光谱法研究天然牛磺酸与肝硬化门静脉高压大鼠的肝组织蛋白相互作用.pdf

基金项目：国家自然科学基金（）；广西自然科学基金（）；广西科技计划项目（桂科 ）通讯作者：邓鑫【技术与方法】光谱法研究天然牛磺酸与肝硬化门静脉高压大鼠的肝组织蛋白相互作用玉叶，廖娟，文彬，邓鑫（桂林市中医医院，广西 桂林 ；广西中医药大学附属瑞康医院；广西中医药大学基础医学院）摘要 目的：通过光谱法研究天然牛磺酸（）与肝硬化门静脉高压大鼠的肝组织蛋白相互作用并探讨其作用机制。方法：将 只大鼠按随机数字法分成正常组、模型组、心得安组、天然牛磺酸组四组，每组 只，除正常组外，其余组用四氯化碳（，）制备肝硬化门脉高压大鼠模型，造模同时给药。心得安组喂心得安，天然牛磺酸组喂天然牛磺酸，模型组喂等量生理盐水，疗程 周，治疗后对比各组门脉高压数值，并测定不同温度下各组天然牛磺酸药物 大鼠肝组织蛋白体系荧光光谱和天然牛磺酸紫外吸收光谱，根据光谱数据进行分析。结果：天然牛磺酸组大鼠门脉血流量（，）、门脉压力（，）、门脉阻力（）较心得安组、模型组更低，平均动脉压（，）较高。各组大鼠肝组织蛋白的 值均大于最大动态猝灭速率 （）。大鼠肝组织蛋白体系：焓变（）：；熵变（）：。正常组吉布斯自由能变化（）、均为负值，为正值；天然牛磺酸组、均为正值，为负值，模型组无明显规律。正常组、模型组、天然牛磺酸组 值分别为 、，值分别为 、。结论：天然牛磺酸具有抗肝纤维化，减轻门脉高压的作用，其机制可能是改变了肝硬化门脉高压大鼠的肝脏组织蛋白结构，从而减轻肝损害。关键词 紫外 分光光度法；天然牛磺酸；肝硬化门静脉高压；蛋白质；荧光分光光度法 ：，（，；）：年第 卷第 期 ，（），：，（），（），（）（）（），（）（），：，；门脉高压症是肝硬化的主要并发症，后期易并发腹水、食管静脉曲张、肝性脑病和肝肾综合征等，导致疾病预后不佳，治疗上主要针对病因和并发症治疗 。有效降低门静脉压力可降低肝硬化患者并发症的发生率，并可能提高其生存率。前期研究表明，天然牛磺酸具有改善肝功能及抗肝纤维化作用 。此外，等 首次发现天然牛磺酸能显著降低肝硬化大鼠门静脉压力，提高门静脉顺应性，有效减缓门脉高压，其作用机制可能与改善门静脉力学作用相关 。配体 蛋白质相互作用亲和力的信息对于评估具有重要药理意义化合物的治疗效果是非常有价值的。因此，本研究运用荧光光谱法探讨天然牛磺酸与肝硬化门静脉高压大鼠肝组织蛋白间的分子作用。材料和方法 实验动物 只 级雄性 大鼠，体质量（），长沙市天勤生物技术有限公司购买，动物许可证号：（湘），动物合格证号：，遵循 原则，在恒温（）、恒湿（）、昼夜循环（）条件下饲养。材料天然牛磺酸（从珍珠贝中提取，经蒸煮后，浓缩汤汁，加乙醇沉淀，取上清液，然后对上清液进行脱色处理，结晶得到天然牛磺酸），盐酸普萘洛尔片（别名心得安，规格为 片，由亚邦爱普森药业有限公司生产，国药准字：，含量 ）；橄榄油（阿拉丁工业公司）；甲醛（福尔马林）；人血清白蛋白（，以下简称 ，厂家为 （索莱宝），纯度 ，分子量为 ，缓冲液（飞净，）；缓冲液（飞净）；蛋白裂解液（）；（苯甲基磺酰氯，）；蛋白浓度测定试剂盒（）等。