松墨天牛4龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制.pdf

DOI:10.12171/j.10001522.20220438松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制刘佳奇1,2赵立娟1,2刘磊1,2黄瑞芬3韩有志1张志伟1,2崔绍朋1,2高瑞贺1,2（1.山西农业大学林学院，山西太谷030800；2.山西省林业危险性有害生物检验鉴定中心，山西太谷030800；3.国家林业和草原局生物灾害防控中心，辽宁沈阳110034）摘要:【目的】明确松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制，为松墨天牛的科学防治提供理论依据。【方法】于 2021 年 3 月中旬于江西省德兴市采集松墨天牛 4 龄越冬幼虫，设置 25（对照）、4、0、5、10、15和207 个温度梯度和 30min、1h 和 3h 共 3 个时间梯度，分别测定虫体耐寒能力、耐寒物质含量、抗氧化酶活性以及低温胁迫对中肠损伤情况。【结果】（1）在过冷却点（9.270.90）附近，50%致死时间约为 1.9h（114.97min），99%致死时间约为 2.8d（4061.86min），在低于过冷却点（15）的低温胁迫下，50%和 99%致死时间约为10 低温处理下的 1/4。（2）在低温胁迫处理后，4 龄越冬幼虫虫体含水率变化不显著，脂肪含量和糖原质量浓度在 0 处理 3h后显著下降（P0.05），山梨醇质量浓度在5 处理 1h 后显著上升（P0.05），在20 处理 1h 后显著下降（P0.05）。（3）低温胁迫处理后，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性均呈显著上升趋势（P0.05）。（4）松墨天牛 4 龄越冬幼虫中肠在15 处理 3h 后中肠内壁分解，细胞之间出现空泡，20 处理 3h 后中肠细胞破裂，细胞内容物逸散并充满整个肠腔，空泡消失。【结论】本文明确了松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的氧化应激生理反应，可丰富、完善松墨天牛耐寒机理研究。关键词：松墨天牛；越冬幼虫；耐寒物质；抗氧化酶系中图分类号：S763.7文献标志码：A文章编号：10001522(2024)04007410引文格式：刘佳奇，赵立娟，刘磊，等.松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制 J.北京林业大学学报，2024，46(4)：7483.LiuJiaqi,ZhaoLijuan,LiuLei,etal.Physiologicaladaptationmechanismof4-agewinteringlarvaeofMonochamus alternatus(Coleoptera:Cerambycidae)in response to low temperature stressJ.Journal of Beijing ForestryUniversity,2024,46(4):7483.Physiological adaptation mechanism of 4-age wintering larvae of Monochamusalternatus(Coleoptera:Cerambycidae)in response to low temperature stressLiuJiaqi1,2ZhaoLijuan1,2LiuLei1,2HuangRuifen3HanYouzhi1ZhangZhiwei1,2CuiShaopeng1,2GaoRuihe1,2(1.CollegeofForestry,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030800,Shanxi,China;2.ShanxiDangerousForestPestInspectionandIdentificationCenter,Taigu030800,Shanxi,China;3.BiologicalDisasterPreventionandControlCenterofNationalForestryandGrasslandAdministration,Shenyang110034,Liaoning,China)Abstract:ObjectiveThispaperaimstodeterminethephysiologicaladaptationmechanismofthe4-agewinteringlarvaofM.alternatustolowtemperaturestress.MethodThe4-agewinteringlarvaofM.alternatuswerecollectedfromDexing,JiangxiProvinceofeasternChinainmid-Marchofthe2021,andseventemperaturegradientsof25(control),4,0,5,10,15and20andthreetimegradientsof收稿日期:20221101修回日期:20230601基金项目:山西省应用基础研究计划青年科技研究基金项目（20210302124062），山西省回国留学人员资助项目（2023-087），山西省高等学校科技创新项目（2021L128），山西省研究生创新项目（2021Y326），中央高校基本科研业务费专项（BFUKF202119）。