矢车菊不同颜色花瓣酵母cDNA文库的构建.pdf
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1、DOI:10.12171/j.10001522.20230126矢车菊不同颜色花瓣酵母 cDNA 文库的构建邓成燕1王佳颖2戴思兰2(1.临沂大学农林科学学院,山东临沂276000;2.北京林业大学园林学院,北京100083)摘要:【目的】矢车菊花瓣的蓝色呈色和品种间花色变异的分子调控机制尚不明晰。本研究采用 Gateway 技术构建了矢车菊 6 个不同花色品种花瓣的酵母 cDNA 文库,以期进一步通过酵母单杂交或双杂交技术筛选参与调控花瓣呈色的关键互作蛋白。【方法】本研究以白色、粉色、红色、蓝色、紫色和墨色矢车菊花瓣为材料,提取总 RNA 后分离和纯化 mRNA,合成双链 cDNA 后依次进
2、行 BP 重组反应和 LR 重组反应,分别获得初级和次级文库。最后将次级文库质粒转化酵母Y187,获得矢车菊不同颜色花瓣的酵母 cDNA 文库。【结果】质量鉴定结果显示:初级文库的库容量为 1.3107CFU,重组率为 100%,且插入片段长度均在 1000bp 以上;次级文库的库容量为 1.6107CFU,重组率为 100%,且插入片段长度均在 1000bp 以上。酵母文库的滴度为 3.5107CFU/mL,随机挑选的 24 个单克隆经 PCR 检测后均扩增出明亮条带,重组率为 100%,插入片段长度均大于 1000bp。【结论】本研究构建的矢车菊不同颜色花瓣酵母 cDNA 文库的质量较高,
3、能满足酵母文库筛选的试验要求,为后续探究矢车菊花瓣的蓝色呈色和品种间花色变异的分子调控机制提供了材料基础。关键词:矢车菊;花色;酵母;cDNA 文库;Gateway 技术中图分类号:S681.9文献标志码:A文章编号:10001522(2024)03011508引文格式:邓成燕,王佳颖,戴思兰.矢车菊不同颜色花瓣酵母 cDNA 文库的构建 J.北京林业大学学报,2024,46(3):115122.DengChengyan,WangJiaying,DaiSilan.ConstructionofayeastcDNAlibraryusingCentaurea cyanuspetalsofdiffer
4、entcolorsJ.JournalofBeijingForestryUniversity,2024,46(3):115122.Construction of a yeast cDNA library using Centaurea cyanuspetals of different colorsDengChengyan1WangJiaying2DaiSilan2(1.CollegeofAgricultureandForestryScience,LinyiUniversity,Linyi276000,Shandong,China;2.SchoolofLandscapeArchitecture,
5、BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China)Abstract:ObjectiveThemolecularregulationmechanismofbothbluepetalcolorationandpetalcolorvariationamongcornflowercultivarsremainsunclear.InordertofurtherscreenthekeyinteractionproteinsinvolvedinregulatingpetalcolorationbyY1HorY2Hmethodinthenearfuture,theye
6、astcDNAlibraryfromcornflowerpetalsofsixcultivarswithdifferentcolorswasestablishedbyGatewaytechnologyinthepresentstudy.MethodThewhite,pink,red,blue,mauveandblackcornflowerpetalswereusedtoextracttotalRNA,followedbymRNAisolationandpurification.Afterthesynthesisofdouble-strandcDNA,theBP recombination an
7、d LR recombination were performed to obtain the primary and secondary library,respectively.Finally,theplasmidsfromsecondarylibraryweretransformedintoyeastY187competentcellsto build the yeast cDNA library from cornflower petals of different colors.Result The qualityidentificationofboththeprimaryandth
