生物显微技术实验.doc

长江大学生命科学学院备课用纸备注生物显微技术 学时：32学时，学分：1.5，合用专业：生物工程一、实验目的与任务 规定学生掌握制片的原理和重要方法，培养学生应用显微技术解决科研、生产问题的能力。提高学生动手、实践和运用现代科学仪器的能力等综合素质。二、生物制片的一般原理及方法植物制片技术是植物显微技术课的一个重要组成部分，是研究植物细胞学、解剖学、胚胎学的必要技术基础。在有关植物形态建成、植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的哺育和鉴别以及林木材性鉴定等多方面的研究和教学工作中，都需要应用显微制片技术，由于各种作物器官的性质差异以及研究目的的不同，就需要不同的制片方法。三、植物制片分类（一）按制片方法可分为二大类：1、切片法（1）徒手切片法 指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简朴染色后，制成临时的水装片用于观测。方法简便，规定设备简朴，但徒手切片技术规定纯熟，方可切出符合规定的薄片。（2）石蜡切片法 以石蜡作包埋剂。用旋转切片机将材料切成薄片（一般为812 m，可以切成连续的蜡带），经一系列解决制成永存片。便于进行器官的三维重构。切片厚度比较好掌握。此法多用手摇切片机切片。（3）半薄切片法 方法环节与石蜡制片相似，但包埋剂为塑料或环氧树脂，采用玻璃刀或钢刀，切片厚度为12 m，不能切成连续的蜡带。（4）冰冻切片法 将待切材料快速冷冻，或固定以后再冷冻，用冰冻切片机切片，用于做原位杂交、组织化学等。（5）滑走切片机切片法 是运用滑走切片机切新鲜的或保存的材料，亦可以切经由石蜡制片法包埋的材料。 将材料夹持于夹持物中（如石蜡、火棉胶、胡萝卜等，木材软化后可直接切片），并固定于滑走切片机夹物台座上进行切片，此法切出的切片厚薄均匀、结构完整，合用于一些比较坚硬的材料。（6）超薄切片法 用超薄切片机制作超薄切片，切片厚度为500 左右，供电子显微镜观测用，技术规定更严格。长江大学生命科学学院备课用纸备注2、非切片法（1）离析法 用一些化学药品或酶等使细胞间的胞间层溶解，细胞彼此分离，从而得到单个、完整细胞的方法，便于研究细胞的立体结构。该方法合用于木材导管、根尖、茎尖及叶表皮细胞及木材、药材的研究。（2）压片法 经化学药剂解决植物的器官或组织并用手工机械地使植物细胞分离，涂抹或压在载玻片上，使细胞成一薄层，便于进行观测的一种制片方法。如染色体压片法。（3）整体封藏法 将完整细小的组织块进行解决，封藏为永存片，如叶表皮整体制片、团藻、水绵、黑根霉等装片。（4）整体透明法 用透明剂将较小的材料整体透明，经透明以后可以在显微镜下观测其内部结构。（5）胚囊酶法分离技术 对植物的胚珠进行酶解，将胚珠内部的完整胚囊分离出来，用于研究胚囊的发育、或者进一步分离出卵细胞。（二）按是否能长期保存来分，可分为二类：（1） 临时制片法：制片用于临时观测，不需要长期保存（如临时装片、徒手切片、冰冻切片等）。（2）永存片制片法：制片可以长期保存（如石蜡切片、半薄切片、超薄切片等）。四、教学基本规定1、规定重点掌握的技术：石蜡制片技术(涉及：取材、固定、脱水、包埋、切片、展片、烤片、染色、透明与封藏)；2、规定掌握的一般技术：(1) 植物其它切片制片方法（徒手切片法）；(2) 非切片制片技术（压片法、涂片法、整体透明法、酶解法等）(3) 摄影及照相机的使用方法；长江大学生命科学学院备课用纸长江大学生命科学学院备课用纸备注实验一 生物制片样品的选取与固定技术 （2 h）一、实验目的规定了解生物制片样品的选材与固定技术，为石蜡切片做准备。