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HdeA在细菌外膜囊泡环境下的原位NMR研究.pdf
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1、 Chinese J Magn Reson,2024,41(1):1-8 第 41 卷第 1 期 2024 年 03 月 Vol.41 No.1 Mar.2024 波波 谱谱 学学 杂杂 志志 Chinese Journal of Magnetic Resonance doi:10.11938/cjmr20233069 HdeA 在细菌外膜囊泡环境下的原位 NMR 研究 王欢1,陶志清2,3,姜国胜1,张许3,王冠3#,禾立春2,3,刘买利3 1.潍坊医学院,山东 潍坊 261053:2.中国科学院大学,北京 100049;3.波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院精密测
2、量科学与技术创新研究院,湖北 武汉 430071 摘 要:HdeA 是一种定位于细菌周质的分子伴侣,在维持蛋白质稳态中起着重要的作用以往对 HdeA 的研究主要是在体外条件下进行,限制了人们对 HdeA 在天然环境下发挥作用机制的理解 细菌外膜囊泡是细菌自发分泌到胞外环境的外膜囊泡,其内容物与周质环境相似本研究将 HdeA 富集到细菌外膜囊泡(OMVs)中,通过核磁共振波谱研究 HdeA 在 OMVs 中的构象变化 结果表明,HdeA 在其原位环境中表现出酸依赖性的构象变化 在低 pH条件下 HdeA 主要通过 S15、W16、T17、S27、T32、E36、G54、T57、C66、Q71、F
3、74 及 D83 等残基启动其分子伴侣功能此外本研究也为原位研究其它周质分子伴侣的功能提供了新方法 关键词:原位核磁共振波谱;HdeA;外膜囊泡;分子伴侣 中图分类号:O482.53 文献标识码:A In situ Investigation of HdeA in Bacterial Outer Membrane Vesicles Using NMR Spectroscopy WANG Huan1,TAO Zhiqing2,3,JIANG Guosheng1,ZHANG Xu3,WANG Guan3#,HE Lichun2,3*,LIU Maili3 1.Weifang Medical Uni
4、versity,Weifang 261053,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular Physics,Wuhan Center for Magnetic Resonance(Innovation Academy for Precision Measurement Science and Technology,Chinese Academy of Scien
5、ces),Wuhan 430071,China Abstract:HdeA,a molecular chaperone localized in the bacterial periplasm,plays a vital role in maintaining protein homeostasis.Previous studies of HdeA were mainly carried out in in vitro conditions,limiting our understanding of the mechanism of HdeA in its native environment
6、.Outer membrane vesicles of bacteria are extracellular vesicles released by cells into the extracellular milieu in a controlled manner,with contents almost identical to the periplasmic environment.Thus,by enriching HdeA into the bacterial outer membrane vesicles(OMVs),we investigated the conformatio
7、nal changes of HdeA within OMVs via nuclear magnetic resonance(NMR)spectroscopy.The results reveal that HdeA exhibits an acid-dependent conformational change in its native environment.The high-resolution spectrum of HdeA in OMVs indicates that under low pH conditions the function of HdeA is activate
8、d through residues S15,W16,T17,S27,T32,E36,G54,T57,C66,Q71,F74 and D83.Moreover,the NMR measurement of HdeA within OMVs provides a promising way for in situ investigation of mechanisms of other periplasmic molecular chaperones via NMR spectroscopy.Keywords:in situ NMR,HdeA,outer membrane vesicles,ch