方法 动物模型的建立将 只大鼠按随机数字法分成正常组、模型组、心得安组、天然牛磺酸组四组，每组 只，除正常组外，其余三组用四氯化碳 年第 卷第 期 （，）制备肝硬化门脉高压大鼠模型，造模同时给药，疗程 周。样本收集动物模型制备成功后取材：麻醉，固定，沿大鼠腹中线逐层剪开腹壁并游离肝门静脉主干，连接电磁流量计以测定门静脉血流量（，）、门静脉压力（，）、右颈动脉插管用于测定平均动脉压（，）和心率（，）；测量结束后，分离肝脏组织，置于生理盐水中迅速漂洗 遍以清洁残留血液，冻存并标注。将所取下组织分成两部分：置于 甲醛溶液中固定过夜，保存，观察病理学改变并拍照记录；另一部分肝组织提取蛋白，并配制 工作液、蛋白标准品，采用全波长多功能酶标仪，于 处测定吸光值。紫外可见吸收光谱将天然牛磺酸用超纯水制备成浓度与组织蛋白相似的溶液，浓度为 ，使用紫外分光光度计测量并记录 处相应的天然牛磺酸紫外吸收光谱。荧光光谱根据提取的上清液所测蛋白浓度相似度配制所需浓度，正常组、模型组、天然牛磺酸组浓度相似，加入 缓冲液制成 的溶液，置于 低温保存备用。天然牛磺酸分为两组不同浓度梯度（一组：、；二组：、）。准确移取浓度为 的天然牛磺酸于 离心管中，并用移液管向每个离心管中移入 的 的各组大鼠蛋白溶液，置于漩涡混合器 ，使混合液充分混合。在 、（：开尔文 ，物理中常用 ，所以 时，；、）不同水浴温度下 后测量并记录相应的荧光值。荧光光谱扫描参数设置：发射光波长（）范围为 ，荧 光 激 发 光 波 长（）设 定 为 ，狭 缝 宽 度 为 ，扫 描 速 度 为 ，数据间隔为 ，灵敏度设为 。荧光猝灭荧光测量采用日本岛津 荧光分光光度计，激发波长 ，发射波长为 。研究天然牛磺酸诱导人血清白蛋白（，）荧光猝灭的机理，用 方程计算了 在不同温度下的荧光猝灭 ：（）是未加入猝灭剂时的荧光强度；是加入猝灭剂后的荧光强度；是双分子猝灭过程速率常数；是 动态猝灭常数；是猝灭剂的浓度；是未加入猝灭剂时荧光分子的平均寿命，生物大分子的平均荧光寿命约为 。结合常数的计算对于蛋白质的荧光猝灭为静态猝灭过程，当药物分子独立地与大分子上的一组等效位点结合时，根据 （）与 相比绘制双对数曲线，可以通过截距和斜率分别得到结合位点数 和结合常数。结合常数（）和结合位点数（）可以由下式确定 ：（）式中，表示未加入猝灭剂时荧光体的荧光强度；表示加入猝灭剂时荧光体的荧光强度，是猝灭剂与 的表观结合常数；是结合位点数；为猝灭剂的浓度。热力学参数的测定热力学参数可根据 方程 来估算：（）其中 类似于相应温度下的缔合结合常数即，为气体常数。焓变（）由范特霍夫关系式的斜率计算得出。然后，根据以下关系 估计自由能变化（）：年第 卷第 期 （）能量转移的计算可以根据施主发射光谱和受主吸收光谱使用 公式来计算 。（）（）（）（）其中能量传递效率 由上式（）定义。是受体和施主之间的距离，是 临界距离，在该临界距离下，的激发能量转移到受体；是表示供体相对于受体分子的相对取向的因子；是介质的折射率；是在没有受体或供体的情况下量子产率；是供体的荧光发射光谱和受体的吸收光谱的重叠积分；是在波长 处没有受体的情况下给体的荧光强度；是受体在 处的紫外摩尔吸收系数。