二、实验原理1、选材与切割：根据不同制片目的和制片方法选取合适的材料；材料规定新鲜，无病虫害；先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的材料立即固定解决；材料大小要适当，如根的直径在5 mm 以内的，可切取5-10 mm 长的小段，直径在5 mm 以上者可纵分割成12 或14，横切厚度约3-5 mm；叶的切割可切成2-5 mm，若叶较宽可切10 mm 的长条，叶面切取的部位，以研究者的目的灵活选取。切取材料必须使用新刀片，刀口和叶面垂直迅速切割下来；花、果的切割：花药和雌蕊切割，花芽和幼穗的切割，须剥去外部鳞片及叶鞘和其它部分，切去多余部分再放入固定液，有的花序则需去掉外方苞片，一般小的花不经切割可投入固定掖，大花果才进行分割解决。2、杀生（杀死）：在制片过程中，将拟制片的材料（细胞或组织块）迅速杀死，使组织块尽量保持原生活时状态，这种解决通称杀生。杀生时常用一种或多种化学药品解决。一般以渗透力较强的药剂作杀生剂效果比较好。3、固定：在杀生解决的过程中，将器官、组织、细胞按本来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，这样才达成固定的规定。杀生与固定关系密切，通常两者兼有作用。4、保存：组织块经杀生固定后，能较长时间保存下来，经久保存下来的组织块，仍能制片，如酒精、醋酸，福尔马林液保存时间较长；而铬酸类固定液，常须转换70 %酒精液后保存，才可较长时间保存。三、实验材料与试剂材料：南瓜茎或禾木植物的茎试剂：1、F.A.A 固定液（福尔马林冰醋酸酒精）（1）福尔马林（38 %甲醛） 5 mL（2）冰醋酸 5 mL （3）70 %酒精 90 mL2、F.P.A 固定液（福尔马林丙酸酒精）制片效果有时较F.A.A 好。（1）福尔马林（38 %甲醛） 5 mL （2）丙酸 5 mL （3）70 %酒精 90 mL3、Canoys Fluid （卡诺氏固定液）（1）纯酒精（或95 酒精） 15 mL （2）冰醋酸 5 mL长江大学生命科学学院备课用纸四、实验操作环节1、取样：用锋利刀片将南瓜茎切成小段，用作横切的切成0.8 cm长，用作纵切的切成1 cm长，并切去相对两侧少许，最佳选择髓腔较大的样品纵切为两半，髓腔较小的样品不用纵切；2、固定：用FAA固定24 h，抽气，除去材料中的气体，并保存于固定液中；3、软化：先经70 %、50 %、30 %酒精及降至蒸馏水(每次瓶装1/3试剂)分别解决2-4 h后，置于15 %氢氟酸中软化10-15 d备用。氢氟酸可将硅化物软化去除南瓜茎表面的硅化物颗粒，便于制片。思考题与参考文献思考作业：1、 生物制片如何选择材料？2、杀生和固定有何意义？参考文献：1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2023电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996长江大学生命科学学院备课用纸备注实验二 植物显微化学制片 （2 h）一、实验目的规定掌握植物徒手切片的制作技术与方法。运用临时装片进行显微化学鉴定，掌握常用植物显微化学实验的原理与方法。二、实验原理植物显微化学：将材料以徒手切片方法制成薄片，应用化学反映或染色与化学反映相结合的方法，将组织或细胞内的某种化学成分（淀粉粒、蛋白质、脂肪、果胶质、纤维素及木质素等）在组织切片内予以显示。用于研究和测定植物的器官、组织及细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布，简便迅速的方法，是野外调查和室内鉴定的极好方法。三、实验材料与试剂材料：土豆试剂：碘-碘化钾溶液：（1）碘化钾 2 g；（2） 碘 1 g；（3）蒸馏水 300 mL配法：先将碘化钾加热溶于5 mL 蒸馏水中，然后加入碘，待其溶化后再将溶液稀释至300 mL。四、实验操作环节1、制作土豆临时装片：徒手切片法制作（1）将材料切成长约23厘米的小段，削平切面。（2）左手的三个指头拿住材料，使之固定不动摇。