9、aperone 收稿日期收稿日期:2023-05-16;在线在线发表发表日期日期:2023-06-30 基金项目基金项目:国家自然科学基金资助项目(22174151,21904138,21991080,22078280);国家重点基础研究发展计划(973 计划)资助项目(2018YFE0202301,2018YFE0202300).:共同第一作者.通信通信作者作者(Corresponding author):*Tel:86-18602761433,E-mail:;#Tel:86-13545913475,E-mail:.2 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 引 言 细菌周质是指革兰氏阴性菌中处于
10、内膜与外膜之间的狭窄空间,其内部包含了许多周质蛋白、核酸、脂类以及代谢物1 HdeA 是一种定位在细菌周质的分子伴侣,对维持细菌周质中蛋白质稳态发挥着重要功能2,当肠道细菌通过宿主的胃时,其周质环境处于酸性,导致周质蛋白变性引发聚集此时周质分子伴侣 HdeA 迅速从同源二聚体解离成单体,激活其分子伴侣活性,与天然客户蛋白包括外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)以及其它伴侣蛋白 SurA 和 Degp 等3,4相互作用单体结构部分展开并暴露出疏水表面,通过与底物蛋白结合阻止其酸诱导的聚集当细菌移动到小肠时,此时处于中性环境,HdeA 又释放其客户蛋白,并重新折叠成
11、同源二聚体形式,此时不具备分子伴侣活性其构象变化的示意图如图 1所示了解 HdeA 如何进行酸激活伴侣活性,有助于更好地理解各类消化道细菌的生理功能 图 1 HdeA 随 pH 值的改变而发生构象变化的示意图6 Fig.1 Schematic representation of the conformational change of HdeA as a function of pH6 周质分子伴侣对细菌而言具有非常重要的生理功能,并且其在发挥功能的同时通常涉及结构或者构象的动态变化核磁共振(NMR)技术能够提供蛋白质在不同时间尺度的动态信息,并且能够在原子分辨率水平直接研究蛋白质在原位环境下
12、的结构和动态,是研究蛋白质结构以及构象变化的理想工具5目前,针对周质分子伴侣构象变化的研究一般在体外稀溶液中进行6-8,脱离了其真实的生理环境,难以解释原位环境对其构象变化以及其伴侣功能的影响然而,受限于细菌有限的寿命以及较低的周质体积占比,基于活细胞的周质蛋白原位研究通常难以开展因此,需要发展一种用于研究周质蛋白的近似于细菌周质环境的原位 NMR 研究方法 细菌外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是革兰氏阴性菌自发分泌的天然球型囊泡,其内部充满了周质可溶物,具有与细菌周质极为相似的天然环境,是作为研究周质蛋白和外膜蛋白的理想原位环境9,10相比较于活细胞体系,
13、它的无生命特性能够支持长时间采样的 NMR 研究,同时其较强的耐酸碱性提供了比较广泛的 pH 研究范围在本研究中,通过在 HdeA 的 N 端融合分泌信号肽,将大量的 HdeA 过表达在细菌周质中,当 HdeA 被随机包裹于 OMVs 中后,分泌至培养基中,经过高速离心法获取富含 HdeA的 OMVs 样品利用液体 NMR 技术进一步表征了稀溶液体系和 OMVs 体系中 pH 对 HdeA 的结构和构象变化的影响 第 1 期 3 王欢等:HdeA 在细菌外膜囊泡环境下的原位 NMR 研究 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 1.1.1 菌株菌株 实验采用的菌株为 BL21(DE3)大肠杆菌(E.
14、coli)1.1.2 药品与试剂药品与试剂 磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钙(CaCl2)、硫酸钾(K2SO4)、甘油(Glycerol)、柠檬酸钠(Sodium citrate)等分析级化学品购自国药试剂蛋白胨(Tryptone)、酵母粉(Yeast extract)购自 Oxiod苯甲基磺酰氟(PMSF)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自碧云天生物FastHifi Super DNA 聚合酶预混液购自 Affinibody Life Science AG 1.1.3 仪器仪器 实验仪器
15、包括:600 MHz 核磁共振波谱仪(Bruker,AVANCE III 600MHz,德国),蛋白纯化仪(GE HealthCare,AKTA prime plus,美国)1.2 样品制备 1.2.1 HdeA-OMVs 样品的制备样品的制备 HdeA-OMVs 样品的制备方法参考已发表的文献9,用 M9 培养基对 HdeA 进行同位素标记,由于在HdeA 的 N 端融合了分泌信号肽,在诱导 HdeA 表达的过程中,HdeA 被随机的包裹在 OMVs 中并分泌到培养基中具体步骤如下:(1)将诱导完成的 1 L 菌液经过离心(6 000g,30 min,4)得到培养基上清(2)将大约 1 L
16、上清经过 100 kDa 的膜包浓缩至 20 mL(3)将所得浓缩液经过 0.45 m 的滤膜过滤之后,再进行离心(40 000g,3 h,4),弃去上清(4)加入 1.5 mL 磷酸缓冲液(20 mmol/L PB,150 mmol/L NaCl,pH 6.5)进行重悬,经过离心(1 000g,1 min,4),小心的吸取乳浊液,弃去不溶性沉淀,重复数次(5)将乳浊液进行离心(20 000g,1 h,4),沉淀即为 OMVs,最后再用 PBS 缓冲液进行重悬,得到 HdeA-OMVs 样品 1.2.2 HdeA 的分离和纯化的分离和纯化 HdeA 的分离和纯化步骤:(1)将诱导完成的菌液经过
