克氏原螯虾PcCRCN-L基因的克隆鉴定及在低氧胁迫下的表达响应.pdf
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1、第 45 卷 第 1 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.45,No.1 2 0 2 4 年2 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Feb.,2024 *江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目(JBGS(2021)119)、国家重点研发计划创新专项(2020YFD0900303)、江苏现代农业重点项目(BE2020348)、江苏现代农业产业技术体系项目(JATS2022411)和江苏省农业重大新品种创制项目(PZCZ201746)共同资助。韩一鸣,E-mail: 通信作者:李旭光,研究员,E-mail: 收稿日期:2022-09-28,收修改稿日期:2022-11-02 DO
2、I:10.19663/j.issn2095-9869.20220928001 http:/ PcCRCN-L 基因的克隆鉴定及在低氧胁迫下的表达响应.渔业科学进展,2024,45(1):128137 HAN Y M,LU S W,XU Z Q,XU Y,LIN H,PAN J L,YANG J X,LI X G.Molecular characterization and expression response under hypoxic-reoxygenation stress of a crustacyanin-like gene in Procambarus clarkii.Progre
3、ss in Fishery Sciences,2024,45(1):128137 克氏原螯虾 PcCRCN-L 基因的克隆鉴定及 在低氧胁迫下的表达响应*韩一鸣1,2 鲁苏皖3 许志强1,2 徐 宇2 林 海2 潘建林1,2 杨家新1 李旭光1,2(1.南京师范大学海洋科学与工程学院 江苏 南京 210023;2.江苏省淡水水产研究所 农业农村部淡水虾蟹遗传育种与养殖重点实验室 江苏 南京 210017;3.江苏海洋大学海洋科学与水产学院 江苏 连云港 222005)摘要 虾青蛋白(Crustacyanin,CRCN)在甲壳动物脂类代谢及低氧胁迫应激调控等方面具有重要的功能。为获取虾青蛋白在克
4、氏原螯虾(Procambarus clarkii)性腺发育和低氧胁迫应答中的作用,本研究在克氏原螯虾肝胰腺组织中鉴定出 1 个类虾青蛋白 PcCRCN-L 基因的 cDNA 序列,分析了PcCRCN-L 基因的结构特征和进化模式,研究了 PcCRCN-L 基因在不同组织与性腺不同发育时期的表达特征,探讨了 PcCRCN-L 在低氧复氧胁迫下的表达响应模式。结果显示,PcCRCN-L 基因 cDNA序列长2 700 bp,其开放阅读框(ORF)长度为1 587 bp,编码528个氨基酸残基;DNA序列长6 130 bp,位于克氏原螯虾基因组的第 12 号染色体,包含 5 个外显子和 4 个内含子
5、,内含子/外显子剪接方式符合 GT-AG 规则。PcCRCN-L 具有 1 个完整的 lipocalin 结构域,包含典型的序列保守区(SCR1)序列 G-X-W、保守区(SCR2)序列 T-D-Y 和保守区(SCR3)序列精氨酸 R。多序列比对与系统进化分析结果显示,PcCRCN-L 独立于传统虾青蛋白 A 和 C 亚族,单独聚为一支。PcCRCN-L 在克氏原螯虾多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高;在性腺不同发育时期,肝胰腺以及卵巢组织中的 PcCRCN-L 基因表达量显著降低;低氧胁迫下,肝胰腺组织中 PcCRCN-L 表达量显著降低,复氧后显著升高。研究结果表明,PcCRCN-L
6、 与克氏原螯虾性腺发育密切相关,并参与了克氏原螯虾的低氧复氧胁迫应激调控。关键词 克氏原螯虾;类虾青蛋白;组织表达;性腺不同发育时期;低氧胁迫 中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2024)01-0128-10 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾,原产于北美洲,是我国重要的淡水养殖甲壳动物。2021 年全国克氏原螯虾养殖面积为 17 3333 hm2,养殖产量为 263.36 万 t(于秀娟等,2022)。克氏原螯虾第 1 期 韩一鸣等:克氏原螯虾 PcCRCN-L 基因的克隆鉴定及在低氧胁迫下的表达响应 129 养殖过程中水体溶
