龙芽草总黄酮的闪式提取工艺优化及提取物的抑菌和抗炎活性研究.pdf

第4 5卷 第4期2 0 2 3年1 2月 延 边 大 学 农 学 学 报A g r i c u l t u r a lS c i e n c eJ o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y V o l.4 5 N o.4 D e c.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 3-0 9-1 1 基金项目:吉林省科技发展计划项目(2 0 2 1 0 1 0 1 2 3 1 J C);吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(J J KH 2 0 2 0 0 5 2 3 K J)作者简介:杨佳(1 9 9 9),女,北京人,硕士研究生,研究方向为天然物活性研究。通信作者:金英花(1 9 8 2),女(朝鲜族),吉林龙井人,副教授,博士,E-m a i l:y h u a j i n y b u.e d u.c n文章编号:1 0 0 4-7 9 9 9(2 0 2 3)0 4-0 0 1 6-1 0 D O I:1 0.1 3 4 7 8/j.c n k i.j a s y u.2 0 2 3.0 4.0 0 3龙芽草总黄酮的闪式提取工艺优化及提取物的抑菌和抗炎活性研究杨 佳1,金哲勇2,姜 君1,金英花1*(1.延边大学 农学院;2.延边大学 实验动物中心:吉林 延吉1 3 3 0 0 2)摘要:为优化龙芽草总黄酮闪式提取工艺,以龙芽草全株为试验材料,以总黄酮含量为指标,采用响应面法对提取时间、提取 液 料 比、提 取 溶 剂 浓 度 进 行 了 优 化,结 果 表 明:当 提 取 时 间 为4 1.0 9s,提 取 液 料 比 为4 0.1 91(m Lg),提取溶剂浓度为4 1.3 7%时,总黄酮含量最高,可达到9 4.2 5m g/g。为了将龙芽草提取物应用于产品生产中,对其提取物进行了抑菌及抗炎活性的研究。抑菌试验结果表明,龙芽草提取物对6种致病菌均表现出良好的抑菌活性,其中对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果最佳,最低抑菌浓度为4m g/m L。在抗炎试验中,建立了以脂多糖(L P S)诱导的小鼠单核巨噬细胞(R a w2 6 4.7)炎症模型,调查了提取物对NO、i NO S和C O X-2炎症指标的影响。结果表明:经过提取物处理后的L P S诱导的R a w2 6 4.7细胞的炎症指标呈剂量依赖性地下降。因此,该研究旨在为龙芽草进一步的开发和利用提供一定理论基础。关键词:龙芽草总黄酮;闪式提取法;抑菌活性;炎症因子中图分类号:R 2 8 4.1 文献标识码:A O p t i m i z a t i o no f f l a s he x t r a c t i o np r o c e s so fA g r i m o n i ap i l o s at o t a l f l a v o n o i d sa n da n t i b a c t e r i a l a n da n t i-i n f l a mm a t o r ya c t i v i t i e so f t h ee x t r a c tYANGj i a1,J I NY o n g z h e2,J I ANGJ u n1,J I NY i n g h u a1*(1.A g r i c u l t u r a l C o l l e g eo fY a n b i a nU n i v e r s i t y;2.E x p e r i m e n t a lA n i m a lC e n t e ro fY a n b i a nU n i v e r s i t y,Y a n j iJ i l i n1 3 3 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:T oo p t i m i z ea f l a s he x t r a c t i o np r o c e s so fA g r i m o n i ap i l o s at o t a l f l a v o n o i d s,t h ew h o l ep l a n t so fA.p i l o s aw e r eu s e da s t h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t o i n v e s t i g a t e t h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n so f f l a s he x t r a c-t i o nb yc o n t r o l l i n gt h ee x t r a c t t i m e,l i q u i dt om a t e r i a l r a t i o,a n ds o l v e n t(m e t h a n o l)c o n c e n t r a t i o n,u s i n gt h e t o t a l f l a v o n o i dc o n t e n t a s t h e e v a l u a t i o n i n d e x.