为防止刀伤，材料上端应超过手指23 mm，不可高出过多，否则切片时材料容易动摇，也不容易切薄。（3）右手大拇指和食指捏住刀片的右下角（刀片要非常锋利，双面刀片必须是新用的），刀口向内，并与材料切面平行，切片前先将材料和刀口上蘸些水，使之切时滑润。长江大学生命科学学院备课用纸（4）切的方法，以刀口自外侧左前方向内侧右后方拉切，这样可以边切边看清切片的进展情况，同时切起来也比较顺手。切片时只用臂力而不要用腕力及握刀指关节的力量，左手保持不动，不要两手同时拉动，两手不要紧靠身体或压在桌子上，并且动作要灵敏，材料要一次切下，切忌半途停顿或推前拖后作“拉锯”式切割。关键是要切得薄而平。如此连续切片，切下数片后，用湿毛笔将切片轻轻移入培养皿的清水中备用。（5）在切片过程中刀口和材料要不断蘸水，以保持刀口锋利和避免材料失水变形。所切的材料和刀片一定要保持水平方向，不要切斜，假如切斜，即使很薄，但由于细胞切面偏斜，同样影响观测。（6）切下足够多的切片后，挑选薄而平的切片做成临时装片供镜检。挑选切片时，不一定要材料切得很完整，只要切得很薄就行，有时只要有一小部分就可以看清其结构了。因此切下的切片不是每一片都合用，也不是只有全面切得薄的才干用，要根据需要进行选择，一次可多选几片置于载玻片上，制成临时装片，通过镜检再进一步选择抱负的材料用以观测。2、染色：I2-KI溶液染色，取一滴配好的溶液滴在切片材料上染色30 S，水洗；3、观测：盖上盖玻片置显微镜下观测，可见细胞内含许多被染成蓝色的卵圆形或椭圆形颗粒，即为淀粉粒。于高倍镜下观测，可见马铃薯淀粉粒依脐点和轮纹不同有单粒、复粒和半复粒三种类型。（1）单粒淀粉（图A）：每粒淀粉有一个脐点，围绕脐点有许多同心环，即轮纹。（2）复粒淀粉（图B-D）：每粒淀粉有二个或二个以上的脐点和各自的轮纹，而无共同的轮纹层。（3）半复粒淀粉（图E）：每粒淀粉具有二个或二个以上的脐点和各自少数的轮纹，尚有共同的轮纹层。思考作业与参考文献思考作业：1、碘液染色时间稍长（30 s以上）出现黄色为什么物质？2、绘制马铃薯三种类型的淀粉粒图，并引线注明。参考文献：1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2023电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996长江大学生命科学学院备课用纸备注实验三 生物样品的非切片制片法木材解离制片一、实验目的规定掌握生物样品的非切片制片法木材解离制片原理与方法，并观测木质部各组成细胞的形态结构。二、实验原理不通过切片而是以机械或药物将一部分细胞（或组织）或各个细胞分开的制片法称非切片制片，如用机械法分离叶表皮制片；用药物解离根尖、茎尖、木材等。三、实验材料与试剂材料：木材试剂：浓硝酸四、实验操作环节1、解离 将被检查的木质部切成火柴梗粗细，长约1-2 cm 的小段。解离方法常有两种，任意选择。(1) 将切好的材料置于试管或烧杯中，加浓硝酸使材料浸没，再加入数小粒氯化钾，水浴(或酒精灯)上加热至有气泡发生并使材料变白为止（为了安全需在排气柜内进行）。此法解离效果较好。(2) 将切好的材料放于培养皿中，加入过氧化氢一冰醋酸液（以过氧化氢1 份+冰醋酸1份配制）密闭后，放置25-30 温箱（台）中，解离12 小时，待解离适当转入下一步。该法解离效果欠佳。2、水洗：用尼龙纱网滤去酸液，再换水浸泡数次，尽量除去酸液。3保存：用玻璃棒捣散组织，转入离心管中进行离心解决，或静置沉淀后，吸去上清液，另加入50 %酒精保存备用。4染色：取少量木质部解离组织，置1 %番红液染5 min左右。5水洗：水洗数次去浮色。（至少3次）6粘片：用玻棒蘸取具有木质部细胞的水液，均匀涂布载玻片上，转置36 温箱中烘干。7封片：二甲苯过一遍，加拿大树胶封片（可不做）。8、观测：解离细胞呈深红色。