第一作者:刘佳奇。主要研究方向：林业外来有害生物防控。Email：地址：030800 山西省晋中市太谷区铭贤南路1 号山西农业大学林学院。责任作者:高瑞贺，副教授。主要研究方向：林业外来有害生物防控。Email：地址：同上。本刊网址:http:/；http:/第46卷第4期北京林业大学学报Vol.46，No.42024年4月JOURNALOFBEIJINGFORESTRYUNIVERSITYApr.，202430min,1hand3hwereset,thecoldtolerance,contentofcold-resistantsubstances,activityofantioxidantenzymesandthedamageofmidgutunderlowtemperaturestressweredetermined.Result(1)Nearthesupercoolingpoint(9.270.90),the50%lethaltimewasabout1.9h(114.97min),andthe99%lethaltimewasabout2.8d(4061.86min).Underlowtemperaturestressbelowthesupercoolingpoint(15),thelethaltimeof50%and99%wasabout1/4ofthatunderlowtemperaturetreatmentof10.(2)Afterlow temperature stress treatment,the water content of the 4-age wintering larvae did not changesignificantly,thefatcontentandglycogenmassconcentrationweresignificantlydecreasedafter3hat0(P0.05),andthesorbitolmassconcentrationwassignificantlyincreasedafter1hat5(P0.05),andsignificantly decreased after 1 h at 20 (P 0.05).(3)After low temperature stress treatment,theactivitiesofantioxidantenzymes(SOD,POD,CAT)weresignificantlyincreased(P0.05).(4)Themidgutofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatuswasdecomposedafter15treatmentfor3h,andvacuolesappearedbetweencells.After20treatmentfor3h,themidgutcellswereruptured,andthecellvacuolesescaped and filled the whole intestinal cavity,and the vacuoles disappeared.Conclusion This studyclarified the physiological response of oxidative stress of the fourth instar overwintering larvae to lowtemperaturestress,whichcouldenrichandimprovethestudyoncoldtolerancemechanismofM.alternatus.Key words:Monochamus alternatus;winteringlarvae;coldresistantsubstances;antioxidantenzymesystem松墨天牛（Monochamus alternatus），又名松褐天 牛、松 天 牛，属 鞘 翅 目（Coleoptera）、天 牛 科（Cerambycidae）、沟胫天牛亚科（Lamiinae）、墨天牛属（Monochamus）。它是我国松科（Pinaceae）树种的主要蛀干害虫，并且也是国际公认的重大森林植物检疫对象松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的重要媒介昆虫之一。在松材线虫的扩散和侵染的过程中，松墨天牛起着携带、传播和协助病原侵入寄主的关键性作用1。传统观点认为，松墨天牛在我国主要分布于广西、江苏、江西、浙江、湖南、台湾、四川、河北、云南、广东、福建、西藏、山东、香港、安徽、河南、贵州、湖北、陕西 19 个省（自治区、特别行政区）23。然而，近年来松墨天牛开始向我国北方扩散。自 2004 年 8 月吉林通化市首次记录松墨天牛以来4，2016 年大连市松材线虫病疫情期间发现了大量松墨天牛5，2018 年山西又首次出现了松墨天牛野外种群。当松墨天牛突破其原有分布区域，在我国更北部地区定殖后，其越冬虫态必然要适应冬季更为寒冷的温度，这也表明松墨天牛越冬虫态具有较强的耐寒能力。昆虫抗寒性是昆虫生态学研究的热点领域。