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h eh i g h e s t t o t a l f l a v o n o i dc o n-t e n tr e a c h e d9 4.2 5m g/gw h e n t h e e x t r a c t i o n t i m ew a s 4 1.0 9s,t h e e x t r a c t l i q u i d t om a t e r i a l r a t i ow a s 4 0.1 91(m Lg),a n dt h ee x t r a c t i o ns o l v e n tc o n c e n t r a t i o nw a s4 1.3 7%.F u r t h e r m o r e,t h ea n t i b a c t e r i a la n da n t i-i n f l a mm a t o r ya c t i v i t i e sw e r e i n v e s t i g a t e dt ou s e t h ee x t r a c to fA.p i l o s af o r t h ea p p l i c a t i o n i nt h ep r o d u c t i o no fp r o d u c t s.T h er e s u l t so f t h ea n t i b a c t e r i a l e x p e r i m e n ts h o w e dt h a t t h ee x t r a c to b v i o u s l yi n-h i b i t e dt h eg r o w t ho f s i x t e s t e dp a t h o g e n i cb a c t e r i a,a m o n gw h i c h t h eh i g h e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yw a s o b-s e r v e da g a i n s tB a c i l l u s c e r e u s,w i t ht h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no f4m g/m L.I nt h ea n t i-i n-第4期杨佳,等:龙芽草总黄酮的闪式提取工艺优化及提取物的抑菌和抗炎活性研究f l a mm a t o r ye x p e r i m e n t,a l i p o p o l y s a c c h a r i d e(L P S)-i n d u c e dm o u s em o n o c y t e-m a c r o p h a g e(R a w2 6 4.7)i n f l a mm a t i o nm o d e lw a s e s t a b l i s h e d,a n d t h e e f f e c t so f t h e e x t r a c t o n l e v e l so f i n f l a mm a t o r ym e d i a t o r s,i.e.,NO,i NO S,a n dC O X-2,w e r e i n v e s t i g a t e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t a f t e r t r e a t m e n tw i t ht h e e x t r a c t,t h eL P S-i n d u c e di n f l a mm a t o r ym e d i a t o r s i nR a w2 6 4.7c e l l sd e c r e a s e di nad o s e-d e p e n d e n tm a n n e r.T h ef i n d i n g so f t h i ss t u d yp r o v i d e dt h e o r e t i c a lb a s i s f o r t h e f u r t h e rd e v e l o p m e n t a n du s eo fA.P i l o s a.K e y w o r d s:T o t a l f l a v o n o i d so fA g r i m o n i ap i l o s a;f l a s he x t r a c t i o n;b a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t y;i n f l a mm a t o r yf a c t o r s 龙芽草(A g r i m o n i ap i l o s aL d b.)