7、解氧变化剧烈,低氧胁迫会导致克氏原螯虾壳色变红,蜕壳次数减少,性腺提早发育成熟,抗病力下降,甚至造成大面积死亡现象(芦超等,2020;Wang et al,2016)。短期轻度缺氧条件下,水生甲壳类动物通过提高氧结合蛋白的浓度和亲和力,增强氧气摄入量来适应低氧环境(孙盛明等,2020)。长期缺氧条件下,水生甲壳类动物通过降低蛋白合成速率和自身代谢需求来减少需氧量,同时诱导糖酵解、脂质代谢等厌氧途径来临时补充能量,补偿有氧代谢不足(殷丽坤等,2023;曹梅等,2021)。但厌氧代谢会抑制线粒体中电子与氧气结合,引起机体自由基稳衡态失衡,降低机体呼吸代谢和抗氧化代谢水平,造成细胞氧化应激损伤(陆逸
8、等,2020)。虾青蛋白(Crustacyanin,CRCN)是甲壳动物所特有的一类载脂蛋白,属 ApoD 家族,主要由 A 和 C两大亚族构成。虾青蛋白可与虾青素聚合形成虾青结合蛋白复合体,引起虾青素末端质子重置,从而调控甲壳动物壳色(Begum et al,2015;Chayen et al,2005)。除了调控壳色功能外,该家族还在脂类代谢及低氧应激等方面具有重要的生物学功能(王磊等,2008;Goessling et al,2000)。虾青蛋白同系物 Glaz 功能缺失性突变,会导致果蝇(Drosophila melanogaster)氧化应激损伤和饥饿耐受力降低,体重减少,寿命缩短;
9、重启 Glaz 表达后,果蝇脂肪储存恢复,机体抗氧化能力和饥饿敏感性增加;过表达 Glaz 时,果蝇平均寿命延长,饥饿耐受力增强,低氧胁迫下的运动爬行能力提高(Sanchez et al,2006;Walker et al,2006)。除此之外,虾青蛋白在蜕皮生长、性腺和神经系统发育等过程中均发挥了重要的作用(Wang et al,2007;Li,2019;Gao et al,2021;Yang et al,2011)。本研究基于课题组前期所获取的克氏原螯虾全基因组信息(Xu et al,2021),采用同源比对与分子克隆相结合的策略获取了类虾青蛋白基因(PcCRCN-L)的 cDNA 序列,
10、并研究其基因结构与进化模式,分析该基因在不同组织与性腺不同发育时期的表达特征,比较 PcCRCN-L 基因在低氧复氧胁迫下的表达模式,旨在为深入研究该基因在克氏原螯虾性腺发育与低氧应激调控中的作用提供参考。1 材料与方法 1.1 实验材料 本实验所用克氏原螯虾采集自江苏省淡水水产研究所浦口遗传育种基地,体重为(25.30.8)g,于实验室中流水暂养(所有样本均为雌虾)。随机取 3 只健康的克氏原螯虾(性腺发育期),分别取肝胰腺、肌肉、鳃、眼柄、后肠、表皮、心脏、胃、卵巢等 9 个组织用于组织表达特征分析。分别取 3 只处于性腺不同发育时期的雌虾,取肝胰腺和卵巢组织,分析PcCRCN-L 基因在
11、性腺不同发育时期的表达特征。根据卵粒形态特征判断性腺发育时期:卵巢发育初期(期)呈白色透明状,未见卵粒;期、期卵巢颜色逐步变黄加深,卵粒明显增大;发育至期,卵黄沉积后的卵粒呈深褐色(徐增洪等,2010)。低氧胁迫实验参照文献报道的研究方案进行(Xu et al,2022)。将克氏原螯虾随机分为 2 组,常氧对照组溶解氧为(6.80.2)mg/L,低氧复氧胁迫组初始溶解氧为(1.00.1)mg/L。每组分别设置 3 个重复水族箱,每箱养殖15只克氏原螯虾。于低氧胁迫1 h和6 h、复氧 1 h 和 24 h 溶解氧为(6.80.2)mg/L,从各箱中分别随机取 3 只克氏原螯虾样本,采集肝胰腺组
12、织,置于 RNA Keeper Tissue(Vazyme,南京)中,4 放置1 h,液氮速冻后80 保存备用。1.2 RNA 提取与 cDNA 的合成 参照 RNAisoPlus 试剂盒使用说明书(TaKaRa,大连),提取克氏原螯虾不同组织总 RNA。采用微量分光光度计 TGemPro(北京天根生化科技有限公司)检测 RNA 浓度,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,使用反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大连)获取 cDNA。1.3 PcCRCN-L cDNA 序列的克隆 基 于 克 氏 原 螯 虾 基 因 组