昆虫在生长发育过程中经历着复杂的生态环境变化，其生理功能、基本行为甚至进化途径都受温度的控制和影响，而冬季低温环境是其生存的直接障碍6。在长期对寒冷气候适应的过程中，昆虫逐渐进化出两种耐寒策略耐受型和躲避型，前者可以忍受细胞结冰而继续存活，后者只能在过冷却点以上存活7。昆虫耐寒能力的高低直接影响其生殖、扩散、分布及在下一季节的发生动态，决定其种群生存和发展810，Jikumaru 等11发现低温也会导致松墨天牛传播松材线虫的效率降低。此外，昆虫具有能够在短时间内快速适应低温胁迫的能力1213。西花蓟马（Frankliniella occidentalis）14、枣椰扁潜甲（Wallaceadactyliferae）15等在低温驯化后，低温存活率均显著提高。在低温胁迫等逆境环境下，昆虫体内会发生氧化应激反应，即昆虫受到胁迫时体内会产生大量活性氧（ROS）16。昆虫体内也有一套抗氧化系统来清除过量的活性氧，使其保持在较低水平，达成动态平衡的关系17。在这一抗氧化系统中，超氧化物歧化酶（SOD）可以清除 O2，同时产生有害的 H2O2，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）则可以分解H2O2，Fridovich 将其称为保护酶系统18。耐寒物质的合成也是昆虫抵御寒冷胁迫的重要途径提高细胞液浓度，从而降低冰点12，脂质、糖类、山梨醇、海藻糖等均是重要的耐寒物质。此外，低温胁迫处理后，昆虫中肠出现结构松散、细胞坏死等病理变化19。在高温处理下，小金蝠蛾（Hepialusxiaojinensis）的超氧化物歧化酶（SOD）活性维持在较高水平，而其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）和丙二醛（MDA）活性均显著上升20。对于华山松大小蠹（Dendroctonusarmandi），其越冬幼虫的 POD活性在 10 月到次年1 月显著上升21。Fields 等22研究发现海藻糖在谷象（Sitophilus granaries）冷驯化中起到了重要作用。红尾肉蝇（Sarcophaga crassipalpis）在经历快速冷驯化后，山梨醇和甘油含量有所增加23；而黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）在快速冷驯化后，其葡萄第4期刘佳奇等：松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制75糖和海藻糖含量也有所增加24。家蚕（Bombyx mori）在 4 低温连续处理 20h 后中肠细胞结构松散，内壁褶沟变浅，并出现组织坏死的情况19。松墨天牛越冬幼虫能够度过北方寒冷的冬季并建立稳定种群，说明其有着强大的耐寒能力。由于松墨天牛不断向北扩散，对松墨天牛在新增分布区的基础研究也在持续进行，如发生情况5、空间分布格局2526等。研究表明，越冬幼虫在松墨天牛整个生活史中的耐寒性最强27，人为冷驯化后和冬季采集的越冬幼虫耐寒性也较适宜温度下生活的幼虫大幅增强2829。松墨天牛越冬幼虫体内的脂肪、糖原等耐寒物质在越冬期间均发挥重要作用3031。分子生物学的发展使得松墨天牛温度胁迫机制的研究得以深入。在热休克蛋白 70（HSP70s）家族中，部分基因在松墨天牛温度胁迫中起重要作用。研究发现，热休克蛋白基因在 3 龄幼虫体内经低温胁迫处理后的表达量会上升，但对高温胁迫更加敏感32。李慧等33研究发现，MaltHSP21.20 可能在松墨天牛幼虫的滞育越冬过程中发挥重要作用。此外，Zhang 等34发现 miRNAs 基因中的 miR-31-5p 通过促进蛔虫苷的产生，有效增强了松墨天牛的耐寒性。同时，MaltHSP70-2 可能与其他 HSP 基因相互作用，共同在松墨天牛成虫的耐热性中发挥作用35。尽管如此，目前关于松墨天牛抗氧化应激反应的系统研究尚未开展。本研究以松墨天牛 4 龄越冬幼虫为试验对象，在一系列低温胁迫下分别处理不同时间，以检测低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的氧化应激生理反应的影响，具体包括虫体耐寒能力（如低温存活率）、耐寒物质含量（如含水率、脂肪、糖原、山梨醇）以及血淋巴抗氧化酶活性（如过氧化物酶 POD、超氧化物歧化酶 SOD、过氧化氢酶 CAT）的变化。此外，通过组织切片法研究了松墨天牛4 龄幼虫在低温胁迫下中肠发生的病理变化。本研究旨在为明确松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应寒冷胁迫的耐寒机制提供理论依据。1材料与方法 1.1 试验材料2021 年 3 月中旬于江西省德兴市采集松墨天牛 4 龄越冬幼虫。使用液压劈木机劈开木段，用镊子取出幼虫后放入带孔的 5mL 离心管中带回实验室，随机编号，测量基本形态指标后放入 10mL 离心管中饲养。幼虫鉴定采用形态鉴定和分子鉴定两种方法。1.2 试验方法经前期试验测定，松墨天牛 4 龄越冬幼虫在室温下的的平均过冷却点为（9.270.90），最低为11，最高为8；其结冰点为（3.670.30），最低为4，最高为3。以松墨天牛 4 龄越冬幼虫为试验对象，以室温（25）为对照，设置 4、0、5、10、15 和206 个试验组，每组 6 个重复，每个重复 1 头幼虫，分别处理 30min、1h 和 3h。