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年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计样本.docx
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1、年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计摘要肝素酶指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键酶,被用于清除血液中肝素,测定肝素结构,和抗肿瘤等医学方面研究。国外对肝素酶研究已经有40多年历史,涵盖菌种筛选、发酵产酶、分离纯化、克隆表示等领域。中国起步很晚,现在仅见中科院(北京)微生物研究所和四川大学有相关肝素酶研究报道。现在世界上研究最多、最深入肝素酶仍然由肝素黄杆菌发酵生产而来。本文经过肝素酶发酵工艺研究,包含灭菌工艺研究、提取工艺研究、浓缩和干燥工艺研究及成型工艺研究,将其研制成工艺切实可行、质量稳定可控酶制剂。并对肝素酶制剂车间生产工艺进行研究,对工艺步骤、物料衡算、热量衡算、车间部署、管道部
2、署、三废处理、设备造型等关键工艺进行设计,为肝素酶车间工艺设计提供依据。关键词:肝素酶;车间部署;工艺步骤图AbstractIn these pieces is in under the guidance of TCM theory, combined with clinical doctors the application and selected clinical experience for many years, has qingrejiedu, spleen and stomach, invigorate the circulation of bulge, clinically u
3、sed for chronic gastritis, gastric ulcer, accompanied by intestinal metaplasia atypical symptoms.His own by these, spreading hedyotis herb, rhizoma coptidis, etc of ten herbs, of which one of these for his own gentleman medicine, therefore, in these extraction technology on the basis of the experime
4、ntal research, the application form of his own from the traditional one, developed into taking convenient oral solid preparation, change one carry inconvenience, shortcomings and so on perishable.In this article, through these pieces of research of preparation process, including crushing and sterili
5、zation technology research, the extraction process of study, concentration and drying process and molding process research, to develop it into practical technology, stable quality control of traditional Chinese medicine compound preparations.And in these pieces tablet workshop production process, th
