SDS-PAGE-蛋白电泳分析.doc
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1、实验二 SDSPAGE 蛋白电泳分析一、 目的掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法二、 电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称 Acr) 和交联剂 N,N亚甲基双丙烯酰胺(简称 Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原
2、有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称 SDSPAGE)。由于 SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么 SDSPAGE 后,就只出现一条蛋白质区带。三、 试剂配制1 30% 丙烯酰胺:将 29g 丙烯酰胺和 1g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 6
3、0ml 的水中。加热至 37溶解之,补加水至终体积为 100ml。用过滤器(0.45m 孔径)过滤除菌,查证该溶液的 pH值应不大于 7.0,置棕色瓶中保存于室温 (丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料)。2 1M Tris-Cl: 称取 12.191g Tris 碱溶于 80ml 蒸馏水中,用浓 HCl 调到所需 pH 值,定容至 100ml。1.5M:Tris 碱 18.15g 去离子水 80ml 浓盐酸调 PH 值 8.8 加去离子水定容至 100
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