已 有 文 献 报 道 ，。是重叠区域，从而计算出 、和 。统计学方法采用 统计软件分析。符合正态分布的计量资料以（）表示，组间比较行方差分析，以 表示差异具有统计学意义。结果 天然牛磺酸治疗后门静脉压力相关指标的对比与正常组比较，模型组、天然牛磺酸组、心得安组门静脉压力（）、门静脉流量（）升高；平均动脉压（）降低（均 ）；与模型组比较，天然牛磺酸组、心得安组 、下降（），升高（）；与心得安组比较，天然牛磺酸组 、下降（），升高（）。在 （心率）方面，组间两两比较差异无统计学意义（）。见表 。表 大鼠门脉压力相关指标（）组别 （）（）（）（次 ）正常组 模型组 天然牛磺酸组 心得安组 天然牛磺酸与蛋白相互作用在微孔板中加入 工作液后，混合溶液出现显色反应，颜色随着时间反应不断加深。以不含 的样品的光吸收值作为空白对照，绘制标准曲线图（图 ）。根据 标准曲线图计算出待测样品浓度。见表 。图 标准曲线表 各组肝硬化大鼠肝脏组织蛋白浓度（）分组正常组模型组天然牛磺酸组 值 浓度 最终浓度 注：检测时上清液稀释 倍，计算出浓度再计算出最终浓度。天然牛磺酸与肝硬化门静脉高压大鼠蛋白荧光光谱温度在 、时，浓度固定，逐渐增加天然牛磺酸浓度测出的荧光发射光谱图见图 、。随着天然牛磺酸浓度的增加，不同温度下 荧光强度从 到 出现明显而规律的下降，即说明 的荧光发生了猝灭。此外，、时均在 附近出现荧光的最大峰，不同温度下的最大发射波长均出现轻微蓝移，蓝移可达 （），蓝移表明色氨酸残基的极性较弱（或疏水性较强）。该现象表明天然牛磺酸中药物小分子可能与 相互作用生成复合物，其空间构象可能在一定程度上发生变化。荧光猝灭根据图 、，运用方程（）绘制了在不同温度下天然牛磺酸与大鼠蛋白的 图（图 ）。年第 卷第 期 图 不同温度下天然牛磺酸与大鼠肝脏组织蛋白荧光发射光谱（一组）注：正常组模型组牛磺酸组 ；牛磺酸（、）；：正常组 ：模型组 ：牛磺酸组图 不同温度下天然牛磺酸与大鼠肝脏组织蛋白荧光发射光谱图（二组）注：正常组 模型组 牛磺酸组 ；牛磺酸（、）；。：正常组 ：模型组 ：牛磺酸组基于图 、中的图形，运用方程（）绘制了图 的 曲线图，根据图线的斜率和截距，计算出相应的天然牛磺酸与大鼠蛋白相互作用的动态猝灭常数及猝灭速率，结果见表 。结合常数和结合位点结合图 、方程求出 、。由表 可知当温度为 、时 均大于最大动态猝灭速率 图 大鼠肝脏组织蛋白与天然牛磺酸体系的两组荧光猝灭 曲线注：正常组模型组天然牛磺酸组 ；牛磺酸 ；。、：正常组一组、二组；、：模型组一组、二组；、：天然牛磺酸组一组、二组表 大鼠肝脏组织蛋白与天然牛磺酸反应的两组 常数组别分组（）由图拟合 方程得出斜率截距 （）（）正常组一组 二组 模型组一组 二组 牛磺酸组一组 二组 （），实验结果表明，天然牛磺酸对 的荧光猝灭是天然牛磺酸 复合物形成的结果，荧光猝灭是静态猝灭的可能性较大，对于静态淬火过程，根据方程（）对淬火数据进行了分析，得出对数曲线（图 ），显示了 天然牛磺酸结合的线性依赖关系；线性回归分析（表 ）列出了不同温度与大鼠蛋白相关的天然牛磺酸的结合常数和结合位点 。