6、e process flow, material balance, heat balance, workshop layout, piping layout, three wastes treatment, equipment design on the key technology such as modelling, provide the basis for these pieces workshop process design.Key words:Heparinase.Plant layout;Process flow diagram目录摘要1Abstract21 绪论51.1 概述
7、51.1.1 肝素酶介绍51.1.2 肝素酶分类及结构51.1.3 肝素酶稳定性71.2课题研究目标意义81.3课题研究内容、设计方法91.4 设计依据及标准92 工艺步骤概述102.1文件报道合成工艺简述102.2 各步生产步骤112.4 工艺步骤框图122.5 工艺条件及生产安排153 物料衡算163.1衡算基准和设计基础数据163.2年产110吨肝素酶发酵车间物料衡算164 热量衡算164.1 热量衡算意义164.2 对于每一个单元操作进行能量衡算175 设备选型185.1 发酵罐185.2 电热蒸发发生器205.3 种子罐设计和选型206管道选型设计206.1 概述206.2 管道设计
8、标准216.3 车间管道设计要求217车间部署217.1 车间设计基础标准217.1.1 车间部署设计目标和关键性227.1.2 车间部署相关技术要求和参数227.1.3 设备安全距离237.1.4 设备部署标准237.2 车间平面部署247.2.1 车间部署平面图247.2.2 车间产尘处理247.2.3 车间排热、排湿及臭味处理257.2.4 参观走廊设置257.2.5 安全门设置257.3 设备安装268“三废”处理及其回收利用268.1 废气处理268.2 废液处理268.3 废料销毁279 结论及提议279.1 结论279.2 提议27参考文件29附录一30附录二31附录三32致谢3
9、51 绪论1.1 概述1.1.1 肝素酶介绍 肝素酶是一类能降解肝素类物质裂解酶。在真核生物中,肝素酶经过水解硫酸乙酸肝素蛋白聚糖(HSPGs)肝素类侧链破坏细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)基础结构,释放并激活连接在肝素类侧链上活性物质,和血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程亲密相关w。原核生物肝素酶现在关键起源于肝素黄杆菌(Fla vobacterium heparinum),在制备低分子肝素(LMWHs)、消除体外循环中肝素抗凝剂、确定肝素正确结构等方面有着关键用途。不过,肝素酶稳定性差、不易提纯,所以价格昂贵,限制了其在医药工业领域广泛应用。所以,研究和了解肝素酶结构、性质和生物学特征
10、,对优化肝素酶工业生产,拓宽肝素酶应用领域有着关键意义。1.1.2 肝素酶分类及结构(1)分类肝素酶最初是从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中被发觉和分离。肝素黄杆菌为一类来自土壤革兰阴性菌,现在已经从中分离纯化得到3种肝素酶:肝素酶I (Heparinase I EC4. 2. 2. 7) ,肝素酶II (Heparinase II,无酶编号)和肝素酶III (Heparinase III. EC4. 2. 2. 8) 0 3种肝素酶关键区分在于相对分子质量(、电荷性质及底物特异性不一样。肝素酶I,hfr 43. 8 kD,等电点9. 3,能够特异性切割肝素类分
11、子中6SG1cNS (1-4) 2SIdoA之间连接键;肝素酶III M73 kD,等电点约为10,能够特异性切割硫酸乙酞肝素类分子中G1cNS/G1cNAc (1-4) G1cA之间连接键。肝素酶II是3种肝素酶中分子量最大(84. 5 kD )和底物选择性最宽一个,等电点约为8. 9,对肝素类和硫酸乙酞肝素类连接位点全部有切割作用。(2)序列经过DNA序列分析表明,3种肝素酶是完全不一样基因产物。肝素酶I, II和III基因分别含有1 152 bp 2 316 by和1 977 by开放读码框架,编码含有384, 772和659个氨基酸序列蛋白前体,前体表示后在氨基肤酶作用下发生Edman