在民间亦被称为仙鹤草、脱力草和狼牙草,是蔷薇科多年生草本植物,在我国的传统医学中被尊为一味珍贵的中草药1。龙芽草中主要含有黄酮类、三萜类、鞣质类等活性成分,并含有钾、镁、铁、硫、磷等微量元素2。目前,龙芽草已被广泛应用于各种疾病的缓解与治疗中,如肿瘤、梅尼埃病、滴虫性阴道炎、咳血、腹泻等疾病3-4。近年来,关于龙芽草的研究主要集中在其活性成分及其在抗肿瘤和降血糖方面的药理作用。有文章报道,龙芽草富含丰富的黄酮类化合物5。研究发现,植物中的黄酮具有广泛的药理作用,其抑菌效果覆盖了多种细菌和真菌6-8。此外,黄酮类化合物通过调控炎症等相关信号通路展现出卓越的抗炎活性9。然而,尽管龙芽草在治疗疾病上的效果备受推崇,但其具体的活性成分与作用机制尚未得到深入的研究和解读,特定单一化合物的药理研究也相对有限。传统的黄酮提取方法存在诸多限制,如酶解提取法提取化合物的过程中可能会破坏化合物的某些结构,从而影响到提取的最终结果1 0。而闪式提取法采用特殊的高速动态分子渗透与强烈振动原理来迅速破解植物细胞组织,这种方法确保了细胞内的有效成分能与提取溶剂充分作用,并使目标产物被迅速提取,其优势在于提取时间短、效率高,并能有效保证所提取的目标产物的结构完整度及生物活性1 1。该研究采用了响应面法对龙芽草中的总黄酮提取工艺进行了优化,并进一步探索了其生物活性。该研究可为龙芽草在临床治疗上的应用以及未来的新药开发提供有力的理论支持,具有广阔的应用前景。1 材料与方法1.1 植物材料龙芽草采自吉林省和龙头道镇,由延边大学金英花老师鉴定并提供,将其茎、叶、花穗烘干后进行试验。1.2 试验菌株金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s,C G-MC C 1.2 8 2),购自中国微生物菌种保藏中心;沙门氏菌(S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s,C GMC C 1.7 5 5),购自中国微生物菌种保藏中心;铜绿假单胞菌(P s e u d o-m o n a s a e r u g i n o s a,C GMC C 1.5 9 6),购自中国微生物菌 种 保 藏 中 心;李 斯 特 菌(L i s t e r i a m o n o c y t o-g e n e s,C GMC C 1.7 7 3 0),购自中国微生物菌种保藏中 心;大 肠 杆 菌(E s c h e r i c h i ac o l i,C GMC C 1.8 7 4 5),购自中国微生物菌种保藏中心;蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u s c e r e u s,C GMC C 1.9 1 1),购自中国微生物菌种保藏中心。1.3 试剂与仪器二甲基亚砜(DM S O)(天津市科密欧化学试剂有限公司,天津,中国)、脂多糖(L P S)(L 8 2 7 4)(S i g-m a-A l d r i c h,Am e r i c a)、噻 唑 蓝(MT T)(S i g m a-A l d r i c h,Am e r i c a)、DMEM(T h e r m oF i s h e r,Am e r-i c a)、胎牛血清(F B S)(T h e r m oF i s h e r,Am e r i c a)、2,3,5三苯基氯化四氮唑(T T C)(北京索莱宝科技有 限 公 司,北 京,中 国)、B C A p r o t e i na s s a yk i t(T h e r m o,Am e r i c a)、A n t i-i NO S(A B N 2 6)(M i l l i-p o r e,Am e r i c a)、C O X-2(S C-1 7 4 6)(T h e r m o,Am e r-i c a)、-a c t i n(S C-1 6 1 6)(T h e r m o,Am e r i c a)、二氧化碳培养箱(T h e r m o,Am e r i c a)、酶标仪(上海精密科学仪器有限公司,上海,中国)、电导率仪(上海精密仪器有限公司,上海,中国)、旋转蒸发器(北京博医康试验仪器有限公司,北京,中国)、恒温培养箱(上海昕仪仪器仪表有限公司,上海,中国)、闪式提取器(上海钒帜精密设备有限公司,上海,中国)、W e s t-e r nB l o t电泳仪(B i o-R a d,Am e r i c a)、超净工作台(苏州苏洁净化设备公司,江苏,中国)、荧光显微镜(O L YMP U S,J a p a n)、高 速 冷 冻 离 心 机(S I GMA,G e r m a n y)。71延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 1.4 方法1.4.1 龙芽草总黄酮闪式提取工艺的优化研究1)单因素试验 提取时间的选择:取龙芽草粉末1 0g,分别按照液料比3 01(m Lg),加入7 0%甲醇溶剂于闪式提取器内,分别设定提取时间为3 0、4 0、5 0、6 0、7 0s。提取溶剂浓度的选择:取龙芽草粉末1 0g,分别按液料比3 01(m Lg),分别加入3 0%、4 0%、5 0%、6 0%、7 0%的甲醇溶剂进行提取,提取时间设定为之前所选择的最佳时间。