1.2.1松墨天牛 4 龄越冬幼虫耐寒能力及抗氧化酶系活性测定松墨天牛 4 龄越冬幼虫过冷却点和结冰点测定使用过冷却点仪测定，共测定 3 个重复，每个重复 2头幼虫；含水率、脂肪含量测定参考董亚新等36的方法，糖原质量浓度、山梨醇含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性测定使用索莱宝公司的试剂盒。1.2.2松墨天牛4 龄越冬幼虫低温胁迫对肠道损伤情况以 25 为对照组，将松墨天牛 4 龄越冬幼虫分别置于15、20 低温处理 3h 后解剖出消化道，每组 3 个重复，每个重复 1 头幼虫，石蜡切片制作使用苏木精伊红染色法37染色，置于显微镜下观察中肠受损情况并拍照。1.2.3数据分析与作图使用 Excel2019 和 SPSS24 软件进行数据处理和描述统计；使用 SPSS24 对耐寒物质含量和抗氧化酶系活性数据进行单变量方差分析，作图均使用GraphPad6.0 完成，石蜡切片照片使用显微镜拍摄。2结果与分析 2.1 松墨天牛 4 龄越冬幼虫耐寒能力测定2.1.1松墨天牛 4 龄越冬幼虫低温存活率由图 1 可知，松墨天牛 4 龄越冬幼虫在室温（25）、4 和 0 处理下存活率为 100%；在5处理 30min 和 1h 时，存活率为 80%；在5 处理3h 以及15 处理 30min 时，幼虫存活存活率为50%；在15 处理 3h 以及20 处理 30min、1h306012025 4 0 5 10 15 20 100806040200低温存活率Low temperature survival rate/%处理时间Treatment duration/min90150180210240图1松墨天牛 4 龄越冬幼虫低温存活率曲线Fig.1Lowtemperaturesurvivalratecurvesofthe4-agewinteringlarvaeofMonochamus alternatus76北京林业大学学报第46卷和 3h 时，幼虫存活率为 0%。2.1.2松墨天牛 4 龄越冬幼虫低温致死时间使用 Probit 模型分析松墨天牛 4 龄越冬幼虫不同低温胁迫下的致死时间，由表 1 可知，随着处理温度降低，致死时间呈逐渐降低的趋势。在10 处理后，50%、90%和 99%致死时间分别约为 1.9h（114.97min）、13.7h（819.27min）和 2.8d（4061.86min），在15 处理后则分别为 27.75min、3.3h（197.76 min）和 16.3 h（980.48 min），50%、90%和99%致死率均减少了 3 倍多，说明松墨天牛 4 龄越冬幼虫在低于过冷却点的温度下无法长时间存活。2.2 低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫耐寒物质的影响2.2.1低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫含水率的影响不同低温胁迫下处理 30min 与 1h，各试验组含水率较对照组有所降低但不显著；经过 3h 低温胁迫处理，10 与20 处理较对照组有所上升但仍不显著，在10 处理下最高（73%），在 0 处理下最低（65%）（图 2）。2.2.2低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫脂肪含量的影响经过 30min 低温胁迫处理，15 处理脂肪含量较对照组显著上升至 15%（P0.05），20 处理较对照组显著下降至 5%（P0.05）。低温胁迫处理1h 后，0 与15 处理脂肪含量较对照组显著下降（P0.05），其中 0 处理下降至最低，为 6%，10 处理上升至最高，为 10%。继续处理至 3h，0 和5 的脂肪含量较对照组显著减少（P0.05），其中 0 处理下降至最低，为 5%（见图 3）。2.2.3低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫糖原质量浓度的影响低温胁迫处理 30min 时，各试验组糖原质量浓度较对照组均有所降低，但不显著；低温胁迫处理 1h3 h1 h温度 Temperature/含水率Water content/%2545010 15 2002040608030 min2545010 15 200204060802545010 15 20020406080aaaaaaaaaaaaaaabababbabaa不同小写字母表示不同温度之间差异显著。下同。Differentlowercaselettersindicatesignificantdifferencesbetweendifferenttemperatures.Thesamebelow.