12、降解,从A1a21-G1n22, Ser25-G1n26和A1a24-G1n25处分别切去21, 25和24个氨基端前导肤序列,形成成熟肝素酶I、II和III。(3)糖基化1. 2. 2糖基化原核生物本身蛋白发生糖基化现象是比较少见,但由肝素黄杆菌分离得到5种多糖裂解酶(另外两种是软骨素酶AC和软骨素酶B)中只有肝素酶III不存在糖基化位点。肝素酶I糖基化位点在Ser39,连接一个分子量约1. 1kDa糖链hl,序列为Gal- S (1-4) Gal- a(1-3) (2-0-Me) Fuc- (1-4) Xyl- S (1-4) G1cUA- a (1-2) Rha- a (1-4) Man
13、- a (1-0) Ser,肝素酶II糖基化发生在Thr134,连接一个序列为Man-(Rha)-G1cUA-Xyl四糖。(3)催化区域酶和底物作用机制和酶结构尤其是高级结构亲密相关,现在相关3种肝素酶二级和高级结构还不清楚。Sasisekharan试验室对其活性中心及底物结合位点作了大量研究,并对其催化区域进行了考察,找到了部分维持酶催化活性所必需氨基酸。肝素酶I中处于高度阳电荷环境中Cy:;135为其活性位点,周围含有两个阳电荷簇(Phe197Asp204和G1u207Asp212)含有Cardin-Weintraub肝素结合共有序列,阳电荷簇中His203对于肝素酶I催化活性起到关键作用
14、,而Lys199可能经过稳定底物肝素糖醛酸C-6位阴离子而直接参与催化反应,同时能够稳定Cys135疏基而起到协同催化作用.,所以能够推测Cys135, His203和Lys199共同组成了肝素酶I催化区域,而阳电荷残基Lys198和Lys132对维持催化必需微环境起到了关键作用。另有研究表明,肝素酶I活性中心需要一个强还l系环境,所以加入抗氧化剂(如DTT)有利于提升肝素酶I活性。肝素酶II中Tyr257,His238,His451和Ilis579残基对酶催化活性至关关键,但具体催化机制有待于深入说明l。在肝素酶III中,His295和His510是维持活性必需氨基酸。(4)钙结合位点在肝素
15、酶I和III中,钙离子对维持酶活性起到了关键作用.肝素酶I中存在两个钙结合基序CB-1和CB-2 (Glu 207Val 219; Val 373Ala 384),定向突变显示CB-1, CB-2经过不一样作用机制在维持肝素酶I活性方面全部发挥了关键作用。CB-1关键经过影响酶和钙结合而影响酶活性,相对于影响钙结合CB-2更多地经过其它复杂机制影响酶活性。在肝素酶III中也一样存在两个钙结合基序(Leu390G1y405; Arg576Asn591),钙离子可能是经过和底物特异性区域结合而改变其构象使其更适合和酶结合,或钙、底物和酶结合成一个三元络合物而发挥作用.但在肝素酶II中不存在任何钙结
16、合共有序列,所以钙离子对肝素酶n来说不仅不能激活反而抑制酶活性。(5)蛋白结构依据3种肝素酶序列,肝素酶I被列入多糖裂解酶家族PL13,肝素酶m被列入PL12,而肝素酶II因为其独特基础序列还缺乏有效结构数据将其分类.Shaya等L47经过分析肝素酶II晶体结构证实,肝素酶II蛋白有三个区域组成:茫末端区(Gln 26Arg356; 14个。螺旋),中央区(Asp357Asn676; 16个p折叠)和C-末端区(Thr677Arg772; 9个p折叠),类似于PL8家族软骨素裂解酶AC和透明质酸裂解酶,不一样是肝素酶II以稳定非对称同二聚体形式存在,两个活性位点各自分居在两个单体上,其中央区存
17、在一个Zn2+离子,对维持两个位点结构稳定起关键作用.现在相关肝素酶I和III立体结构还未见文件报道。1.1.3 肝素酶稳定性肝素酶稳定性较差,这一缺点是造成现在尚没有好措施来取得活性和产量均很好肝素酶关键原因。肝素酶I以液体形式存放在4 C环境下,在很短时间内活性即降低为原来50%,而经过一次冻融、一次冻干其活性只能保持为原来45%和25%ZJ.通常情况下,得到纯化肝素酶需要45步操作,而在这个过程中用现在制备方法酶活性损失巨大,产率极难超出10%o Ma等经过在发酵中添加氯化钙方法将活性酶产率提升到17. 8 %,而且发觉氛化钙能够作为肝素酶I稳定剂,在4 C环境下向酶液中添加1 mmol