长江大学生命科学学院备课用纸思考作业与参考文献 （茎）缘孔纹导管 阶纹导管 （茎）网纹导管 木质部发达的螺纹导管 木质部发达的缘孔纹、螺纹导管思考题与作业： 绘图并描述导管细胞的形态。 单孔导管参考文献1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2023电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996长江大学生命科学学院备课用纸备注实验四 石蜡法制片样品的脱水、透明与浸蜡（8 h）一、实验目的规定 掌握石蜡制片中脱水、透明和包埋的重要原理与方法。了解各种透明剂的特点，了解实验中出现问题的因素。二、实验原理1、脱水：用的脱水剂去除组织内的水分，并使其组织细胞变硬；从而使溶解的石蜡顺利进入细胞内，以便进行石蜡切片。常用脱水剂有：乙醇（酒精）、二氧六环、正丁醇、叔丁醇、丙酮等药剂。2、透明：是制片过程中的基础工作，材料经各级酒精脱水以后，要通过常用的有机溶剂进行透明，这样便于包埋剂（石蜡）及封藏剂（加拿大树胶）进入和溶合。只有当组织材料全为透明剂所占，并在显微镜下观测呈透明状态时，这种材料才符合制片规定，故透明是制片的重要环节。常用的透明剂有氯仿，二甲苯等。3、浸蜡：在装有材料的纯氯仿瓶中，分次逐步加入纯石蜡蜡片，以石蜡透入细胞组织内的全过程，称为浸蜡。浸蜡完全的材料，组织块显得十分透明。三、实验材料与试剂材料：氢氟酸解决的南瓜茎试剂：1、苯胺番红酸性染料溶液 （1）苯胺蓝 1g （2）85 %或95 %酒精 100 mL 2、无水及不同浓度的酒精溶液3、纯氯仿4、石蜡：软材料用5456 熔点的石蜡，若切5 m 以下的厚度或炎热夏季切片时，宜用5860 的石蜡。石蜡商标上须注明为“生物组织切片用蜡”字样，选用时还必须检查石蜡细致度、无气泡、无灰尘、无透明点痕、切片时不断裂、不碎等优点。工业用蜡不能使用。新石蜡和用后已切碎的石蜡，都必须通过先熔化，然后用34 层桑皮纸，折叠成漏斗形，进行过滤除去渣滓。50 %石蜡：一半石蜡和一半二甲苯配制而成；70 %石蜡：70 %石蜡与30 %二甲苯配成； 长江大学生命科学学院备课用纸四、实验操作环节1、整染：将氢氟酸解决（13 d）后的南瓜茎取出，用流水冲洗20 h，蒸馏水浸泡洗涤3次，每次2 h，然后经苯胺番红整染48 h。2、多级酒精脱水：经30 %、50 %、70 %、85 %、95 %及无水酒精解决各2 h。3、多级氯仿透明：经1/5、2/5、3/5、4/5及纯氯仿通明各2 h。4、浸蜡：经50 %、70 %及纯蜡A、B置恒温箱中浸蜡各2 h。包埋时作横切的样品竖放，作纵切的样品卧放。附环节及过程表思考作业与参考文献思考题与作业脱水、透明对材料的浸蜡与包埋有何影响？参考文献1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2023电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996长江大学生命科学学院备课用纸实验四 脱水、透明与浸蜡环节及过程表天 数时 间步 骤第一天实验课内取流水冲尽酸液（自来水冲20 h），换蒸馏水冲6 h，再用苯胺番红整染48 h。第三天7：30 30 %9：40 50 %11：40 70 %15：40 85 %19：40 95 %酒精完全浸没材料超过12 cm第四天7：30 9：40 11：40 15：40 19：40 无水酒精 无水酒精 最佳3次，最后1次划格子，共划5格1/5 氯仿2/5 氯仿 换软木塞，每次吸出一格，加入一格纯氯仿3/5 氯仿第五天7：30 4/5氯仿9：40 纯氯仿11：40 纯氯仿15：40 碎蜡19：40 碎蜡同上所有吸出后，再加纯氯仿再换1次纯氯仿第一次加少量碎蜡第二次加溶液体积的20 % 36 恒温第六天7：30 9：40 11：40 15：40 19：40 50 %蜡 4042 70 %蜡 4850 纯蜡A 再换橡胶塞纯蜡B 5658 纯蜡C 63 石蜡溶化为止第七天课内完毕包埋长江大学生命科学学院备课用纸附录一、几种常用的脱水剂及脱水方法1、乙醇（酒精） (ethyl alcohol) 乙醇是常用的脱水剂，但因易使组织收缩及发硬，故不是抱负的脱水剂。