RT-PCR的实验原理与操作步骤.doc

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转 录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择
1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择
1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种 方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研
二、实验耗材与试剂
1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、实验步骤
(一) 总RNA的提取
见相关内容。
(二) cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1. 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
2. 70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
    10×PCR buffer————2μl
    25mM MgCl2————2μl
    10mM dNTPmix————1μl
    0.1M DTT————2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
3. 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
4. 于70℃加热15min以终止反应。
5. 将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
(三) PCR扩增
1. 取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
    第一链cDNA————2μl
    上游引物(10pM)————2μl
    下游引物(10pM)————2μl
     dNTP(2mM)————4μl
    10×PCR buffer————5μl
    Taq 酶(2u/μl)————1μl
2. 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
3. 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G3PD)的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
4. 电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
5. 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1. 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA断裂。
2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
2. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5. 防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品，在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
6. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
7. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
8. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
9. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
10. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
11. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。