18、L-氯化钙2天后活性保持了80%,5天后仍能保持到55%;伴随氛化钙加入量增大酶稳定性深入提升,加入100 mmo 1 L 氯化钙2天内未见酶活性降低.但在冻融条件下,需要较高浓度才能达成稳定效果.钞亚鹏等尝试了用固定化方法来增加肝素酶稳定性,试验表明将肝素酶固定于聚酷载体上,基础上保持了游离酶理化性质和催化特征,酶使用半衰期延长了4. 4倍.有报道指出向肝素酶中添加牛血清蛋白(BSA)和乳糖也能够增加酶稳定性。1.1.4 肝素酶应用(1)生产低分子肝素低分子肝素是从一般肝素中分离得到低分子量组分,或裂解肝素产生片段,是新一代肝素类抗血栓药品,较肝素来说其含有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾
19、向小、口服易吸收等特点。现在工业生.产低分子肝素方法关键是化学降解和酶降解法,即使化学降解法工艺步骤较简单,但裂解过程中加入.强氧化剂等会和肝素中硫酸基团作用而引发肝素抗凝活性降低,也破坏肝素结构,而肝素酶降解法因为其温和反应条件、不引发肝素结构破坏、无毒性、易实现生产连续化而越来越得到大家关注。(2)体外循环中消除肝素体外循环是诊疗很多心脏疾病外科技术手段,为了预防插入心脏或血管人工管道引发血凝和形成血栓造成器官栓塞,常常在手术中用肝素调整血液凝固功效。体外循环结束后,需要用鱼精蛋白来中和加入肝素,但鱼精蛋白引发毒性反应包含低血压、过敏反应、肺水肿、血小板凝集等日益引发医学工作者重视,而肝素
20、酶I能够在10 min内中和肝素,所以能够考虑用肝素酶I替换鱼精蛋白作为肝素中和剂。但Stafford-Smith等研究表明,肝素酶I逆转冠脉搭桥术后肝素抗凝作用并不优于鱼精蛋白,相关应用需要深入深入研究。(3)研究肝素正确结构和低聚寡糖活性筛选肝素结构很复杂,现在对其具体结构研究仍不透彻。经过控制不一样肝素酶解条件,将肝素降解成大小不等寡糖片断,经过分析寡糖片段,深入揭示肝素正确结构。同时能够研究不一样大小塞糖构效关系,深入筛选含有生物活性化合物。(4)药用研究因为肝素酶多糖裂解特征,其在医药研发领域也有着关键意义。Daud等研究指出,肝素酶I能够有效地将戊多糖分解成双糖和三糖片断,所以能够
21、作为戊多糖过剂量时中和剂来使用。肝素酶III能够从细胞表面及细胞外基质中选择性切割硫酸乙酞蛋白聚糖HSPGs HSPGs作为P-和L-选择素和促炎症介质如IL-8结合位点,从而肝素酶III能够可逆性地消除这些结合位点和炎症介质,经过降低白细胞波动、猫附、外渗来减轻局部缺血再灌注中对组织损伤。1.2课题研究目标意义酶制剂是一个生态型高效催化剂,含有高效、安全、节能、生态和环境保护等特点,能够有效带动相关领域技术水平提升,对应用产业开发新产品,提升质量、节能降耗、保护环境含相关键意义,产生了巨大社会效益和经济效益。酶制剂产业已经成为生物技术领域前卫产业和二十一世纪最有期望新兴产业之一。国家十一五期
22、间已将酶制剂列为关键发展领域,将投资几十亿到该产业,建立生产、研发、出口、检测、菌种保藏基地,使中国成为世界酶制剂生产基地和研发基地,引领世界酶制剂市场。而酶制剂中肝素酶关键应用领域为酒精、白酒、淀粉糖、味精等行业,现在中国酒精年生产能力为897万吨,年需万单位肝素酶24吨,白酒企业年需肝素酶0吨,淀粉糖和味精企业需求25000吨左右,而中国现有企业肝素酶产量才207000吨,远远不能满足市场需求。不过酒精企业扩建,造成粮食短期供给担心,酒精企业有297万吨产量未能达产,少消耗肝素酶80000吨,所以缓解了市场供求矛盾。伴随世界能源日趋担心,世界各国全部在大力发展可再生能源,所以,以后肝素酶生
23、产将会有很大空间。本设计利用肝素黄杆菌,采取机械搅拌通风罐进行发酵生产,完成年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计,经过工艺步骤设计、工艺衡算、设备选型和车间部署设计,设计出年产5000吨肝素酶发酵车间,并依据生物工程工厂车间部署标准,对发酵罐车间进行合理部署,绘制了工艺步骤图和车间部署图,工艺设计结果为肝素酶生产提供一定参考。1.3课题研究内容、设计方法本设计任务为年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计,依据在药企生产实习经验,查阅中国药典和相关文件资料,同时参考医药工业洁净厂房设计规范、药品注册管理措施、GMP、化工工艺设计手册等多个设计规范,结合所学相关课程知识,以肝素酶发酵生产工艺步骤为根本,
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