热力学参数和结合力的性质为了解释天然牛磺酸与大鼠蛋白相互作用的能量变化，用 图计算了热力学参数。在近似恒定的假设 年第 卷第 期 下，给出了天然牛磺酸与大鼠蛋白结合的 关系（图 ），显示了从拟合线原点处的斜率和纵坐标获得的结合位点的和 的值，根据公式（）计算出（表 ）。图 肝脏组织蛋白与牛磺酸体系的两组双对数曲线注：正常组 模型组 牛磺酸组 ；牛磺酸 ；。、：正常组一组、二组；、：模型组一组、二组；、：天然牛磺酸组一组、二组表 天然牛磺酸与大鼠肝脏组织蛋白反应的两组结合常数及结合位点数组别分组 （）正常组一组 二组 模型组一组 二组 天然牛磺酸组 一组 二组 图 天然牛磺酸与大鼠肝脏组织蛋白的两组 曲线注：（肝脏组织蛋白）：；（天然牛磺酸）：；。、：正常组一组、二组；、：模型组一组、二组；、：天然牛磺酸组一组、二组表 天然牛磺酸与大鼠蛋白体系的 对数方程结合常数 值及相关热力学参数组别分组（）（）（）（）正常组一组 二组 模型组一组 二组 天然牛磺酸组一组 二组 能量转移将天然牛磺酸的 光谱与大鼠蛋白荧光光谱绘制光谱重叠图如图 所示，在各组组织蛋白的荧光发射光谱和天然牛磺酸的吸收 光谱之间有光谱重叠。根据 理论，能量传递效率 定义为上述公式（）（）。其中 是从配体到蛋白质色氨酸残基的距离，是 临界距离，在该距离下 的激发能量转移到受体。它可以用 公式从施主发射光谱和受主吸收光谱中计算出来，即可以计算天然牛磺酸 系统的结合距离，结果见表 。年第 卷第 期 图 大鼠蛋白荧光光谱和天然牛磺酸的紫外光谱重叠图注：；天然牛磺酸 ；：正常对照组：模型对照组 ：天然牛磺酸组表 各组非放射性能量转移相关参数分组（）（）（）（）非辐射能量转移正常组 是模型组 是天然牛磺酸 是 讨论天然牛磺酸在各种器官和组织成分中起着重要的生理和病理作用，这些作用包括渗透调节、膜稳定、调节钙水平、抗氧化、抗凋亡、抗炎和抗脂质活性，其中抗氧化作用能影响细胞增殖、炎症和胶原组织 。天然牛磺酸含量降低与组织生理稳态失衡可能会导致骨骼肌，心脏，肝脏和脂肪组织的能量代谢失衡 。由表 及图 实验结果再次证实天然牛磺酸具有抗肝纤维化及抑制肝硬化门脉高压作用。荧光猝灭是由猝灭剂与荧光团之间的碰撞或形成络合物而引起样品荧光强度降低的过程，包括激发态反应、分子重排、能量转移、基态复合物的形成和碰撞猝灭 ，通常分为动态猝灭和静态猝灭 。动态猝灭过程是荧光团和猝灭剂分子在介质中扩散的结果，只影响荧光团的激发态，不改变吸收光谱。静态猝灭是由于荧光团和猝灭剂分子之间形成暗色络合物，经常导致吸收光谱的变化。图 、得出正常组、模型组、天然牛磺酸组大鼠蛋白在不同温度下，随着天然牛磺酸浓度逐渐增加，一组，二组均出现明显而规律地下降，说明各组大鼠蛋白与天然牛磺酸体系的荧光发生了相互作用。由于静态猝灭时配合物的稳定性降低，猝灭速率常数随温度的升高而减小。相反，动态猝灭速率常数会随着温度的升高而增加，因为温度越高，猝灭剂的扩散就越快，因此碰撞猝灭的量就越大 。由表 可知不同温度天然牛磺酸的 均大于最大动态猝灭速率 （），可以判定天然牛磺酸对各组大鼠蛋白的荧光猝灭机制均为静态猝灭。