提取液料比的选择:取龙芽草粉末1 0g,分别按照提取 液 料 比1 01、2 01、3 01、4 01、5 01(m Lg)进行提取,提取时间与提取溶剂浓度均设置为之前所选择的最佳提取条件。2)响应面优化在单因素试验的基础上,以提取时间、提取溶剂浓度、提取液料比为响应值,采用3因素3水 平 响 应 面 分 析 法,通 过D e s i g n-E x p e r t.8.0 6分析软件对龙芽草总黄酮提取工艺进行优化,因素与水平设计见表1。表1 响应面分析法的因素与水平T a b l e1 F a c t o r s a n d l e v e l su s e d i nr e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y因素水平-101X1提取时间/s3 04 05 0X2提取溶剂浓度/%3 04 05 0X3提取液料比/(m Lg-1)3 04 05 0 3)总黄酮含量的测定参考S i q u nJ1 2的方法,并稍加改动,以芦丁作为标准品,利用硝酸铝-氢氧化钠比色法测定提取物总黄酮的含量。1.4.2 龙芽草提取物(A P L E)抑菌活性研究1)最低抑菌浓度采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(T T C)法测定A P L E对金黄色葡萄球菌等的M I C1 3:在9 6孔板加入菌悬液,以DM S O作对照。每孔加入T T C溶液,通过观察是否有红色产生来确定不同菌种的最低抑菌浓度。2)菌生长测定参考李丽等1 4的方法进行微生物生长曲线的绘制:取菌悬液加入锥形瓶中,处理组锥形瓶中分别加入浓度为M I C的A P L E,对照组加入等量培养液。每隔0.5h吸取1次菌悬液至比色皿中,用分光光度计在波长6 0 0n m处测定其吸光值,绘制生长曲线。3)电导率测定取5 0 m L浓度为11 08C F U/m L的菌悬液于锥形瓶中。处理组锥形瓶中分别加入浓度为M I C的A P L E,对照组加入等量培养液。使用电导仪每隔0.5h测定菌悬液的E C值。1.4.3 A P L E抗炎活性研究1)细胞毒性检测R a w2 6 4.7细胞接种于9 6孔板后加入不同浓度的A P L E,对照组加入细胞培养基(不含F B S的DMEM)。孵育2 4h后弃去培养液,加入MT T于恒温培养箱孵育2h后,弃去培养液,加入1 5 0L的DM S O,混匀,用酶标仪测量波长5 5 0n m处的O D值,计算细胞活性。2)NO的测定将R a w 2 6 4.7细 胞 以2.51 05c e l l s/孔/3 0 0L的密度接种于孔板中。空白组(不含F B S的DMEM)与L P S组分别加入DMEM每孔3 0 0L,试验组加入不同浓度的A P L E(2 5、5 0、1 0 0g/m L)处理细胞1h后,除 空 白 组 外 加 入6L的L P S(1 0 0n g/m L)处理,3 7培养2 4h后收集细胞上清液。使用NO标准品工作液(NOS t a n d)制作标准曲线。在9 6孔 板 中 每 孔 加 入5 0L上 清 液 和G r i e s s试剂(按11比例),使用酶标仪在波长为5 5 0n m处测定O D值,根据标准品O D值制作标准曲线,计算NO含量。3)i NO S和C O X-2测定样品前处理:将R a w2 6 4.7细胞铺于6孔板中经L P S和A P L E处理后,用提前预冷的P B S清洗细胞2次,每孔加入1 1 0L的R I P A对细胞进行裂解,裂解3 0m i n,用细胞铲将全部细胞刮下并收集于1.5m L离心 管 中(冰 上 操 作),4,1 20 0 0r/m i n离 心1 5m i n,收集上清液,于-2 0冰箱保存,上清液为即总蛋白。采用蛋白质定量法(B C A)进行蛋白质定量,确保免疫蛋白印迹中上样量的准确性。将收集的总蛋白与蛋白缓冲液41混匀,使蛋白变性(1 0 0沸水煮5m i n),立即将变性后的总蛋白液置于冰上冷却。首先进行检查装置的气密性,在玻璃板间隙加入已配置完成的1 0%分离胶,加入甲醇使下分层胶的气泡消失,等待1 5m i n后弃去甲醇。随后灌注已配置好的5%浓缩胶,立即插入梳子(1 0孔),待其凝固后拔出梳子。组装电泳仪装置,加样,加入1电泳缓冲液,M a r k e r、总蛋白液。其中电泳条件为恒压1 2 0V,9 0m i n。电泳结束后,81 第4期杨佳,等:龙芽草总黄酮的闪式提取工艺优化及提取物的抑菌和抗炎活性研究将P V D F膜甲醇中浸泡3 0s,激活P V D F膜,再按照正极海绵滤纸P V D F膜胶滤纸海绵-负极的顺序组装,进行转膜(3 0V,6 0 0m i n)。转膜结束后,根据蛋白分子量标记并裁剪,用T B S-T清洗P V D F膜3次,每次1 0m i n,使用1 0%脱脂牛 奶 封 闭9 0 m i n后,4 孵 育 稀 释 过 一 抗(110 0 0)2 4 h后,回 收 一 抗,加 入 二 抗(150 0 0),室温孵育9 0m i n。加入配置的E C L化学显影剂,使用凝胶成像仪将其进行曝光成像。使用I m a g e-J处理图像并分析其蛋白的相对表达量。