基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究.pdf
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1、 Chinese Journal of Wildlife 2024,45(2):367-377Chinese Journal of Wildlifehttp:/基于COI I基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究陈敏1,2,秦媛1,林业宏1,任思齐1,叶嘉政1,郑善坚1*(1.浙江师范大学,浙江省野生动物生物技术与保护利用重点实验室,金华,321004;2.浙江省永康市野生动植物保护管理站,永康,321300)摘 要为了解浙江省内不同黄缘闭壳龟(Cuora flavomarginata)群体的种质资源现状,基于线粒体DNA COI序列对来自浙江省内野外和养殖场的8个黄缘闭壳龟群体的遗传多样性和
2、遗传结构进行比较分析。结果表明:黄缘闭壳龟线粒体COI基因序列长度为1 040 bp,A=27.4%、T=30.5%、C=24.6%、G=17.5%,有较强的AT偏好性;共定义 9 个单倍型,单倍型多样性(Hd)为(0.799 000.210 00),核苷酸多样性(Pi)为 (0.002 090.001 47),呈“高Hd低Pi”遗传分布;不同黄缘闭壳龟群体间的遗传距离为00.003,群体内部的遗传距离为00.004,其中磐安后阁村(YS)群体内部的遗传距离最大,为0.004;单倍型系统发育树并未呈现明显的谱系结构;群体间遗传分化指数(FST)为-0.347 520.822 22,8 个群体的
3、遗传分化不显著(p0.05);中性检验(Tajima s D=-0.366 27,Fu s FS=-0.605)与核苷酸错配分布均表明,浙江省内黄缘闭壳龟群体并未经历种群扩张事件,同时,由Mantel检验可知,遗传距离与地理距离没有显著的相关性(R=0.293 8,p0.05);AMOVA分子方差结果显示,群体内的遗传变异高于群体间(85.06%14.94%)。研究表明,浙江省内黄缘闭壳龟群体之间为高单倍型多样性和低核苷酸多样性的遗传特征,并且存在一定水平的遗传分化,群体内存在明显的基因交流,根据COI基因分析显示,在磐安县获得的野生黄缘闭壳龟个体确定为黄缘闭壳龟浙江种,同时也发现存在浙江种与
4、安徽种的杂交种,建议将分化程度不同的黄缘闭壳龟群体划分为不同单元保护。研究结果为浙江省内黄缘闭壳龟种质资源开发利用和合理制定保护措施提供了基础依据。稿件运行过程收稿日期:2023-07-17修回日期:2023-08-14关键词:黄缘闭壳龟;COI;遗传多样性;遗传结构;浙江省Key words:Cuora flavomarginata;COI;Genetic diversity;Genetic structure;Zhejiang Province中图分类号:Q953文献标识码:A文章编号:2310-1490(2024)-02-0367-11DOI:10.12375/ysdwxb.202402
5、16基金项目:浙江省省级重点研发计划项目(2021C02044)第一作者简介:陈敏(1975),男,林业工程师;主要从事野生动物保护与管理工作。E-mail:*通信作者:郑善坚,E-mail:野 生 动 物 学 报第45卷Genetic Diversity Analysis of Cuora flavomarginata Based on COI I Genes in Zhejiang ProvinceCHEN Min1,2,QIN Yuan1,LIN Yehong1,REN Siqi1,YE Jiazheng1,ZHENG Shanjian1*(1.Key Laboratory of Wil
6、dlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province,Zhejiang Normal University,Jinhua,321004,China;2.Yongkang Wildlife Protection and Management Station,Zhejiang Province,Yongkang,321300,China)Abstract:In order to understand the present situation of germplasm resources of diffe
7、rent Cuora flavomarginata in Zhejiang Province,the genetic diversity and genetic structure of eight C.flavomarginata populations from wild and breeding farms in Zhejiang Province were compared based on mitochondrial DNA COI I sequence.The results showed that the sequence length of COI I gene of C.fl
8、avomarginata was 1,040 bp,and the average base content was A=27.4%、T=30.5%、C=24.6%、G=17.5%,with strong AT preference.Nine haplotypes were identified in the eight populations,and the haplotype diversity(Hd)was(0.799000.21000),and the nucleotide diversity(Pi)was(0.002090.00147),showing“high Hd and low