图2低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫含水率的影响Fig.2Effectsoflowtemperaturestressonwatercontentofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus3 habacbcababbc30 min脂肪含量Fat content/%05101520bbbbacb1 h温度 Temperature/abacbccabcabc2545010 15 20051015202545010 15 20051015202545010 15 20图3低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫脂肪含量的影响Fig.3Effectsoflowtemperaturestressonfatcontentofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus表1松墨天牛 4 龄越冬幼虫低温处理下 50%、90%、99%致死时间Tab.150%,90%,99%leathaltimeofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatusunderlowtemperaturetreatmentmin项目Item2540510152050%致死时间50%oftheleathaltime15796.9620896.21920.23136.77114.9727.750.3290%致死时间90%oftheleathaltime112571.00148908.706557.64974.60819.27197.762.2999%致死时间99%oftheleathaltime558113.00738271.3032511.984831.964061.86980.4811.35第4期刘佳奇等：松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制77后，0、5 和20 处理较对照组均显著上升（P0.05），其中5 处理后最高，为（1.250.31）mg/mL；处理3h 后，只有0 处理较对照组显著上升（P0.05），为（1.380.39）mg/mL（见图 4）。2.2.4低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫山梨醇质量浓度的影响低温胁迫处理 30min 时，0 处理山梨醇质量浓度较对照组显著上升至（1.100.14）mg/mL（P0.05），10 处理较对照显著下降至（0.560.05）mg/mL（P0.05）；处理 1h 后，5 处理较对照组显著上升至（0.980.18）mg/mL（P0.05），20处理较对照组显著下降至（0.500.03）mg/mL（P0.05）；继续低温胁迫 3h 后，0 与5 处理较对照组显著下降（P0.05）（图 5）。2.3 低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫抗氧化酶系的影响2.3.1低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫 SOD 活性的影响低温胁迫处理 30min 与 1h，各试验组 SOD 活性变化与对照组均无显著差异，低温胁迫处理 3h后，20 处理较对照显著上升（P0.05），为（148.920.73）U/（mgmin）（图 6）。2.3.2低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫 POD 活性的影响低温胁迫处理 30min 和 1h，POD 活性在20处理后较对照组显著上升（P0.05）；低温胁迫处理3 hbbababbab30 min糖原质量浓度Glucogen mass concentration/(mgmL1)00.51.01.52.0aaaaaabb1 h温度 Temperature/abcaaacc2545010 15 2000.51.01.52.02545010 15 2000.51.01.52.02545010 15 20图4低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫糖原质量浓度的影响Fig.4Effectsoflowtemperaturestressonglucogenmassconcentrationofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatusaacbaaba3 h30 min00.51.01.500.51.01.500.51.01.5cbabbbb1 h温度 Temperature/bcbcbcacddb2545010 15 202545010 15 202545010 15 20山梨醇质量浓度Dorbitol mass concentration/(mgmL1)图5低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫山梨醇质量浓度的影响Fig.5Effectsoflowtemperaturestressondorbitolmassconcentrationofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus3 hbabbaababab1 haaaaaaa30 minSOD 活性SOD activity/(Umg1min1)050100150200aaaaaaa温度 Temperature/2545010 15 200501001502002545010 15 200501001502002545010 15 20图6低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫 SOD 活性的影响Fig.6EffectsoflowtemperaturestressonSODactivityofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus78北京林业大学学报第46卷3h 后，10、15 和20 处理较对照组均显著上升（P0.05），呈随温度降低而上升的趋势（图 7）。