1.5 数据分析每个试验组均设置3次重复,使用S P S S2 5.0统计软件和G r a p h P a dP r i s m9软件分析所有数据,通过D u n c a n多重检验来进行方差分析,P 0.0 5被认为具有统计学意义2 结果与分析2.1 A P L E提取工艺研究2.1.1 单因素试验该研究利用闪式提取法对龙芽草进行提取,以总黄酮含量为评价指标。试验结果表明,最佳提取时间 为4 0s(图1)。最 佳 提 取 液 料 比 为4 01(m Lg)(图2),提取溶剂浓度为4 0%时,总黄酮含量最高(图3)。图1 提取时间对总黄酮含量的影响F i g.1 E f f e c t o f e x t r a c t i o nt i m eo nt o t a l f l a v o n o i dc o n t e n t图2 提取液料比对总黄酮含量的影响F i g.2 E f f e c t o f l i q u i dt om a t e r i a lr a t i oo nt o t a l f l a v o n o i dc o n t e n t图3 提取溶剂浓度对总黄酮含量的影响F i g.3 E f f e c t o f s o l v e n t c o n c e n t r a t i o no nt o t a l f l a v o n o i dc o n t e n t2.1.2 响应面试验使用D e s i g n-E x p e r t8.0.6.1软件对表2进行回归拟合分析,可得到二次多项式方式回归模型为:R1=9 3.7 4 33 6+0.3 8 97 7A+3.4 1 91 2B+2.5 6 59 5C+0.0 0 71 4A B-0.0 1 34 0A C-0.6 4 51B C-1 0.5 4 28 5A2-1 2.2 5 19 5B2-1 1.3 2 29 0C2.式中,R1为总黄酮含量(m g/g);A为提取液料比,B为提取溶剂浓度,C为提取时间。91延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 表2 响应面试验设计与结果T a b l e2 D e s i g na n dr e s u l t so f r e s p o n s e s u r f a c e e x p e r i m e n t样品序号A提取液料比/(m Lg)B提取溶剂浓度/%C提取时间/sR1总黄酮含量/(m gg-1)24 014 04 09 3.9 033 013 04 06 6.8 044 014 04 09 4.8 654 015 05 07 4.4 163 015 04 07 4.9 274 013 03 06 4.6 484 014 04 09 3.3 095 013 04 06 6.9 61 05 014 03 06 9.5 71 13 014 05 07 4.2 21 25 014 05 07 5.5 81 35 015 04 07 5.1 11 44 014 04 09 4.3 31 54 014 04 09 2.3 31 63 014 03 06 8.1 51 74 015 05 07 0.1 6 由回归模型进行方差分析结果可知,该模型回归显著(P0.0 1),失拟项(P=0.2 5 53)不显著,表明自变量与响应值之间的模型关系显著,说明回归方程与实际情况拟合良好,可以用此模型来分析和预测提取结果(表3)。表3 回归模型显著性与方差分析T a b l e3 A n a l y s i so f v i s i b i l i t ya n dv a r i a n c eo f r e g r e s s i o nm o d e l方差来源平方和自由度均方FPM o d e l19 8 0.8 592 2 0.0 91 6 1.5 90.0 0 01A1.2 211.2 20.8 9 230.3 7 63B9 3.5 219 3.5 26 8.6 60.0 0 01C5 2.6 715 2.6 73 8.6 70.0 0 04A B0.0 0 0210.0 0 020.0 0 010.9 9 06A C0.0 0 0710.0 0 070.0 0 050.9 8 23B C1.6 611.6 61.2 20.3 0 55A24 6 8.0 114 6 8.0 13 4 3.6 00.0 0 01B26 3 2.0 416 3 2.0 44 6 4.0 30.0 0 01C25 3 9.8 215 3 9.8 23 9 6.3 30.0 0 01残差9.5 371.3 6失拟项5.7 331.9 12.0 10.2 5 53纯误差3.8 040.9 5 12总和19 9 0.3 81 6 注:A为提取液料比、B为提取溶剂浓度、C为提取时间。*表示极显著差异,P0.0 0 1;*表示显著差异,P0.0 1。由软件分析得到二维等高线图及三维响应曲面(图4-6),通过等高线和响应面图直观地反应了提取液料比、提取溶剂浓度和提取时间之间的相互作用对龙芽草提取物总黄酮含量的影响。响应面的最02 第4期杨佳,等:龙芽草总黄酮的闪式提取工艺优化及提取物的抑菌和抗炎活性研究高点所对应的影响因素数值可以看作提取龙芽草提取物总黄酮的最佳提取条件;结果显示,通过B o x-B e h n k e n试验设计法得到了与实际情况相符合的回归模型。