糜子GRF转录因子全基因组鉴定及在茎分生组织中的表达特征.pdf
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1、Hereditas(Beijing)2024 年 3 月,46(3):242255 收稿日期:20230801;修回日期:20240110;网络发布日期:20240126 基金项目:第二次青藏高原综合科学考察研究项目(编号:2019QZKK0303),甘肃省科技计划项目(编号:22CX8NA028)和国家现代农业产业技术体系项目(编号:CARS-06-14.5-A8)资助Supported by the Second Tibetan Plateau Scientific Expedition and Research Program(No.2019QZKK0303),the Science a
2、nd Technology Planning Project of Gansu Province(No.22CX8NA028)and the China Modern Agricultural Industrial Technology System Project(No.CARS-06-14.5-A8)作者简介:韦恒,硕士研究生,专业方向:小杂粮遗传育种。E-mail: 通讯作者:杨天育,硕士,研究员,研究方向:小杂粮遗传育种与栽培。E-mail: DOI:10.16288/j.yczz.23-210 研究报告糜子 GRF 转录因子全基因组鉴定及在茎分生组织中的表达特征 韦恒1,刘天鹏2,何
3、继红2,董孔军2,任瑞玉2,张磊2,李亚伟2,郝子义1,杨天育1,2 1.甘肃农业大学生命科学技术学院,兰州 730070 2.甘肃省农业科学院作物研究所,兰州 730070 摘要:为了解糜子(Panicum miliaceum L.)GRF(growth-regulating factor)基因家族成员全基因组信息及其在营养生长阶段分生组织中的表达特征,本研究通过生物信息学和转录组测序相结合的方法,分析了糜子 GRF 基因家族成员的染色体分布、基因结构、系统进化关系、顺式作用元件及其在营养器官茎分生组织中的表达特征。结果表明:糜子 GRF 基因家族包含 21 个成员,家族成员含有 14 个内
4、含子和 25 个外显子,编码蛋白长度为224618 个氨基酸,等电点为 4.939.69;PmGRF 基因不均等分布于 12 条染色体上,除 PmGRF13 定位于细胞核和叶绿体外,其余均定位于细胞核。系统进化分析显示,糜子 21 个 GRF 基因分为 4 个亚族(A、B、C 和 D)。顺式作用元件分析表明,在糜子 GRF 基因上游 2000 bp 序列中,普遍存在数目不等、种类不同的参与光响应、激素响应、干旱诱导、低温和其他环境胁迫响应的顺式作用元件。对糜子高秆品种陇糜 12 号和矮秆品种张 778拔节期节间和节部分生组织分别取样进行转录组测序及 qRT-PCR 分析,结果发现:PmGRF3
5、、PmGRF12 在矮秆品种张 778 中表达量显著高于高秆品种陇糜 12 号,而 PmGRF4、PmGRF16 和 PmGRF21 的表达特征与之相反;PmGRF2 和 PmGRF5 在张 778 节间分生组织中的表达量显著高于陇糜 12 号,其余 GRF 基因不表达或差异表达不显著,表明 PmGRF2、PmGRF3、PmGRF4、PmGRF5、PmGRF12、PmGRF16 和 PmGRF21 等 7 个基因与糜子株高的形成相关。关键词:糜子;GRF 基因;转录组;株高 第3期 韦恒等:糜子 GRF 转录因子全基因组鉴定及在茎分生组织中的表达特征 243 Genome-wide ident
6、ification of GRF transcription factors and their expression profile in stem meristem of broomcorn millet(Panicum miliaceum L.)Heng Wei1,Tianpeng Liu2,Jihong He2,Kongjun Dong2,Ruiyu Ren2,Lei Zhang2,Yawei Li2,Ziyi Hao1,Tianyu Yang1,2 1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural Universi
7、ty,Lanzhou 730070,China 2.Crop Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China Abstract:To understand the genome-wide information of the GRF family genes in broomcorn millet and their expression profile in the vegetative meristems,bioinformatic methods and transcriptom
8、e sequencing were used to analyze the characteristics,physical and chemical properties,phylogenetic relationship,chromosome distribution,gene structure,cis-acting elements and expression profile in stem meristem for the GRF family members.The results showed that the GRF gene family of millet contain
