食用菌纤维素酶木聚糖酶漆酶河南地方标准公共服务平台.doc

食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方原则编制阐明一、编制目和意义(一)食用菌胞外酶活性检测现实状况食用菌在生长发育过程向培养基内分泌多种胞外酶，胞外酶是一类在细胞内产生在细胞外发挥作用酶，这些酶将培养基内纤维素、半纤维、木质素、蛋白等大分子物质分解成小分子物质供菌丝生长发育，胞外酶活性大小与食用菌种类、不一样生长发育阶段、培养基理化性质等原因有关。研究胞外酶活性，理解不一样食用菌胞外酶活性分泌特点、活性大小和变化趋势，推测不一样食用菌在不一样生长发育阶段对培养基中木质素等大分子营养物质降解动态，对研究提高栽培技术具有重要意义。目前生产中对可人工栽培和非人工栽培食用菌胞外酶活性检测均有报道，重点检测纤维酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、SOD酶等多种酶类。漆酶重要是由真菌分泌一类胞外多铜氧化酶，真菌漆酶除了具有降解木质素作用之外，在色素合成、子实体形成、脱毒以及发病机制等方面都饰演了重要角色。此外，作为一种氧化酶，漆酶也常常被用在农业、工业和药用等领域。测定漆酶酶活措施测定漆酶酶活有三种措施：分光光度计法、微量热法、脉冲激光光声法，测O2 法、高效液相色谱法、极谱法等。分光光度法测定漆酶酶活基本原理是选定某种漆酶作用底物, 底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基, 底物自由基浓度与吸光值成正有关, 其在一定光波波长下存在吸光系数最大值, 根据吸光值随时间变化关系计算出酶活。微量热法测定漆酶活性, 利LKB-2107Batch 型微量热系统, 将其温度调至298K,pH 调至7.4, 此措施漆酶提取物样品用量较少, 可直接对酶悬浮液进行测定, 其对反应体系没有任何限制或干扰, 适合研究酶促反应中酶活。纤维素酶是一类可以水解纤维素-D-糖苷键生成葡萄糖多组分酶总称。老式上将其分为3类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶。纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和-葡萄糖苷酶三种重要组分。其中C1酶作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，-葡萄糖苷酶作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸取，在一定范围内还原糖量与反应液颜色强度呈比例关系，运用比色法测定其还原糖生成量就可测定纤维素酶活力。木聚糖是木糖残基以木糖苷键连接而构成，是植物细胞壁中半纤维素多糖重要成分，半纤维素降解酶重要指木聚糖酶系。广义木聚糖酶是可以水解半纤维素一种复合酶系总称，重要酶包括内切木聚糖酶和木糖苷酶。内切木聚糖酶水解木聚糖成木寡糖和木糖残基，而木糖苷酶则对木寡糖末端进行水解，释放出木糖残基。木聚糖酶能将底物木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端寡糖和有还原基团单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色深浅与酶解产生还原糖量成正比，而还原糖生成量又与反应液中木聚糖酶活力成正比。因此，通过度光比色测定反应液颜色强度，可以计算待测木聚糖酶活力。蛋白酶又称蛋白水解酶,其参与了生物体多种生物过程。它们不仅能催化底物水解,更能调整蛋白质定位与活性,调整蛋白质与蛋白质互相作用,参与胞内信号传导以及新生物活性分子生成，目前,蛋白酶活性分析措施可分为均相检测和分离型检测2种。（二）胞外酶活性检测面临问题漆酶活性检测措施较多，诸多文献报道了至少5种以上不一样测定措施，生产科研中常常采用分光光度法，分光光度法所采用底物一般为：ABTS、丁香醛连氮、二茂铁等，不管采用哪一种底物，均有自己局限性和局限。以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见措施之一。它有如下长处： (1) ABTS 易溶于水，在室温下放置6 个月仍较稳定。 (2) 其反应只有一步，即从ABTS 到它阳离子自由基。ABTS 阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，一般在几种小时或几天之内是稳定。 (3) 在漆酶作用下，ABTS 有色溶液摩尔吸光系数较高，阐明以其为底物测定敏捷度较高。 (4) 到目前为止，尚未有报道称ABTS 有致癌作用、诱变作用或是强烈毒性。丁香醛连氮( Syringaladazine)也是漆酶酶活测定较为常见底物之一。以丁香醛连氮为底物是将其氧化为对应醌，它摩尔吸光系数为65 000 L/ (molcm)。其摩尔吸光系数较大，可见用它定性测定漆酶酶活具有较高敏捷度。采用McIlvaine 缓冲体系(pH = 5. 0) ，在525 nm 处测定吸光度增长。 纤维素酶、木聚糖酶活性检测多数参照文献及饲料行业酶活性检测措施。饲料行业公布了NY/T 912-饲料添加剂 纤维素酶活性测定分光光度法，饲料行业公布了GB/T 2374-饲料添加剂木聚糖酶活力测定分光光度法。食用菌属于真菌，对于不一样来源及不一样剂型酶活性测定需要详细制定。质检总局公布了GB/T28715-饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活性测定 分光光度法，该措施针对酸性及中性蛋白酶，缺乏碱性蛋白酶，同步该措施原理是运用蛋白酶在一定条件下水解酪蛋白产生有酚基氨基酸，在碱性条件下与福林试剂生成钼蓝与钨蓝，颜色深浅与氨基酸含量成正比，在680nm条件吸光度。本原则采用相对于福林法相对简便措施，其原理为酪蛋白为底物，测定蛋白酶水解肽键活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中肽数量正比于酶数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度增长，来计算酶活性。