞均一分散,然后用灭菌脱脂棉过滤,得到分散菌株。菌悬液细胞浓度不宜过高,本课题中枯草芽胞杆菌,宜将其浓度控制在108个/ml。菌悬液介质通常见生理盐水。1.2.3 诱变剂处理诱变剂包含物理、化学、生物诱变,在微生物诱变育种中,可用物理化学复合诱变原因处理菌种,这么能够扩大培养幅度,提升诱变效果取得中性淀粉酶高产突变株。方法及步骤以下:吸收制备好枯草芽孢杆菌悬液5 ml于直径为6无菌培养皿中,然后用0.5%1%二乙酯处理30 min,处理时采取pH 7.0磷酸缓冲液,再将磁力搅拌器于紫外灯下(距离30 c
8、m)1 min,接着在红灯下吸收经处理菌液0.5 ml,稀释至10-6,取10-610-1稀释液滴一滴于6个平板中,10-610-1 依次涂布均匀,再置暗箱内和37培养48 h。注意:通常化学诱变剂全部有毒性,多数还含有致癌作用,故操作时切忌用口吸收并勿和皮肤直接接触,做好安全工作。1.2.4 突变菌株筛选包含:琼脂块透明圈法初筛。方法:倒入选择培养基6皿,取其中较厚2皿,用打孔器或玻璃打制圆形培养基平移琼脂块至一个选择平板上,再用接种针挑取单菌落少许菌体分别接种于琼脂块中心并和一琼脂块接入出发菌株作为对照正置于37培养45小时于培养好选择平板中滴加几滴淀粉天青,观察到透明圈直径选择透明圈大菌
9、落接入斜面备复筛用。摇瓶发酵复筛:将经初筛处菌株分别接入增殖培养基中,培养13小时分别接种于锥形瓶发酵培养基中置37摇床上发酵40小时选出酶活力较高者深入复筛直至选出中性淀粉酶高产突变株。1.3 菌种保藏 菌种是从事微生物学和生命科学研究基础材料,尤其是利用微生物进行相关生产,如氨基酸、抗生素、酿造等工业,更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作关键组成部分。其任务是使菌种不死亡,同时还要尽可能设法把菌种优良特征保持下来而不致向坏方面转化。菌种保藏关键是依据菌种生理生化特点,人工发明条件,使孢子或菌体生长代谢活动尽可能降低,以降低其变异。通常可经过保持培养基营养成份在最低水
10、平、缺氧状态、干燥和低温,使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力。常见菌种宝藏方法有:斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。在这里我们采取沙土保藏法。方法:将需保藏菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液,加入经灭菌处理沙和土混合物(或纯沙亦可)作为载体,减压抽去水分,这些吸附有孢子干燥沙土载体,在低温下保留。操作步骤:斜面孢子先加灭菌蒸馏水22.5ml,沿斜面轻刮孢子后,再吸0.20.3 ml到灭菌备用沙土管中,在真空度100 Pa以下进行干燥,直至沙土管外貌呈松散状态,然后低温(4)保留。经真空干燥后沙土管,最好放在密闭容器内,容器内可放
11、入吸潮剂CaCl2 或硅胶等,保藏期间整个容器置于冰箱内。通常保留期为十二个月左右。 2. 培养基配制2.1 培养基类型培养基种类很多,能够依据组成、状态和用途等进行分类,根据用途能够分成孢子培养基,种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计关键用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。2.1.1 孢子培养基 孢子培养基配制目标是供菌体繁殖孢子,常采取是固体培养基,对这类培养基要求是能使菌体生长快速,产生数量多而优质孢子,而且不会引发菌体变异。对孢子培养基要求:营养不要太丰富;所用无机盐浓度要适量;注意培养基pH和湿度。中性淀粉酶孢子培养基配置以下:将麸皮5、豆饼粉3、蛋白胨0.25%、琼脂2%
12、(pH 7.1)制成斜面培养基,在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。2.1.2 种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体,并使菌丝体长得粗壮成为活力强种子。对于种子培养基营养要求比较丰富和完全,氮源和维生素含量也比较高些,浓度以稀薄为好,能够达成较高溶解氧,供大量菌体生长和繁殖。中性淀粉酶种子培养基配置:将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.17.2),在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。2.1.3 发酵培养基 发酵培养基要求是营养要合适丰富和完全适合于菌种生理特征和要求,使菌种快速生长、健壮,能在比较短周期内充足发挥产生菌合成发酵产