2.3.3低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫 CAT 活性的影响低温胁迫处理 30min，CAT 活性在15 时较对照组显著提高（P0.05），达（1152.87120.03）U/（mgmin）；胁迫 1h 后，10 处理活性较对照组显著上升（P0.05），为（606.4113.09）U/（mgmin）；胁迫 3h 后，5 处理较对照组显著下降（P0.05），10、15、20 处理较对照组显著上升（P0.05），在20 时上升至最高，为（720.291.46）U/（mgmin）（图 8）。2.4 低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫中肠组织的影响中肠作为天牛幼虫消化食物的主要器官，在幼虫遭受寒冷胁迫时，其受损情况直接影响到幼虫能否存活。松墨天牛 4 龄越冬幼虫中肠在受到低温胁迫时，其外形始终是椭圆形，无明显变化。健康幼虫中肠（如图 9a、b）的中肠外壁紧贴中肠环肌，中肠环肌结构紧密，围食膜褶皱明显；15 处理 3h（如图 9c、d）后，幼虫中肠的外壁碎裂，与中肠环肌之间出现空泡，中肠环肌结构松散，出现较多空泡，围食膜结构破碎消失；20 处理 3h（如图 9e、f）后，中肠外壁破碎，中肠环肌及围食膜溶解，出现空泡，细胞核分布散乱。3讨论外界环境温度变化会显著影响昆虫的生长发育、代谢与繁殖等生命过程38。当环境温度下降时，昆虫体内会发生一系列物质变化来抵御寒冷胁迫39，不同的昆虫也演化出了不同的耐寒调节机制：光肩星 天 牛（Anoplophora glabripennis）40通 过 糖 原低分子糖醇含量的调控抵御低温胁迫，红缘天牛（Asias halodendri）41通过调节血淋巴中氨基酸浓度越冬，青杨脊虎天牛（Xylotrechus rusticus）42的耐寒调节机制则是糖原、脂肪甘油、抗冻功能蛋白的相互转化。Probit 模型分析显示，松墨天牛 4 龄幼虫在10的半数致死时间和 99%致死时间分别为 114.97 和4061.86min。当温度下降到15 时，其半数致死时间和 99%致死时间分别缩短到 27.75 和 980.48min，较10 缩短了约 3 倍。由此可见，温度降低到过冷却点以下时，松墨天牛的存活时间就会大大缩短。这也验证了松墨天牛采用的是避免结冰的耐寒策略43。研究表明，松墨天牛越冬幼虫在越冬期间的不同月份中，其含水率不断升高31。在对光肩星天牛40、红缘天牛41、赤松毛虫（Dendrolimus spectabilis）44、3 h30 minPOD 活性POD activity/(Umg1min1)01002002 0003 00015 00030 0001 hbbbbabbbbbbabbdddcabd2545010 15 2001002002 0003 00015 00030 0002545010 15 2001002002 0003 00015 00030 0002545010 15 20温度 Temperature/图7低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫 POD 活性的影响Fig.7EffectsoflowtemperaturestressonPODactivityofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus3 hdedcbacd30 minCAT 活性CAT activity/(Umg1min1)05001 0001 500bbbbaabb1 hbcdabcdbcdbcd2545010 15 2005001 0001 5002545010 15 2005001 0001 5002545010 15 20温度 Temperature/图8低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫 CAT 活性的影响Fig.8EffectsoflowtemperaturestressonCATactivityofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus第4期刘佳奇等：松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制79西藏飞蝗（Locusta migratoria）45等昆虫耐寒性的研究中发现，越冬幼虫均通过消耗脂肪和糖原的方式越冬，松墨天牛 4 龄幼虫冷驯化（4）7d 后脂肪含量有所下降31。西藏飞蝗45和玉树蝠蛾（Hepialusyushuensis）幼虫46在低温胁迫一段时间后，山梨醇含量有所上升。在本研究中，松墨天牛 4 龄越冬幼虫含水率在 30min 和 1h 处理下随温度降低而降低，处理时间为 3h 时，其含水率呈上升趋势。由此可以推测，松墨天牛 4 龄幼虫在开始受到低温胁迫时通过降低含水率防止结冰，当胁迫时间超过 3h后，含水率随温度降低而上升。