二、任务来源及编制原则和根据食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程由河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所提出申请，河南省质量技术监督局原则院组织专家审核，8月11日文献号：豫质监标发（）263号文献，下达立项告知，立项编号：531。本原则针对食用菌胞外纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶四种胞外酶活性测定原理、定义、所需要试剂、配制措施、仪器、分析环节、成果计算等进行进行详细论述，该措施简便、轻易操作，所需大型精密仪器少，较适合科研院所及高校应用。三、编制过程1、成立原则起草小组食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程地方原则获得立项后，负责起草单位河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，立即协商成立了原则起草小组。召开了第一次会议，确定了起草人员，并协商制定了原则编写计划，进行了分工。原则起草由河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所负责，查阅文献，补充布置有关试验，搜集并整顿有关数据。孔维丽负责执笔起草原则征求意见稿。2、查阅文献与试验至今，原则起草组一直从事平菇、白灵菇、毛木耳等不一样种类食用菌胞外酶活性研究和测定，征询国内有关行业专家，在总结数年生产实践及试验基础上，查阅有关原则文献资料等，编写制定食用菌胞外纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程等，整顿出了原则编写所需资料，为起草原则作了文献与科学数据等方面准备。3、调查生产现实状况与验证原则起草组组员深入河南省检测检查中心、高校试验室单位和基层研究院所等实地地开展广泛调研，认真听取各方意见和提议，搜集有关资料。对原则制定过程存在问题进行梳理总结，对有关试验进行了必要检查，获得了真实数据，反馈到有关分析测试中心、试验室等单位，共同讨论、引导各单位在推广应用过程中向原则化、规范化方向发展。4、起草征求意见稿9月中旬，原则编写组对有关文献资料进行了梳理总结，由孔维丽提出了原则编写提纲。同步召开了原则起草小组会议，根据GB/T1.1-原则化工作导则第1部分：原则构造和编写规定，对编写提纲进行了讨论提出了修改意见。会后由执笔人对原则编写提纲进行了修改，根据编写提纲起草了食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程原则征求意见稿。10月下旬将征求意见稿发函给河南农业大学申进文、河南农业大学邱立友、河南省科学院生物所贾申茂、河南科技学院王振河共4位专家进行征求意见。11月初下旬共收到4份修改意见，意见返回后，原则起草小组根据征求意见，通过讨论、再次查阅资料、征询对原则进行修改和完善，编出了食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方原则征求意见汇总表。根据汇总表意见对征求意见稿进行了修改，形成了修改稿，上传到网上进行征求意见。四、重要内容确实定（一）原则编制原则食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南地方原则编制，按照国家有关原则化法律、法规、原则规定，重要遵照如下基本原则：1、规范性规范性指起草原则时要遵守与原则制定有关基础原则及有关法律、法规。本原则编制严格按照“GB/T1.1原则化工作导则”第1部分：原则构造编写。2、合用性本原则编制根据实际生产需要，结合GBT 23874- 饲料添加剂 木聚糖酶活力测定 NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力测定、GB/T 28715- 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定 分光光度法河南省技术现实状况、需求、试验条件、从业人员技术水平实际需求等，确定食用菌胞外酶活性检测技术规程参数、措施等，以便于在生产中使用以便，易于推广。漆酶活性测定是总结文献资料及生产实践得出较为实用、简便、成果稳定措施。3、统一性统一性是对原则编写及体现方式最基本规定。统一性强调是原则内部统一。食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程原则编写过程中一直注意前后构造统一、文体统一，以及术语统一。4、协调性统一性强调是一项原则内容或一系列原则内容，协调性是针对原则之间，他目是“为了到达所有原则整体协调”。因此本原则在编制工艺时所用术语及定义参照GB/T 12728- 食用菌术语，在试剂配制及测定措施上与GBT 23874- 饲料添加剂 木聚糖酶活力测定 、NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力测定、GB/T 28715- 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定 分光光度法，相似部分参照3个原则，详细论述不一样部分及改善地方。是对上述3个原则补充和完善。5、完整性完整性是指原则中“范围”一章所规定界线内原则内容按照需要力争完整，也就是说完整是有界线。本原则规定了紫外分光光度法检测食用菌羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力措施。本原则合用于平菇等食用菌菌丝液体培养、固体栽培过程中羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测。