实验十-血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定.doc
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1、实验十、血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定(实验:肝脏谷丙转氨酶活力测定)(本实验分2个实验完成:一、制作标准曲线 二、测酶活力和总结。或就做二就可以)【目的和要求】1、 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义,2、 学习转氨酶活力测定的原理和方法。3、 熟悉分光光度计的使用。【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶,能催化-氨基酸的-氨基与-酮基酸的-酮基互换,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4,它的种类甚多,其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)的活力最强。它们催
2、化的反应如下。正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎,心肌梗死等病患时,血清中转氨酶活力常显著增加,所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。测定转氨酶活力的方法很多,本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸-酮戊二酸后,生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙。丙酮酸2,4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色,其吸收光谱的峰为439530nm,因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系,故可藉可用分光光度法测定。从丙酮酸2,4-二硝基苯腙的生成量,可计算酶的活力。【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水
3、浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液标准丙酮酸(500g/ml):准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg,溶于pH7.4 0.1M 的PBS中,定容到100ml。现用现配。2、谷丙转氨酶底物:0.90g L-丙氨酸,29.2mg -酮戊二酸,先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4,再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml,贮存于冰箱中,可使用1周。3、0.1mol/L pH7.4 PBS:称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中,定容到1000ml。4、0.02
4、% 2.4-二硝基苯肼溶液:称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。把锥形瓶放在暗处并不时摇动(或加热溶解),待2,4-二硝基苯肼全部溶解后,用1mol/L HCl定容到100ml。滤入棕色玻璃瓶内置 冰箱内保存。5、0.4mol/L NaOH :称取16g NaOH定容到1000ml。6、0.9%生理盐水:称取0.9gNaCl,定容到100ml。【操作方法】一、标准曲线的给制:取6支试管,分别标上0,1,2,3,4,5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的-酮戊二酸与2,4-二硝基苯肼反应,生成-酮戊二酸苯腙。因
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