9、 Pi”genetic distribution.The genetic distance between different populations ranged from 0 to 0.003.The genetic distance within populations was between 0 and 0.004,among which the genetic distance within Pan an Houge Village(YS)population was the largest,which was 0.004.The haplotype phylogenetic tre
10、e did not show obvious pedigree structure.The genetic differentiation index(FST)interval was from-0.34752 to 0.82222,and the genetic differentiation was not significant(p0.05)in eight populations.Tajima s D and Fu s FS test values were either positive(Tajima s D=-0.36627,Fu s FS=-0.605),but statisti
11、cally insignificant.The distribution of nucleotide mismatches indicated that the population of the C.flavomarginata in Zhejiang Province did not experience a population expansion event.Mantel test showed that there was no significant correlation between genetic distance and geographical distance(R=0
12、.2938,p0.05).AMOVA analysis found that the genetic variation within populations was higher than that between populations(85.06%14.94%).The results showed that the populations of C.flavomarginata in Zhejiang Province are characterized by high haplotype diversity and low nucleic acid genetic diversity
13、,and there was a certain level of genetic differentiation,and there was obvious gene exchange among the populations.The wild C.flavomarginata obtained in Pan an County was identified as Zhejiang species according to COI I gene analysis.Moreover,it was also found that there were hybrids between Zheji
14、ang species and Anhui species.It is suggested that the C.flavomarginata populations with different degrees of differentiation should be divided into different units for protection.This study uses genetic diversity analysis to provide a basis for the development and utilization of C.flavomarginata ge
15、rmplasm resources in Zhejiang Province and the formulation of reasonable protection measures.黄缘闭壳龟(Cuora flavomarginata)别名夹板龟、克蛇龟、断板龟和黄缘盒龟,属地龟科(Geoemydidae)闭壳龟属(Cuora),是水陆两栖性龟类。野生黄缘闭壳龟主要分布于我国河南省和安徽省,此外,浙江省、湖南省和台湾地区等地也有野生黄缘闭壳龟的报道1。根据世界自然保护联盟(IUCN)记录,黄缘闭壳龟可分为台湾亚种(C.f.flavomarginata)、中国大陆南方亚种(C.f.sinen
16、sis)以及日本琉球亚种(C.f.evelynae)2。由于黄缘闭壳龟具有极高的食用、药用价值,驯化性好,长相独特,观赏价值高,其野生资源遭到严重破坏,已被IUCN列为濒危(EN)物种2,被 濒危野生动植物种国际贸易公约 附录收录3,被 中国生物多样性红色名录脊椎动物卷(2020)列为极危(CR)物种4,2016年被列入 浙江省重点保护陆生野生动物名录5。目前,关于黄缘闭壳龟的研究主要集中在人工养殖与繁殖67、形态与组织8、遗传多样性9及线粒体基因组1011等方面。荆胜利等12和郭旭升等13通过对黄缘闭壳龟保护遗传学等方面的分析,分别探究了大别山区人工驯养黄缘闭壳龟的遗传多样性和368陈敏等:
17、基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究第2期河南信阳黄缘闭壳龟保护区的种群现状,为黄缘闭壳龟后续的保护提供了基础。潘冬冬等14基于线粒体基因对安徽黄缘闭壳龟和台湾黄缘闭壳龟进行了研究,并对其在安徽省皖南山区、大别山区的野外生存情况进行了调查,结果发现黄缘闭壳龟的资源衰退,并存在种质混杂的情况。董传举等15对黄缘闭壳龟种群进行分类时,描述了其生物学特性,但关于浙江省内黄缘闭壳龟种质资源现状、遗传多样性研究却未见报道。因此,本研究利用线粒体COI基因序列对浙江省内不同黄缘闭壳龟群体进行遗传结构和遗传多样性分析,以期了解其种质资源情况,从而为浙江省内黄缘闭壳龟的合理利用、资源保护等研究提供
