植物衰老生理.doc
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1、装 订 线实验报告课程名称: 植物生理学及实验(甲) 实验类型: 实验名称: 植物衰老生理 姓名: 专业: 学号: 同组学生姓名: 指导老师: 实验地点: 实验日期: 一、实验目的和要求 二、实验内容和原理三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析七、讨论、心得 一、 实验目的和要求1、 熟悉提取植物组织中蛋白质的一般办法2、 掌握MDA、SOD测定的原理及方法3、 掌握离心机、分光光度计等仪器的使用方法4、 了解植物衰老过程中,物质含量的变化二、 实验内容和原理材料:新老青菜叶片内容:植物组织蛋白质、丙二醛含量测定原理:1、 蛋白质测定考马斯亮蓝 G-
2、250 ( Coomassie brilliant blue ,G-250 )法是利用蛋白质-染料结合的原理,定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式,最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ,通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约 2 min 即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定 1 h,之后,蛋白质染料复合物发生聚合并沉
3、淀出来。此法灵敏度高(比 Lowry 法灵敏 4 倍),易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 2、丙二醛含量测定MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应,形成三甲基复合物。该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处,消光系数为155 (mM)-1 cm-13、SOD活性测定SOD是含金属辅基的酶,它催化以下反应:02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法:核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙,甲腙在560nm波长有最大吸
4、收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。(但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液,做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件,使得该法实验数据重现性差;同时,在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD,也无法获得100%的对O2.-抑制率。为此,人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。)三、 主要仪器设备分光光度计、离心机、研钵、烧杯、移液枪、试管、离心管等四、 操作方法与实验步骤 蛋白含量的测定制备
5、匀浆:称叶龄差异明显的叶片各0.5g,加入5.00ml 磷酸缓冲液(50mmol,pH值为7.8)于冰浴中研磨提取,匀浆液以10 000g 离心力作用下(4度)离心10min,其上清液即为蛋白提取液。样品测定:取40ul 蛋白提取液+160ul 磷酸缓冲液于玻璃试管中,加入4.8ml 考马斯蓝溶液,混匀后放置2min,用10mm厚的比色杯在595nm 波长下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml 考马斯蓝溶液。MDA含量的测定1、 取上清液1.0ml 于7ml 离心管中,加TBA与TCA混合液4.0ml ,然后在离心管盖上戳一小孔,92水浴保温30min 。2、 空白管:1ml
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