如表3的方差分析结果所示,提取溶剂浓度对提取物总黄酮含量的影响最大,其次是提取时间,提取液料比对提取物总黄酮含量的影响最小。提取液料比、提取溶剂浓度、提取时间每2个因素之间(A B、A C、B C)均无显著性交互作用。图4 提取溶剂浓度和提取液料比交互作用的响应面和等高线图F i g.4 R e s p o n s e s u r f a c ea n dc o n t o u rp l o t so f t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e ns o l v e n t c o n c e n t r a t i o na n d l i q u i dt om a t e r i a l r a t i o图5 提取溶剂浓度和提取时间交互作用的响应面和等高线图F i g.5 R e s p o n s e s u r f a c ea n dc o n t o u rp l o t o f t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e ns o l v e n t c o n c e n t r a t i o na n de x t r a c t i o nt i m e图6 提取液料比和提取时间交互作用的响应面和等高线图F i g.6 R e s p o n s e s u r f a c ea n dc o n t o u rp l o t so f t h e i n t e r a c t i o no fm a t e r i a l-l i q u i dr a t i oa n de x t r a c t i o nt i m e12延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 利用D e s i g n-E x p e r t 8.0.6.1软件分析模型,发现龙芽草提取物总黄酮的最佳提取条件为:A提取液料比为4 0.1 91(m Lg),B提取溶剂浓度为4 1.3 7%,C提取时间为4 1.0 9s。此时龙芽草提取物总黄酮含量最大,为9 5.1 2m g/g。进行3次独立重复试验,对此结果进行验证,测得平均提取物总黄酮含量为(9 4.2 50.0 0 5)m g/g,试验值与理论值误差较小,所以采用响应面分析法优化得到的提取条件参数准确可靠,具有较实用的价值。2.2 抑菌活性A P L E对6种试验菌的最低抑菌浓度(M I C)如表4所示。在0.56 4m g/m L浓度范围内,A P L E对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、李斯特菌的M I C值均为3 2 m g/m L,沙门氏菌的M I C值 为1 6 m g/m L,蜡 样 芽 孢 杆 菌 的M I C值 为4m g/m L,说明提取物对蜡样芽孢杆菌的抑菌作用最强,其次是沙门氏菌。因此,在进一步的试验中,对提取物处理后的蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌生长变化情况及电解质释放情况进行了调查。表4 A P L E的最低抑菌浓度T a b l e4 M i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no f e x t r a c t a g a i n s t s i xb a c t e r i a l s p e c i e sA P L E/(m gm L-1)E.c o l iS.a u r e u sP.a e r u g i n o s aB.c e r e u sS a l m o n e l l aL i s t e r i a0.5-1-2-4-+-8-+-1 6-+-3 2+6 4+A P L E对蜡样芽孢杆菌与沙门氏菌生长的影响由图7可知,A P L E对蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌生长有明显抑制作用,在培养初期(01h),对照组与A P L E处理组无显著差异。但在培养1h后,对照组的蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌进入对数生长期,O D6 0 0快速上升,但A P L E处理组的O D6 0 0上升速度缓慢,这表明A P L E处理后的蜡样芽孢杆菌与沙门氏菌生长受到了抑制。注:A为蜡样芽孢杆菌;B为沙门氏菌图7 A P L E对蜡样芽孢杆菌与沙门氏菌生长的影响F i g.7 E f f e c t o fA P L Eo ng r o w t ho fB a c i l l u s c e r e u sa n dS a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s22 第4期杨佳,等:龙芽草总黄酮的闪式提取工艺优化及提取物的抑菌和抗炎活性研究 菌悬液中电导率的大小与细胞膜的完整性呈正相关,当细菌细胞膜遭到破坏时,细胞膜通透性增加,引起胞内电解质外泄,使胞外电导率上升。