此外，各组在不同温度时均在 附近出现荧光的最大峰，而且最大发射波长均出现轻微蓝移，蓝移可达 （），蓝移表明色氨酸残基的极性较弱（或疏水性较强）。该现象说明天然牛磺酸可能与组织蛋白相互作用从而使其空间构象在一定程度上发生变化生成复合物。由表 可以观察出不同温度天然牛磺酸与正常组蛋白反应的结合位点数近 ，说明天然牛磺酸与正常组蛋白结合比例约为 。推测正常组的结合过程属于静态猝灭，因为表观结合常数 随着温度的升高值减小，证明了随着温度升高天然牛磺酸与正常组蛋白结合产生的复合物的稳定性下降。而模型组，天然牛磺酸组蛋白与天然牛磺酸的结合位点数均近 ，说明天然牛磺酸与两组蛋白结合比例约为 。模型组表观结合常数 随着温度的升高无明显规律，猝灭机制是动态猝灭或静态猝灭待进一步验证。天然牛磺酸组表观结合常数 随着温度的升高而升高，随着温度升高两者之间结合作用增强，结合产生的复合物的稳定性上升。药物和生物分子之间的相互作用力可能包括静电相互作用、多个氢键、范德华相互作用、抗体结合位点内的疏水和空间接触等 。蛋白质反应的热力学参数的显著性和大小可以解释对蛋白质稳定性有贡献的主要作用力。从热力学角度看，和 表示疏水相互作用，和 表示范德华力或氢键形成，和 表示静电作用力。表 显示了从拟合线原点处的斜率和截距获得的结合位点的和值。从表 看出正常组蛋白两组均为负值，表明正常组蛋白结合过程是自发。两者相互作用的和值表明，结合主要是熵驱动的，焓对其不利，是静电作用力在反应中起主要作用。模型组蛋白一组均为负值，但二组均为正值，可能受天然牛磺酸浓度影响，低浓度结合过程符合自发。天然牛磺酸组两组均为正值，表明两者相互作用过程不是自发。年第 卷第 期 两者相互作用的和值表明值的主要来源是项的较大贡献，而因子的贡献很小。因此，天然牛磺酸组与天然牛磺酸之间的相互作用可能是氢键和范德华作用。荧光共振能量转移（）是研究蛋白质 配体相互作用和评估蛋白质的色氨酸残基与配体之间距离的可靠方法。表 中结果显示各组供体到受体的距离 ，表明能量从蛋白到天然牛磺酸的能量转移发生可能性很大，这也符合 的条件，表明天然牛磺酸与组织蛋白之间存在静态猝灭作用。药物与蛋白质大分子的相互作用是药物发生药理效应的重要途径，它可以影响生物活性和毒性，结合参数有助于药代动力学研究和剂型设计。通过光谱法观察药物与大分子相互作用前后的光谱对比，与传统的亲和层析、尺寸排斥层析、平衡透析、超滤等方法相比，光谱法具有灵敏度高、分析时间较短等优点。实验结果表明，天然牛磺酸可能通过改变 诱导的肝硬化门脉高压大鼠的肝脏组织蛋白结构而达到改善肝组织损伤及血流状态的作用。参考文献 ，：，（）：梁健，邓鑫，王勤，等应用基因芯片分析牛磺酸对肝星状细胞基因表达的调控 第二军医大学学报，（）：邓鑫，梁健，李益忠，等天然牛磺酸对肝纤维化大鼠肝线粒体的保护作用 西安交通大学学报（医学版），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：赵静药物小分子与生物大分子相互作用机理的研究 大连：辽宁师范大学，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：（收稿日期：）年第 卷第 期