9、s 21 members,and the PmGRF gene is unevenly distributed on 12 chromosomes.The lengths of PmGRF proteins vary from 224 to 618 amino acids,and the isoelectric points are between 4.93-9.69.Each member of the family has 1-4 introns and 2-5 exons.The protein PmGRF13 is localized in both the nucleus and c
10、hloroplast,and the rest PmGRF proteins are located in the nucleus.Phylogenetic analysis showed that the 21 GRF genes were divided into 4 subfamilies(A,B,C and D)in broomcorn millet.The analysis of cis-acting elements showed that there were many cis-acting elements involved in light response,hormone
11、response,drought induction,low temperature response and other environmental stress responses in the 2000 bp sequence upstream of the GRF genes.Transcriptome sequencing and qRT-PCR analyses showed that the expression levels of PmGRF3 and PmGRF12 in the dwarf variety Zhang778 were significantly higher
12、 than those of the tall variety Longmi12 in the internode and node meristems at the jointing stage,while the expression patterns of PmGRF4,PmGRF16 and PmGRF21 were reverse.In addition,the expression levels of PmGRF2 and PmGRF5 in the internode of Zhang778 were significantly higher than Longmi12.The
13、other GRF genes were not or insignificantly expressed.These results indicated that seven genes,PmGRF2,PmGRF3,PmGRF4,PmGRF5,PmGRF12,PmGRF16 and PmGRF21,were related to the formation of plant height in broomcorn millet.Keywords:Panicum miliaceum L.;GRF genes;transcriptome;plant height 植物转录因子(transcrip
14、tion factors,TFs)是一种能识别并结合转录起始位点的上游启动子序列,可以特异地与相应 DNA 顺式作用元件结合并调控相关基因表达。转录因子家族基因结构复杂,既有单个家族基因,也有多个家族基因的参与1,2,对靶基因的调节作用可发生在植物生长发育的各个阶段。生长调节因子(growth-regulating factors,GRFs)广泛存在于植物基因组中,是一类重要的转录因子,参与调控植物生长和发育过程,对植物形态建成和适应环境具有重要调控作用。GRF 的 N-末端含有QLQ(Gln、Leu、Gln)和 WRC(Trp、Arg、Cys)两个保守结构域,构成 GRF 蛋白家族3,GRF
15、 蛋白的 C端区域在长度和氨基酸序列上存在差异,但仍具有与转录因子相似的共同特征4。QLQ 在所有真核生物中均有发现,具有介导蛋白-蛋白互作的功能,与GIF(GRF interacting factors)蛋白中的 SNH 结构域结合,促使 GRF 与 GIF 相互作用形成转录激活因子5,miR396 可调节 GRFs 及 GIFs 基因的表达。WRC 是 244 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 植物特有的一个功能域,包含一个功能性的核定位信号和用于 DNA 结合的 C3H 型锌指结构,可与下游基因的启动子区域相互作用从而调节其表达6。GRFs 作为植物中特有的转录
16、因子,参与调控植物生长发育过程。GRFs 对植物叶、根、茎、花、种子初级生长的影响,主要通过对细胞的增生或膨胀来实现7,8;此外,GRFs 在碳-氮代谢以及激素和非生物逆境应答中也起关键作用9。GRF 基因最初在水稻(Oryza sativa)中被鉴定,该基因对水稻茎节伸长起作用,经由赤霉素(gibberellin,GA)调控作用而增强表达10。迄今为止,对植物 GRF 全基因组的鉴定分析已有很多报道,其中在水稻中鉴定出 12 个GRF 成员11;拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现 9个 GRF 成员12,大多数 AtGRF 基因参与拟南芥的生长发育,例如 AtGRF1
17、和 AtGRF2 的过表达会导致叶片和子叶增大,表明 AtGRF 蛋白参与调控叶片及子叶的细胞扩增13。在玉米(Zea mays L.)中发现 21个 GRF 成员14,GRF 基因对穗的生长和发育起关键作 用15,其 中 ZmGRF11-ZmGIF2 和 ZmGRF2-ZmGIF3 的过表达推迟茎秆发育,但加速花序的生长。大豆(Glycine max)中有 22 个 GRF 成员,多数基因在其生长发育过程中表达丰度较高,遮光处理后大豆叶片 GmGRFs 大多表达下调,其中 GmGRF17 在茎尖 分 生 组 织 中 表 达 量 最 高16。烟 草(Nicotiana tabacum L.)中