18、理论依据。1材料与方法1.1试验材料试验用黄缘闭壳龟取自义乌宏富农业开发有限公司、东阳金雕养龟基地、东阳巍山养殖场、湖州菱湖龟鳖场、永康后项养龟场和永康下贵养龟场6家养殖场的养殖群体以及杭州清凉峰国家级自然保护区、磐安后阁村野外个体,共44个样本(表1)。1.2试验方法1.2.1基因组DNA提取使用无菌拭子擦拭黄缘闭壳龟口部黏液,置于含有200 L 0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中保存。采用上海生工Ezup柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒提取基因组 DNA,使用 NanoDrop 2000分光光度计测定提取的DNA纯度和浓度,将合格样品于冰箱中-20 保存。1.2.2PC
19、R扩增及测序根据GenBank数据库中公布的黄缘闭壳龟线粒体 全 基 因 组 序 列(登 录 号:EU708434.1),采 用Primer Premier 5.0软件设计其线粒体COI序列特异性引物,送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。引物序列为 COI-F:5-AGCCATCTTACC-TGTGTTTT-3,COI-R:5-TTGCTCAAGTTTGGTGTA-GT-3。PCR 总反应体系为 25 L,其中 R Taq DNA Premix 10 L,基因组 DNA 1 L,上、下游引物各 1 L,ddH2O补足至25 L。PCR扩增程序为94 预变性5 min;94 变性30
20、s,56 退火45 s,72 延伸90 s,共5个循环;72 延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,送生工生物工程(上海)股份有限公司双向测序。1.2.3数据分析利用SeqMan软件参照序列峰图对所测黄缘闭壳龟COI序列进行人工校正和修饰16。使用MEGA 6.0软件进行多序列比对、碱基组成分析以及系统发育分析,采用邻接法(NJ)构建单倍型聚类树17,并计算群体间及单倍型间的遗传距离。使用DnaSP 6软件计算序列变异位点数,分析不同群体的单倍型数、群体单倍型多样性(Hd)以及核苷酸多样性(Pi)等遗传多样性指数18,绘制核苷酸不配对分布曲线。通过Tajiam s D检验和Fu
21、FS中性检验明确黄缘闭壳龟群体在历史上是否发生群体扩张。由 Arlequin 3.11软件计算群体遗传分化指数(FST),使用Mantel表1黄缘闭壳龟的采样信息Tab.1 Sampling information of Cuora flavomarginata编号ID12345678总计 Total代号CodeDY1DY2HZHUZYSYWYK1YK2采样点Sampling location东阳金雕东阳巍山杭州清凉峰湖州菱湖磐安后阁村义乌宏富永康后项永康下贵经纬度Longitude and latitude299 N,12013 E2919 N,12025 E3010 N,11912 E30
22、45 N,1205 E2857 N,12035 E2910 N,11959 E2851 N,1205 E2950 N,12011 E样本数量Sample size2586955444369野 生 动 物 学 报第45卷检验,自展重复1 000次,对黄缘闭壳龟群体的遗传距离与地理距离之间的相关性进行分析19,并基于分子方差分析(AMOVA)分析群体间的遗传变异20。采用 Network 5.0(Rohl 2003)软件基于中间连接法建立单倍型网络图21,以描述单倍型序列的系统发育关系以及地理关系。2结果2.1线粒体COI I基因序列的碱基组成及变异特征对测序后的序列进行比对,获得黄缘闭壳龟线粒体
23、COI基因序列的长度为1 040 bp,基因序列碱基A、T、C、G的平均含量分别为27.4%、30.5%、24.6%和17.5%,A+T的平均含量为57.9%,C+G的平均含量为42.1%,表现出AT偏倚性。在44只黄缘闭壳龟个体线粒体COI序列中,共检测到保守位点1 004个,多态性位点 13个,单一信息位点 4个,简约信息位点9个。2.2黄缘闭壳龟群体遗传多样性基于线粒体 COI基因序列共定义了 9 个单倍型,8 个黄缘闭壳龟群体的单倍型多样性(Hd)为(0.429 000.169 00)(1.000 000.500 00),核苷酸多样性为(0.000 420.000 16)(0.004
24、250.001 21)。其中,YS 群体的核苷酸多样性最高(0.004 250.001 21),DY1群体、HUZ群体和YW群体的单倍型多样性较高,分别为(1.000 000.500 00)、(1.000 000.096 00)和(1.000 000.126 00)(表2)。2.3黄缘闭壳龟群体间的遗传距离和遗传分化遗传距离分析可知,基于线粒体COI基因序列,两两群体间的遗传距离为00.003,其中YW、YS群体与其他群体间的遗传距离较远(0.0020.003)。8个群体内的遗传距离为 00.004,HZ和 YK2群体内遗传距离最小,YS 群体内遗传距离最大,达到0.004(表3)。FST分
25、析 结 果 显 示,两 两 群 体 间 的 FST值 在-0.347 520.822 22,DY1 与 YK2 之间的遗传分化指数最大,为 0.822 22;其次为 HUZ 群体与 YK2 群体,遗传分化指数为0.615 56,处于较高遗传分化水平。DY1 和 YK1 群体间的遗传分化指数最小,为-0.347 52,表明两个群体间的遗传分化较弱(表3)。同时,Mantel检验结果显示,浙江省内不同黄缘闭壳龟群体间的遗传距离与地理距离之间没有显著的相关性(R=0.293 8,p=0.134),表明黄缘闭壳龟种群的遗传分化受地理因素的影响不显著。利用分子方差分析和遗传分化系数对8个群体间的遗传变异
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