13、信 息(JAIWQB 000000000.1)类虾青蛋白 PcCRCN-L 基因序列,设计引物(PcCRCN-LF:AGCCGGTCCGTGTATAGTTG,PcCRCN-LR:GTACGTCTGAGCAGCAGCAG)用 于扩增 PcCRCN-L 的完整开放读码框(ORF)区域。PCR扩增体系:95 预变性 5 min,95 变性 30 s,55 退火 60 s/120 s,72 延伸 1 min,40 个循环;最后 72 延伸 10 min。PCR 产物纯化回收(TaKaRa,大连)后连接到 Peasy-T3 cloning Vector(全式金,北京),并转化到 Trans-T1 感受态
14、细胞(全式金,北京),挑取阳性克隆进行测序。1.4 生物信息学分析 应用 EditSeq 程序进行开放阅读框(ORF)分析并将其推导为相应的氨基酸序列;使用 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST 进行蛋白质序列同源性检索分析;使用 ExPASy(https:/web.expasy.org/130 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 protparam/)在线工具分析蛋白质分子量、等电点及基本性质;使用 SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白功能域;使用 Prosite(https:/prosite.expas
15、y.org/)预测蛋白氨基酸结构功能位点;使用ClustalW2 软件将 PcCRCN-L 序列与同源氨基酸序列对比分析;应用 MEGA 6 软件,采用 Neighbor-Joining法构建系统进化树;使用 AnimalTFDB3(http:/ 000 bp 转录因子。1.5 PcCRCN-L mRNA 实时荧光定量 PCR 检测 根据获得的 PcCRCN-L 基因 cDNA 序列信息,设计引物用于实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测,RT-PcCRCN-LF:CCACCATCACCATCATCAT,RT-PcCRCN-LR:TCCACATCTTCAACCATCAA。内参引物为 RT-
16、GAPDHF:GATGCCCCAATGTTCGTC TG,RT-GAPDHR:CGTCATCCTCAGTGTAACC CA)。每个样品的目的基因和内参基因分别进行 3 次重复。RT-qPCR 条件:95 预变性 5 min;95 变性 30 s,60 退火延伸 30 s,40 个循环;72 延伸10 min。PcCRCN-L 基因在不同组织、性腺不同发育时期和低氧胁迫下的相对表达情况采用 2Ct法进行分析(Livak et al,2001)。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)对表达结果进行统计,采用 LSD 法进行多重比较(P0.05)。2 结果 2.1 PcCRCN-L 序列分
17、析 克 氏 原 螯 虾 类 虾 青 蛋 白 基 因(PcCRCN-L)的cDNA 序列长 2 700 bp(GenBank 登录号:OP235978),位于第 12 号染色体上,开放阅读框(ORF)为 1 587 bp,编码 528 个氨基酸残基(图 1)。其理论等电点为 5.64,相 对 分 子 量 为 57.75 kDa,属 于 亲 水 性 蛋 白。PcCRCN-L DNA 序列长 6 130 bp,包含 5 个外显子和4 个内含子,5 个外显子大小从 88 bp 到 1 047 bp 不等,4 个内含子大小从 195 bp 到 1 966 bp 不等。与内含子相比,外显子相对较小,内含子
18、/外显子剪接方式符合 GT-AG 规则(表 1)。在转录起始位点上游 2 000 bp内预测到有 2 个低氧诱导因子 HIF-1 结合位点5-RCGTG-3(814 831 bp 和244 255 bp)(图 1)。2.2 PcCRCN-L 同源性比对与系统进化分析 对氨基酸序列所含结构域进行预测,PcCRCN-L具有一个完整的 lipocalin 结构域,包含典型的序列保守区(SCR1)序列 G-X-W、保守区(SCR2)序列T-D-Y 和保守区(SCR3)序列-R。同源比对结果显示,PcCRCN-L 与美洲螯龙虾(Homarus americanus)同源性最高(68.09%),与中国对虾
19、(Penaeus chinensis)同源性为 55.24%,与日本对虾(Penaeus japonicus)同源性为 53.85%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性 56.64%(图 2)。系统进化树分析结果显示,PcCRCN-L 与美洲螯龙虾、中国对虾、凡纳滨对虾和日本对虾聚为一支,独立于传统虾青蛋白 A 与 C,与甲壳动物 ApoD 和昆虫 ApoD 形成独立分支,与传统CRCN 分类方法结果相一致(图 3)。2.3 PcCRCN-L 的组织表达特征分析 PcCRCN-L 基因在克氏原螯虾 9 个组织(鳃、眼柄、胃、表皮、心脏、肌肉、卵巢、肠道和肝胰腺)中的