由图8可见A P L E作用前后细菌培养基中电导率的变化。在培养过程当中,对照组培养液的电导率变化不明显,相较于对照组中蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌培养基中电导率,试验组培养基中的电导率显著高于对照组,且随时间变化逐渐上升,并且在5h的试验过程中未见变缓趋势。这说明龙芽草黄酮破坏了细胞膜的完整性,使胞内电解质渗出,进而导致菌体培养液的电导率升高,但样品对细胞膜的破坏不够彻底,进而导致细菌还在以一定速率增长或样品对细胞膜的破坏较慢导致其呈现逐渐上升趋势。注:A为蜡样芽孢杆菌;B为沙门氏菌图8 A P L E对细菌培养基电导率的影响F i g.8 E f f e c t o fA P L Eo nt h e e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t yo fb a c t e r i a lm e d i u m2.3 抗炎活性为筛选后续抗炎试验中的安全用药浓度,分别使用1.5 6、3.1 3、6.2 5、1 2.5、2 5、5 0、1 0 0、2 0 0、4 0 0g/m L的A P L E对R a w2 6 4.7细胞进行处理,2 4h后用MT T法检测 细 胞 活 力,如 图9所 示,A P L E浓度低于2 0 0g/m L时,对细胞活性没有影响,因此,采用2 5、5 0、1 0 0g/m L作为后续试验药物浓度。注:与空白组相比,*P0.0 0 1。图9 A P L E对R a w2 6 4.7细胞活性影响F i g.9 E f f e c t o fA P L Eo nt h ec e l l v i a b i l i t yo fR a w 2 6 4.7 为探究A P L E对L P S诱导的R a w 2 6 4.7的NO是否具有抑制释放的作用,使用不同浓度A P L E(2 5、5 0、1 0 0g/m L)处理细胞,结果如图1 0所示,经L P S(2 0 0n g/m L)刺激后,显著促 进了细胞中NO的释放量,而经过A P L E处理后细胞的NO释放量与未经处理的细胞相比,具有显著的抑制作用,且呈现一定的浓度依赖性。注:与空白组相比,*P0.0 0 01;与L P S组相比:#P0.0 0 1。图1 0 A P L E对N O释放量的影响F i g.1 0 E f f e c t o fA P L Eo nt h er e l e a s eo fN O32延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 使用W e s t e r nB l o t法检测i NO S、C O X-2的表达量。如图1 1(A)所示,经L P S处理后,细胞中的i NO S、C O X-2表达量均呈现明显的上升趋势,而经A P L E处理后,细胞中的i NO S、C O X-2表达量均有显著下降,经I m a g eJ进行灰度统计,结果如图1 1(B)所示,A P L E对i NO S、C O X-2的表达量的呈现浓度依赖性的抑制效果。注:与L P S组相比,*P0.0 1,*P0.0 0 1。图1 1 A P L E对i N O S及C O X-2表达量的影响F i g.1 1 E f f e c t o fA P L Eo n t h e e x p r e s s i o no f i N O Sa n dC O X-23 讨论与结论不同的提取条件会对提取物中总黄酮含量产生不同程度的影响,当液料比为1 01(m Lg)时,总黄酮含量偏低,可能是因为提取溶剂过少,样品不能够完全被提取;随着液料比的提高,总黄酮含量显著上升;当液料比高于4 01(m Lg)时,总黄酮含量降低,可能是由于某些醇溶性物质与黄酮存在竞争关系,影响总黄酮的浸出,导致其含量下降1 5;当提取溶剂的浓度达到4 0%时,所得总黄酮含量最高,而随着提取溶剂浓度进一步升高,黄酮含量降低,这可能是由于随着提取溶剂浓度升高,龙芽草中其他醇溶 性 物 质 含 量 有 所 上 升,使 得 总 黄 酮 含 量 下降1 6。近年来,植物提取物的抑菌和抗炎症活性已成为研究领域的热点。王彩霞等1 7发现,在2m g/m L浓度下,厚朴(H o u p o e ao f f i c i n a l i s)和麻叶菊(I n d o-c y p r a e am o n t a n a)提取物对葡萄座腔菌具有较好的抑菌活性,抑制率分别达到9 5.8 0%和7 8.3 1%;高语1 8研究了独活、薄荷等3 5味中药的抑菌活性,发现3 5味中草药均具有一定的抑菌作用。其中,新疆产秦艽、玫瑰和沙棘对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有显著的抑菌能力,甘草对革兰氏阳性菌具有较强抑菌作用。该试验发现,A P L E对6种供试菌种均有一定的抑菌活性;其中,A P L E对蜡样芽孢杆菌与沙门氏菌的抑菌活性最强。通过检测样品菌悬液中电导率与蛋白质含量的变化,发现胞内电解质大量泄露,这说明龙芽草抑制细菌增殖的机制可能与增加了微生物壁膜通透性