松墨天牛 4 龄越冬幼虫在不同暴露时间下，脂肪含量均有所降低，且在20 处理 30min 后较对照组显著下降（P0.05），0 处理 3h 后较对照组显著下降（P0.05）。说明松墨天牛 4 龄越冬幼虫会通过降低脂肪含量的方式应对低温胁迫。糖原含量在 30min 和 1h 处理后均有所上升，且在5 处理 1h 后较对照组显著上升（P0.05），在处理 3h 后下降，说明松墨天牛 4 龄bMcmPmIn 50 mdVa PmIn50 m50 mfa100 mc100 me100 mIna、b 为对照组；c、d 为15 处理 3h；e、f 为20 处理 3h。Mcm.中肠环肌；Pm.围食膜；Va.空泡；In.肠腔。aandb,controlgroup;candd,treatingat15for3h;eandf,treatingat20for3h.Mcm,midgutcirclemuscle;Pm,peritrophic;Va,vacuole;In,intestinal.图9低温胁迫对松墨天牛 4 龄越冬幼虫中肠组织的影响Fig.9Effectsoflowtemperaturestressonmidguttissueofthe4-agewinteringlarvaeofM.alternatus80北京林业大学学报第46卷越冬幼虫在受到低温胁迫会产生糖原，在胁迫 3h后消耗糖原。山梨醇含量在 0 下处理 30min 和5 下处理 1h 后均显著上升（P0.05），在10处理 30min，20 处理 1h 后均显著下降，可以推测松墨天牛 4 龄越冬幼虫在 0 和5 胁迫会大量累积山梨醇，当温度下降至10 和20 就会逐渐消耗。抗氧化系统是清除活性氧以防止其造成后续损伤的关键47。本研究重点探讨了抗氧化酶 SOD、CAT 和 POD 活性在其受到低温胁迫处理后的活性变化，以证明这 3 种抗氧化酶在松墨天牛 4 龄越冬幼虫在寒冷胁迫中起的重要作用。有研究表明，茶淡黄刺蛾（Darna trima）在5 低温胁迫 2h 后，SOD、POD 和 CAT 活性均显著上升，后随时间增加又逐渐降低48；琥珀蚕（Antheraea assamensis）SOD和 CAT 活性在 4 处理 3h 后上升至最高，后随时间增加呈下降趋势49，均可说明抗氧化酶活性在受到短时低温胁迫时显著上升，随着胁迫时间增加又逐渐下降。在本研究中，松墨天牛 4 龄越冬幼虫在受到低温胁迫后，其 SOD 活性在5、10、15 和20 处理下，随处理时间增加而下降，在同一处理时长下，其活性随温度下降而有所上升，且 SOD 活性在低温胁迫后均较对照组有所上升，在20 胁迫处理 3h 后显著上升（P0.05），这一结果说明松墨天牛 4 龄越冬幼虫 SOD 活性在短时（3h 以内）低温胁迫下较对照组有所上升，与上述研究结果一致。POD 活性在10 和15 胁迫下处理 3h 后较对照组显著上升（P0.05），在20 胁迫下，处理30min、1h 和 3h 时均较对照组显著上升（P0.05）。这一结果说明松墨天牛 4 龄越冬幼虫 POD 活性在低温胁迫初始阶段（低温胁迫 4 到15 且处理时间为 30min 和 1h）变化不大，当温度降至20，或在10 和15 处理时间达到 3h 时，才显著上升。CAT 活性在10 胁迫处理 30min 和15胁迫处理 1h 后均较对照组显著上升（P0.05），处理 3h 时，在10、15 和20 胁迫下均较对照组显著上升（PPODSOD。通过对松墨天牛越冬幼虫中肠组织的石蜡切片病理观察发现，在低温胁迫处理后中肠组织结构已完全破坏，完全丧失功能。参 考 文 献 杨宝君,潘宏阳,汤坚,等.松材线虫病 M.北京:中国林业出版社,2003:48.YangBJ,PanHY,TangJ,etal.Bursaphelenchus xylophilusM.Beijing:ChinaForestryPublishingHouse,2003:48.1张执中,田恒燕,黄旭昌,等.森林昆虫学 M.北京:农业出版社,1959:324.ZhangZZ,TianHY,HuangXC,etal.ForestentomologyM.Beijing:AgriculturalPress,1959:324.2华立中.中国天牛科昆虫名录 M.广州:中山大学出版社,1982:96.Hua L Z.The checklist of cerambycidae in ChinaM.Guangzhou:SunYat-SenUniversityPress,1982:96.3王志明,皮忠庆,候彬.吉林省发现松墨天牛J.中国森林病虫,2006,25(3):35.WangZM,PiZQ,HouB.DiscoveryofMonochamus alternatusinJilinProvinceJ.ForestPestandDisease,2006,25(3):35.4姜生伟,吴昊,李德斌,等.我国东北地区松材线虫灾害特征分析J.中国森林病虫,2022,41(4):915.Jiang S W,Wu H,Li D B,et al.Analysis on disastercharacteristics of pine wood nematode in Northeast ChinaJ.ForestPestandDisease,2022,41(4):915.5第4期刘佳奇等：松墨天牛 4 龄越冬幼虫响应低温胁迫的生理适应机制81OvergaardJ,GerberL,AndersenMK.Osmoregulatorycapacityatlowtemperatur