8、esecondarylibraryrevealedthatthelibrarycapacitieswere1.3107CFUand1.6107CFU,respectively,therecombinationratewasboth100%,andtheaveragelengthof收稿日期:20230525修回日期:20230804基金项目:国家自然科学基金项目(32101579),山东省自然科学基金项目(ZR2021QC143),临沂大学博士人才科研启动项目(LYDX2021BS046)。第一作者:邓成燕,博士,讲师。主要研究方向:花卉分子生物学。Email:地址:276000山东省临沂市兰
9、山区双岭路中段北侧临沂大学。责任作者:戴思兰,博士,教授。主要研究方向:园林植物种质资源与育种、花卉分子生物学。Email:地址:100083北京市海淀区清华东路 35 号北京林业大学。本刊网址:http:/;http:/第46卷第3期北京林业大学学报Vol.46,No.32024年3月JOURNALOFBEIJINGFORESTRYUNIVERSITYMar.,2024insertfragmentwasbothmorethan1000bp.Aftertransformingintoyeast,theobtainedcDNAlibrarytiterwas3.5107CFU/mL.Atotalo
10、f24yeastcloneswerechosenrandomlyforPCRdetectionandshowedbrightbands,i.e.,therecombinantratewas100%.Moreover,thelengthofinsertedcDNAswaslongerthan1000bp.ConclusionAhighqualityofyeastcDNAlibraryusingcornflowerpetalsofdifferentcolorsisestablished,satisfyingthestandardofyeastlibraryscreen,whichwillprovi
11、dematerialbasisforresearchthemolecularmechanismofboththebluepetalcolorationandthepetalcolorvariationamongcultivarsinthenearfuture.Key words:cornflower;flowercolor;yeast;cDNAlibrary;Gatewaytechnology矢车菊(Centaurea cyanus)为菊科(Asteraceae)矢车菊属的一年生草本植物,兼具观赏、药用和食用价值。其头状花序小巧、繁密,是制作干燥花、花境和食品装饰的优选材料。此外,矢车菊花瓣提
12、取物具有抗氧化、抗炎症和抗菌等特性,被广泛用作传统药材和茶类饮品1。目前关于矢车菊的研究多聚焦于花瓣呈色的相关机制上。自然界多数积累矢车菊素的物种仅呈现不同程度的红色花,但蓝色矢车菊中的矢车菊素却能形成鲜艳亮丽的蓝色,这使其成为研究蓝色呈色机制的好材料。已有研究表明,矢车菊的蓝色花源于 6 分子矢车菊素、6 分子芹菜素、1 分子 Fe3+、1 分子 Mg2+和 2 分子 Ca2+组成的蓝色超分子色素2。前人在蓝色矢车菊中分离得到了液泡铁转运基因CcVIT,其异源表达后能使CCC1 酿酒酵母在高浓度 Fe2+溶液中正常生长,而紫色矢车菊突变体的CcVIT 蛋白发生了一处氨基酸的替换,其在酿酒酵母
13、中异源表达后,铁转运活性降低,据此推测CcVIT 可能在矢车菊素蓝色呈色过程中发挥了重要作用3。除珍贵的蓝色系外,矢车菊在不同花色品种间表现出丰富的花色变异,其中白色系不积累花青素,粉色和红色系只积累天竺葵素衍生物,而紫色和墨色系只积累矢车菊素衍生物4。进一步借助转录组测序技术在矢车菊中挖掘了一系列参与花青素生物合成的结构基因和调节基因,并通过烟草叶片瞬时表达、双荧光素酶、双分子荧光互补、酵母双杂交等技术鉴定了正向调控花青素生物合成的转录因子CcMYB6-1 和 CcbHLH15。虽然目前已在矢车菊中挖掘了参与色素合成、铁离子转运等的相关基因,但其花瓣呈色的遗传调控机制仍不完全明晰。因此,系统
14、地挖掘矢车菊花瓣呈色的相关基因仍是关键所在。酵母单杂交和双杂交系统是筛选靶蛋白与诱饵分子之间相互作用的常用方法,其中酵母单杂交系统用于分析 DNA 与蛋白质间的相互作用,而酵母双杂交系统用于分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用67。酵母 cDNA 文库是挖掘功能基因的有效方法,在该文库的基础上进一步运用酵母双杂交或单杂交文库系统可筛选出关键候选基因。目前已在金柑(Fortunella crassifolia)、月季(Rosa hybrida)、山葡萄(Vitis amurensis)、香蕉(Musa acuminata)、大花蕙兰(Cymbidium faberi)、百 合(Lilium spp.