17、离心(6 000g,30 min,4)得到培养基上清.(2)将 1 L 上清经过 100 kDa 的膜包浓缩至 20 mL(3)将浓缩后的样品经过 3.5 kDa 透析膜的在 Buffer A(10 mmol/L PB,pH 6.5)中透析两次,每次透析 4 h(4)然后将样品经过强阴离子交换柱(HiTrap Q FF)进行初步纯化,用 Buffer B(20 mmol/L PB,500 mmol/L NaCl,pH 6.5)进行梯度洗脱(5)最后经过尺寸排阻色谱(SEC)分离纯化,将蛋白以合适浓度保存在 Buffer C 中(20 mmol/L PB,150 mmol/L NaCl,pH 6
18、.5)1.2.3 NMR 样品的制备样品的制备 本研究中涉及的相同 pH 条件下的 HdeA 稀溶液样品(100 mol/L HdeA)与 HdeA-OMVs 样品在同一种缓冲液(20 mmol/L 柠檬酸钠,150 mmol/L NaCl,pH 6.5 或 pH 2.5)中透析过夜,以保证 HdeA 稀溶液4 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 样品和 HdeA-OMVs 样品保持相同 pH 值OMVs 是由细菌的外膜所形成的囊泡,其表面存在许多跨膜孔蛋白,允许 600 Da 以下的水溶性小分子和离子以扩散的形式自由进出,通过透析的方式可以达到调节 OMVs内腔 pH 的目的11-13pH 3
19、.5、pH 4.5 及 pH 5.5 的稀溶液样品分别通过在对应 pH 的缓冲液(20 mmol/L 柠檬酸钠,150 mmol/L NaCl)中透析过夜获得相关实验操作参考已发表的文献9,14 1.3 磁共振波谱采集与数据处理 15N,1H-HSQC 实验在配备了三共振低温探头的 Bruker 600 MHz 核磁共振谱仪上采集,实验温度设置为 298 K,所有实验均采用标准脉冲程序1H 和15N 的工作频率分别为 600.17 MHz 和 60.82 MHz,在1H 和15N 维的谱宽分别为 9 615.38 Hz 和 2 189.30 Hz,谱中心分别为 2 809.70 Hz 和 7
20、175.66 Hz,采样数据点阵 t2t1=2 04896,弛豫等待时间 d1=1.5 s,累加次数为 8,对于 HdeA-OMVs 样品,累加次数为 64实验数据通过 Bruker Topspin 4.0.1 软件以及 CcpNmr 软件15进行处理 2 结果与讨论 2.1 HdeA 蛋白在 OMVs 中的富集 在先前的研究中,对 OMVs 蛋白定量分析表明,E.coli 可以将大约 0.2%0.5%的外膜和周质蛋白包裹到OMVs 中16-18这些蛋白质包括毒素、黏附素、毒力因子、蛋白酶、糖蛋白等,在营养获取、生物膜的形成、压力响应、对宿主的入侵和免疫调节等过程中发挥重要的作用19,20尽管
21、现在对 OMVs 包裹周质蛋白的选择机制尚不清楚,但是采用过表达的方式富集目的蛋白到 OMVs 中是一种理想的策略我们通过浓缩和超速离心结合的方式,大量制备 HdeA-OMVs 样品如图 2(a)所示,HdeA-OMVs 样品在 SDS-PAGE 电泳胶图上清晰可见 HdeA 条带,表明 HdeA 经过诱导表达后,被大量富集在 OMVs 腔内另外,电泳胶图上还存在除HdeA 之外的高浓度蛋白条带,通过胶条质谱鉴定以及结合参考文献报道10,这些条带被鉴定为膜蛋白此外培养液上清中也分泌了大量的 HdeA,对此部分蛋白进行纯化,获得了稀溶液中测量的 HdeA 蛋白样品,用于后续实验图 2(b)表示
22、HdeA 在经过 SEC 纯化后得到的色谱图以及 SDS-PAGE 电泳胶图 图 2 (a)HdeA-OMVs 样品在 SDS-PAGE 电泳胶图,箭头标注条带(10 kDa)为 HdeA,其余条带为 OMVs 中的周质蛋白或外膜蛋白;(b)培养基上清中的 HdeA 蛋白经过 SEC 分离后的液相色谱图,在图中约 68 mL 的位置为 HdeA 的二体峰 Fig.2 (a)SDS-PAGE gel plot of HdeA-OMVs samples,the arrow marked band(10 kDa)is HdeA,and the remaining bands are pericyto
23、plasmic proteins or outer membrane proteins in OMVs;(b)Liquid chromatogram of the HdeA from medium supernatant separated after size exclusion chromatography,in which the peak of the dimer HdeA is located at about 68 mL(a)(b)Volume/mLA280/mAU00255075100125150200400600第 1 期 5 王欢等:HdeA 在细菌外膜囊泡环境下的原位 NM
24、R 研究 2.2 HdeA 的15N,1H-HSQC 谱图 目前,蛋白质的体外研究一般在稀溶液中进行然而,细胞环境是大多数蛋白质发挥功能的天然环境在细胞环境中,大分子拥挤、限域、弱相互作用等普遍存在,已经有越来越多的研究表明这种复杂细胞环境会影响蛋白质的结构、动态以及功能21,22本节以 OMVs 模拟 HdeA 的原位周质环境,对比不同 pH条件下 HdeA 的残基化学位移变化,研究 HdeA 在稀溶液和 OMVs 中的构象变化谱图差异,其中 HdeA 15N,1H-HSQC 谱图的归属来源于参考文献4 2.2.1 HdeA 在稀溶液条件下的在稀溶液条件下的15N,1H-HSQC 谱图谱图
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