（二）原则编制重要内容确定根据本原则制定是采用紫外分光光度法检测食用菌菌丝液体培养、固体培养料胞外纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力措施。结合本省实际栽培技术及发展方向而确定。其中重要内容确定根据有如下几种方面：术语和定义、仪器与设备、试剂与溶液配制、原则曲线绘制、样品制备与保留、测定环节、成果计算等。术语和定义：本文使用术语符合GB/T 12728- 食用菌术语。GBT 23874- 饲料添加剂 木聚糖酶活力测定、 NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力测定、GB/T 28715- 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定 分光光度法、GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验措施、GB/T 601- 化学试剂 原则滴定溶液制备、GB/T 9721- 化学试剂 分子吸取分光光度法通则里面术语合用于本原则。本原则规定了四种酶活性定义。羧甲基纤维素酶活性（CMC酶）：在37 ，pH值为5.5，每分钟从浓度为0.8%羧甲基纤维素钠溶液中降解1 mmol还原糖所需要酶量为1个酶活力单位（U）。木聚糖酶活性：在37 ，pH值为5.5，每分钟从浓度5mg/mL木聚糖溶液中降解1mol还原糖所需要酶量为1个酶活单位（U）。蛋白酶活性：在40，对应pH值（中性蛋白酶pH值=7.5，酸性蛋白酶pH值=3，碱性蛋白酶pH值=13）1 min水解酪素产生1g酪氨酸所需要酶量为1个酶活性单位（U）。漆酶活性：漆酶分解2,2- 联氮- 双-3- 乙基苯并噻唑- 6- 磺酸（ABTS），产物为ABTS自由基，(在室温（2530 ），pH值为5（0.08 mol/L醋酸钠缓冲液）条件下，以每秒钟氧化1 mmol 0.5 mmol/L ABTS所需酶量定义为1个酶活力单位（U）。仪器和设备：本原则规定了分析所需要基本仪器设备。紫外可见分光光度计（Blue star A），符合GB/T 9721- 化学试剂 分子吸取分光光度法通则(紫外和可见光部分)对仪器规定和测定措施、pH计(上海佑科E-201-9 型)、电子天平：精确至0.0001g、数显恒温水浴锅、磁力搅拌器（加热功能）、低温高速离心机（SIGMA）。试剂与溶液：原则详细列举了所需要试剂及配置措施。与GBT 23874- 饲料添加剂、木聚糖酶活力测定 、NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力测定、GB/T 28715- 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定 分光光度法相似试剂参照三个原则所规定措施。绘制原则曲线：纤维素酶、木聚糖酶参照NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力测定、GBT 23874- 饲料添加剂、木聚糖酶活力测定措施，本原则规定了漆酶、蛋白酶活性原则曲线绘制措施。待测酶液制备：食用菌胞外酶活性测定包括两种，一种为固体培养条件下菌丝体胞外酶，一种为液体培养条件下菌丝体胞外酶活性，液体培养液采用 2层纱布过滤取上清液，1 r/min，离心20 min，得到待测酶液。固体原料碾碎，称量50g，反复3份，加5倍去离子水三角瓶内，25浸提3 h，2层纱布过滤取上清液1 r/min，离心20 min，得到待测酶液。酶活性测定：包括酶液稀释与测定。纤维素酶、木聚糖酶待测固体酶液用缓冲液稀释1020倍，液体酶液用缓冲液稀释2025倍，测定OD值最大值在0.50.6之间为宜。羧甲基纤维素酶参照NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力测定措施。木聚糖酶活性测定参照GB/T 23874- 饲料添加剂 木聚糖酶活力测定蛋白酶活性测定本原则与GB/T 28715- 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定措施不一样，减少了福林试剂配制与使用，待测固体酶液用缓冲液稀释1025倍，液体酶液用缓冲液稀释50倍，测定OD值最大值在0.50.6之间为宜。漆酶：采用ABTS法。计算：纤维素酶、木聚糖酶参照NY/T 912- 饲料添加剂 纤维素酶活力计算措施、GBT 23874- 饲料添加剂、木聚糖酶活力计算措施。本原则规定了漆酶、蛋白酶活性计算公式。五、与国家法律法规和强制性原则关系食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程原则制定措施，所使用试剂、配制措施，原料处理及保留均=符合GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验措施、GB/T 601- 化学试剂 原则滴定溶液制备、GB/T 9721- 化学试剂 分子吸取分光光度法通则所引用有关原则均为最新现行原则，与现行法律、法规和强制性国标相符。六、原则实行提议结合本省实际，贯彻贯彻食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方原则提议采用如下措施：（一）采用多种形式，加大宣传力度，借助河南省食用菌协会、河南省食用菌产业技术体系、国家食用菌产业技术体系、高校、科研单位、龙头企业等开展育种等有关研究研究，培训、简介该原则操作技术规程，理解原则内容和有关法规政策，提高对原则认识，规范操作流程，提高育种效率，提高新品种质量。（二）河南省质监局网站及时公布通过审定原则，使用者通过多种形式登录查询、检索该原则内容，通过后台监督，进行原则实行状况监督检查，发现问题及时进行指导，使原则落到实处。（三）建立健全地方原则管理制度，常常听取原则使用者意见，准时对原则进行修订，以适应生产和技术发展需要。食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方原则起草组11月1日