15、)、芍 药(Paeonia lactiflora)、烟草(Nicotiana tabacum)和牡丹(Paeonia suffruticosa)等多种园艺植物中构建了酵母 cDNA 文库,协助解析花发育、逆境胁迫、果实成熟和色素合成等生命过程的分子调控机制715。然而,矢车菊的酵母 cDNA 文库尚未见报道。因此,构建高容量、高质量的酵母 cDNA 文库对矢车菊的相关研究具有重要的实际意义。Clontech 公司的 SMART 技术和 Invitrogen 公司的 Gateway 技术是在构建酵母 cDNA 文库时常用的 2 种方法。其中 SMART 技术使用 0.0251.000gmRNA,
16、即可稳定获得全长 cDNA1617;而 Gateway技术的 RNA 起始用量最低为 200g,在构建过程中 cDNA 不受限制性酶的酶切影响,可较好地保证cDNA 的完整性13。本研究以矢车菊 6 个不同花色品种的花瓣为试验材料,在 mRNA 充足的条件下利用 Gateway 技术构建了酵母 cDNA 文库,以期在后续研究中通过酵母单杂交或双杂交筛库技术筛选参与花色形成的关键候选基因,从而为研究矢车菊花瓣呈色的遗传调控机制提供材料基础。1材料与方法1.1 试验材料以矢车菊(Centaurea cyanus)6 个不同花色品种的花瓣为试验材料,包括矮汤姆系列的白色(DwarfTom Pouce
17、 White,DTPW)、粉 色(Dwarf TomPoucePink,DTPP)、红色(DwarfTomPouceRed,DTPR)和蓝色(DwarfTomPouceBlue,DTPB)品种;高双球系列的紫色(TallDoubleBallMauve,TDBM)和墨色(TallDoubleBallBlack,TDBB)品种。将其播种于 V草炭:V蛭石=11 的无土栽培基质,置于 16h 光照和 8h 黑暗的光照培养箱中,待开花后,按照前期对矢车菊不同品种不同发育阶段的划116北京林业大学学报第46卷分标准进行取样4,其中花瓣发育阶段的具体划分标准如下:S1,花瓣未着色;S2,花瓣开始着色,且着
18、色区占整个花瓣的 1/3;S3,花瓣完全着色,但未展开;S4,花瓣完全着色,且呈开展状态。将每个花色品种4 个不同发育阶段的花瓣进行混合取样,置于液氮中预冷,随后保存于80 冰箱中备用。华越洋植物 RNA 提取试剂盒购自于北京华越洋生物科技有限公司,CloneMinercDNA 文库构建试剂盒、UltraPureTM琼脂糖、PlatinumTMTaqDNAPlolymearse、dNTP(100mmol/L)、PureLinkTM快速凝胶提取和 PCR 纯化试剂盒、PureLinkTMHQMini质粒 DNA 纯化试剂盒、UltraPureTM苯酚氯仿异戊醇(体积比 25241)均购自于 In
19、vitrogen 公司,分子生物学试验专用醋酸铵溶液(5mol/L)购自于 Sigma公司。1.2 研究方法1.2.1花瓣总 RNA 提取与 mRNA 分离使用华越洋植物 RNA 提取试剂盒提取矢车菊 6个不同花色品种不同发育阶段的花瓣中的总 RNA,具体方法参照说明书。随后使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop(Agilent)检测 RNA 提取质量。在此基础上使用 OligotexmRNAMidiKit 试剂盒分离纯化mRNA,并经 1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化质量。1.2.2初级 cDNA 文库的构建与质量鉴定以 1.2.1 中分离纯化的 mRNA 为模板,参考CloneMiner 说明书依
20、次进行 cDNA 第一、二条链的合成。获得双链 cDNA 后,将其连接于 3 种三框 attB1 重组接头,分级分离后在 GatewayBPClonase 酶 促 反 应 液 的 催 化 下 将 其 连 接 至pDONRTM222 载体,随后将重组质粒转入大肠杆菌DH10B,加入 4mLSOC 培养基后于 37 摇床中230r/min 振荡培养,获得初级文库菌液。为鉴定文库容量,吸取 10L 培养物稀释 100 倍后涂布于50mg/L 卡那霉素的 LB 固体平板上,37 过夜培养后,统计平板上的克隆数。为鉴定重组率和插入片段的长度,随机挑取 24 个单克隆进行菌液 PCR,反应体系为:于每个克