18、有 25 个 GRF 成员,其中大部分NtabGRF主 要 在 萌 发 种 子 中 转 录 表 达,而NtabGRF13,14 在茎组织中的表达量最高17。另外,在柳枝稷(Panicum virgatum L.)18、甜瓜(Cucumis melo L.)19、桃Prunus persica(L.)Batsch.20、野草 莓(Fragaria vesca L.)21和 地 菍(Melastoma dodecandrum Lour.)22等植物生长发育过程中,GRF基因均普遍表达,并且在多个生物过程中起着重要作用。糜子(Panicum miliaceum L.)是禾本科黍属一年生草本作物,起源
19、于我国黄河流域,是种植历史悠久的谷类作物之一23。与其他大多数谷物比较,糜子耐盐、耐高温、抗旱、水分利用效率高,是一种拥有广谱抗性及抵抗非生物胁迫较强的作物24;而且糜子生育期短,种植成本低,因此在我国北方旱作农业中占有重要地位25。倒伏是糜子生产中普遍存在的现象,严重影响其产量形成和籽粒品质,因此挖掘其矮秆基因、创制矮化种质、培育矮秆品种十分必要。植物茎杆的生长发育与 GRF 基因的表达密切相关,但目前在糜子中尚未见报道,仅有SAMS26、MYB27、YABBY28、bZIP29和 NAC30等基因家族被鉴定与分析。本文采用生物信息学方法并结合转录组测序分析,对糜子 GRF 基因家族进行了系
20、统鉴定和茎分生组织表达特征分析,旨在为深入研究GRF基因家族在糜子株高形态建成中的功能和分子机制提供科学依据。1 材料与方法 1.1 数据来源 以拟南芥及水稻 GRF 基因为参考,拟南芥蛋白数据来自 tair 网站(https:/www.arabidopsis.org/),水稻蛋白数据来自 RGAP 网站(http:/rice.plantbiology.msu.edu/),糜子全基因组基因注释数据来自国家基因组科学数据中心(BIG 搜索-)。1.2 糜子 GRF 基因家族鉴定 首先通过糜子、水稻、拟南芥全基因组序列构建蛋白序列文库,然后以拟南芥 9 个 GRF 蛋白(AT2G45480、AT4
21、G24150、AT5G53660、AT2G22840、AT4G37740、AT3G52910、AT2G36400、AT2G06200和 AT3G13960)和水稻 12 个 GRF 蛋白(OSGRF1、OSGRF2、OSGRF3、OSGRF4、OSGRF5、OSGRF6、OSGRF7、OSGRF8、OSGRF9、OSGRF10、OSGRF11和 OSGRF12)为基础序列,在构建的蛋白序列文库中进行本地 Blast 搜索(E-value1e10),得到糜子GRF 基因家族候选基因的初筛结果;再利用 HMM模型对糜子 GRF 基因家族进行鉴定,利用 PFam 网站(http:/pfam.sang
22、er.ac.uk/)查询并下载 GRF 蛋白WRC(PF08879)与 QLQ(PF08880)两个特征结构域的隐马尔可夫模型,基于 HMMER 软件在糜子全基因组范围内鉴定 GRF 基因家族成员31;最后将两种方法 的 鉴 定 结 果 进 行 比 较 并 剔 除 重 复 项,利 用CD-Search工具(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov)对蛋白结构域进行验证并保留有效值,从而得到糜子 GRF 基因家族。最后,利用在线软件 ExpasyProtParam(https:/web.expasy.org/protparam/)对糜子 GRF 蛋白 第3期 韦恒等:糜子 GRF
23、转录因子全基因组鉴定及在茎分生组织中的表达特征 245 的疏水性、氨基酸数、分子量等理化性质进行分析,同时通过 PlantmPLoc 网站(http:/ GRF 基因家族成员的亚细胞定位。1.3 糜子 GRF 基因家族系统进化树的构建 利用 MAFFT 网站(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)将糜子、拟南芥、水稻蛋白序列进行多序列比对,将得到的数据采用 MEGA7.0 软件中的 NJ法绘制进化树,设 Bootstrap 值为 1000,处理缺失数据,选用 Partialdeletion、SiteCoverageCutoff(%)为 50,其余参数使用默
24、认值32,得到 GRF 基因家族系统进化树。1.4 糜子 GRF 基因家族染色体分布 根据鉴定出的 GRF 基因蛋白名称在 NCBI(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)中确定其各家族成员所在的染色体位置及染色体长度。根据糜子基因组 gff3 注释文件提取 GRF 基因的染色体位置;通过上述数据在 MG2C 网站(http:/mg2c.iask.in/mg2c_ v2.1/)上对糜子 GRF 基因家族成员的染色体分布进行分析。1.5 糜子 GRF 基因家族保守基序及基因结构分析 通过 MEME 在线服务器(https:/meme-suite.org/meme/to
25、ols/meme)对糜子 GRF 基因家族成员进行基序分析,预测基序数目设置为 15,将生成的文件通过 TBtools 软件进行可视化处理。另外依据鉴定出的糜子 GRF 基因序列在其 GFF3 文件中进行处理筛选,将结果通过在线软件 GSDS(http:/gsds.gao-lab.org/)完成基因结构分析,并利用 TBtools 软件进行可视化处理。1.6 糜子 GRF 基因家族顺式作用元件分析 通过软件 Tbtools 获取糜子 GRF 基因 CDS 序列上游 2000 bp 的启动子区域序列,将结果导入PlantCARE 数据库(http:/bioinformatics.psb.ugen
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