20、表达结果显示,PcCRCN-L 基因在所检测的各个组织中均有表达,其中肝胰腺中的基因表达量显著高于其他组织(P0.05)(图 4)。表 1 PcCRCN-L 基因的外显子内含子剪接 Tab.1 Exon-intron splice junctions of PcCRCN-L 内含子外显子序列 Sequence at exon-intron juction 外显子 Exon No.大小 Size/bp 5端 5-splice donnor 3端 3-splice donnor内含子Intron No.大小 Size/bp 氨基酸断裂位点 Amino acid interrupted1 180 G
21、AC TTC CAG AAC D L Q N gtaag.gacagTTC AGC GGC GTCL S G V 1 966 Asn-60 2 88 TAT AGT TGG GAT G Y S W D gtaag.ttcagGG AGG CAA TTT G R Q F 1 506 Gly-90 3 135 CGC TCT CCC AAT G R S P N gtaag.tacagTT CCA CCT GTC V P P V 195 Val-135 4 1 047 ACC AGT ATG ACA G T S M T gtgag.gtcagAC GTG AAG GAGD V K E 876 Asp
22、-484 5 137 第 1 期 韩一鸣等:克氏原螯虾 PcCRCN-L 基因的克隆鉴定及在低氧胁迫下的表达响应 131 图 1 PcCRCN-L 基因的 cDNA 序列及其氨基酸和基因结构 Fig.1 cDNA sequence and its amino acid and gene structure of PcCRCN-L A:粗体 ATG 和 TAA 分别代表起始密码子和终止密码子,下划线部分代表催化结构域;B:基因结构 A:Bold ATG and TAA represent the start and stop codons,respectively,and the underli
23、ned part represents the catalytic domain;B:The structure of the PcCRCN-L gene 132 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 图 2 PcCRCN-L 氨基酸序列同源比对分析 Fig.2 Alignment of amino acid sequences of PcCRCN-L and other related sequences 图中黑色代表相同水平 100%,灰色代表相同水平50%。序列内黑色实线方框表示 3 个 Lipocalin 家族特征保守区域(G-X-W、T-D-Y 和-R)。Black denotes
24、the homology level is 100%,and gray denotes the homology level is 50%.Black solid line box in the sequence represents three characteristic conservative regions of Lipocalin family(G-X-W,T-D-Y,and-R).图 3 基于 PcCRCN-L 氨基酸序列构建的系统进化树 Fig.3 Phylogenetic relationship between PcCRCN-L and other related spec
25、ies based on amino acid sequences 2.4 PcCRCN-L 在性腺不同发育时期的表达特征分析 PcCRCN-L基因在克氏原螯虾性腺不同发育时期的表达变化分析结果显示,PcCRCN-L 基因在卵巢与肝胰腺组织中的表达趋势类似。性腺发育期,卵巢与肝胰腺组织中的 PcCRCN-L 基因表达水平显著降低(P0.05)(图 5 和图 6)。2.5 PcCRCN-L 在低氧复氧胁迫下的表达特征分析 低氧胁迫 1 h 时,克氏原螯虾肝胰腺组织中第 1 期 韩一鸣等:克氏原螯虾 PcCRCN-L 基因的克隆鉴定及在低氧胁迫下的表达响应 133 PcCRCN-L 基因表达量显著
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