21、隆中加入 2.0L10PCRBuffer,0.5LdNTP(10mmol/L),0.5LpDONR222F(5-GTAAAACGACGGCCAG-3,20mol/L),0.5LpDONR222R(5-CAGGAAACAGCTATGAC-3,20mol/L),0.3LDNAPolymerase(5U/L),16.2LddH2O。反应程序为:945min;9430s,6030s,722min,循环 25 次;725min。随后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。1.2.3次级文库的构建与质量鉴定抽提 1.2.2 中验证合格的初级文库的质粒,将其稀释至 300ng/L 后,在 GatewayLR
22、Clonase酶促反应液的催化下进行 LR 重组反应,随后将 LR 重组质粒转化大肠杆菌 DH10B,37、230r/min 振荡培养后获得次级文库菌液。为鉴定次级文库的质量,取 10L 菌液并稀释 100 倍,涂布于含 100mg/L氨苄霉素的 LB 固体平板,37 过夜培养后统计克隆数。进一步使用菌液 PCR 技术鉴定重组率和插入片段长度,反应体系和反应程序同 1.2.2,其中所用的引物为 pGADT7-DEST-F(5-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3)和 pGADT7-DEST-R(5-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACG
23、ATT-3)。随后经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物。1.2.4酵母文库的构建取 5g 次级文库质粒、20L 预变性的 CarrierDNA、600L 酵母(Y187)感受态细胞,涡旋振荡混合后加入 2.5mL1PEG/LiAc,混合后于 30 水浴锅中孵育 45min(每 15min 混匀一次),加入 160LDMSO,42 热激 20min(每 10min 上下颠倒混匀一次),700g 离心 5min,随后去上清液,加入 1mLYPDPlus 液体培养基重新悬浮,于 30 振荡复苏培养 1.5h。离心后弃上清液,加入 30mL0.9%NaCl 溶液重新悬浮细胞,取 100L 悬浮液分别
24、稀释 10、100、1000、10000 倍后涂布于 SD/-Leu 固体平板,30 培养 35d 后收集转化子,并使用菌液PCR 鉴定阳性克隆,反应体系为:1.0L 菌液,2.5L10Advantage2PCRBuffer,0.5L50dNTPMix,0.5LT7SPPrimer(5-TAATACGACTCACTATAGGGC-3),0.5L3ADPrimer(5-AGATGGTGCACGATGCACAG-3),0.5 L 50 Advantage2PolymeraseMix,19.5LddH2O。反应程序为:943min;9430s,5530s,722min,循环 35 次;725min。
25、随后经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。取阳性克隆进行测序,并使用NCBI 在 线 网 站(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)对测序结果进行比对和分析。1.3 数据统计在构建酵母文库过程中涉及的文库容量、重组率、文库滴度的计算公式如下。C=(N1/V1)AV2(1)式中:C 表示文库库容量,CFU;N1表示平板上的克隆数;V1表示涂布平板时的菌液体积,本研究中为50L;A 表示稀释倍数,100 倍;V2表示文库菌液总体积,本研究中为
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