13、物能力,但要注意成本和能耗。中性淀粉酶发酵培养基配方是:麸皮70、小米糠20、木薯粉10%、烧碱0.5%,加水使水量达60,常压蒸汽灭菌1h。2.2 培养基营养要求培养基成份大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。对不一样微生物,微生物不一样生长阶段,不一样发酵产物和不一样发酵工艺条件等,所使用培养基全部是不一样,这些也全部是培养基配制需要考虑原因。2.2.1 水 水是全部培养基关键成份,也是微生物机体关键组成成份。水是良好溶剂,又是活细胞中一切代谢反应媒介物,还能够维持细胞中渗透压,同时水又是热良好导体,有利于散热,可调整细胞温度。在中性淀粉酶发酵生产中
14、,为了避免水质改变给生产带来不良影响,发酵用水采取深井水,并定时检验水质,要求:pH 6.87.2,电导率5001500/cm,总硬度 100230 mmol/L。 2.2.2 碳源 碳源关键为微生物细胞生长繁殖提供能源。现在生产中性淀粉酶菌种为异养型微生物,所以只能利用有机碳;大量农副产品是关键有机碳源,如山芋、麸皮、玉米、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料,这里用到碳源是麸皮、马铃薯、木薯。2.2.3 氮源氮源是组成蛋白质和核酸关键元素,酶本身即为蛋白质。所以,氮源是必不可少关键原料。常见有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我们用到氮源是豆饼粉剂
15、和蛋白胨。常见无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。2.2.4 无机盐类及微量元素酶在生长和繁殖生长过程中,需要一些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。钠离子含有控制细胞和培养基之间渗透压作用,从而促进产酶,添加适量亚硝酸钠可提升酶活力;钙对淀粉酶有稳定和活化作用。中性淀粉酶生产中通常以氯化钙提供钙离子。2.2.5 生长因子和产酶促进剂酶生产中所需生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等,全部含有丰富生长因子。产酶促进剂通常是该酶底物和底物类似物,对于中性淀粉酶,可添加适量浓度淀粉琼脂糖作为诱导剂。2.3 培养基灭菌生物化学反应过程中,尤其是细胞培养过程,往往要求在没
16、有杂菌污染情况下进行,这是因为生物反应系统中通常含有比较丰富营养物质,所以很轻易受到杂菌污染,进而产生多种不良后果:(1)因为杂菌污染,使生物化学反应基质或产物消耗,造成产率下降;(2)因为杂菌所产生一些代谢产物,或染菌后发酵液一些理化性质改变,使产物提取变得困难,造成收得率降低或使产品质量下降;(3)污染杂菌可能会分解产物而使生产失败;(4)污染杂菌大量繁殖,会改变反应介质pH,从而使生物化学反应发生异常改变;(5)发生噬菌体污染,微生物细胞被破裂而使生产失败等。2.3.1 灭菌方法所谓灭菌,就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质过程。常见灭菌方法有:化学灭菌、射线灭菌、
17、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。本试验采取湿热灭菌。2.3.2 培养基湿热灭菌条件为在121(表压约0.1MPa)维持30分钟。湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌,是工业中最关键灭菌方法。在一样温度下,温热杀菌效果比干热好,其原因有:蛋白质凝固所需温度和其含水量相关,含水量愈大,发生凝固所需温度愈低。湿热灭菌中菌体蛋白质吸收水分,较同一温度干热空气中易于凝固而杀灭多种微生物。温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热,加速提升温度。所以湿热灭菌比干热所要温度低。如在同一温度下,则湿热灭菌所需时间比干热短。湿热穿透力比干热大,使深部也能达成灭菌温度,故湿热比干热收效好。 一影响灭菌效果原因微生物种类和数量;培
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