在配制脱水剂时，用95 %酒精配制为15 %、30 %、50 %、70 %、85 %等各种浓度的酒精。由低浓度到高浓度按级过渡脱水过程。一般材料从30 %酒精开始，细胞学常以15 %酒精开始，有时用与固定液同浓度的酒精开始脱水。低浓度中不能停留时间太久，否则材料易吸水膨胀，高浓度（在95 %无水酒精内）中也不能停留时间过长，否则材料易脆化收缩。为脱水彻底，在无水酒精中应两次，假如材料转入二甲苯中，有乳白悬浮液出现时，说明脱水不彻底，应退回无水酒精中继续脱水，在脱水进行中，应避免在无水酒精内过夜解决。2、二氧六环（dioxan） （CH2）4O2 又名二氧杂环己烷、氧化二乙烯。为无色液体，易挥发燃烧，有毒性化合物，不适宜学生实验用，因其毒气是无臭的，吸入后，毒性有积累作用，故开瓶后须十分小心，勿使毒气扩散出。二氧六环与水及酒精、油类以任何比例混合，其优点：兼有脱水和透明作用，不会使组织硬化和收缩，在脱水时，以逐级二氧六环脱水至纯二氧六环后进入石蜡，但其比重大于石蜡，故在进入石蜡前，通过一次氯仿解决驱赶尽二氧六环后再转入浸蜡为好。固定液中具有苦味酸的，不必多冲洗即可转入二氧六环中。大的材料在浸入二氧六环前，先浸入苯胺油，其结果更好。重铬酸钾在二氧六环中不溶解，可在材料中成黄色的染色剂。浸入冷的二氧六环中，放于冰冻切片机的冻盘上，可冰冻切片。3、正丁醇（normal butyl alcohol） 此剂可与水、酒精、二甲苯等剂混合，也可单独或与酒精配级混合使用，是常用的脱水剂。为黄色液体，易挥发，吸入后有人会产生头痛，有人则无反映。其优点：不会使组织收缩或变硬，能溶解石蜡，可不经透明剂直接浸蜡，脱水时，用正丁醇和酒精配成一定比例，逐级解决至纯正丁醇后，再转移至正丁醇与石蜡等量混合液中，最后移入包埋蜡杯中，完毕包埋工作。长江大学生命科学学院备课用纸附录4、叔丁醇（Tertiary butyl alcohol） （简称TBA） 是较正丁醇更好的一种脱水剂，可单独用或与酒精混合用；其优点：为无毒性、不会使组织收缩和变脆，还可不通过透明剂，其比重轻，易从石蜡中除去，故可简化脱水、透明、浸蜡等环节；因其价格较贵，不宜一般实验用。熔点为25。具体脱水级别与配法如下(单位：mL)：浓度级别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1195 %酒精 5 11 18 30 40 50 50 40 25 0 0蒸馏水 95 89 83 70 50 30 15 5 0 0 0TBA（叔丁醇） 0 0 0 0 10 20 35 55 75 100 100相称于酒精（%） 5 11 18 30 50 70 85 95 100 100 1001） 材料经固定水冲洗后，先由5 %浓度酒精开始脱水至50 %酒精（每级经1 h）。2）到第六级时转入欲配制的TBA 级别（此时解决时间为一夜）。3）7 级至9 级又为1 h。4）10-11 级为12-24 h；从11 级即可加碎蜡进行透蜡解决。5、丙酮（Acetone） 可代替酒精作脱水剂，脱水能力强于酒精，但对组织收缩力较大，能使蛋白质沉淀，组织硬化。与水、醚、酒精、氯仿、苯等能任意混合，但不能溶解树脂、石蜡，所以仍需通过透明剂解决后才干包埋。以上脱水剂各有其优缺陷，但使用最多的仍为酒精。6、甘油（Glycerin） 是藻类、菌类、高等植物的原丝体、原叶体等良好的脱水剂。使用时较少收缩现象，甘油脱水前，必须冲洗干净固定液，以免影响包埋、染色等解决。脱水级差从5 %开始，到纯甘油。如发现水仍未脱尽，临时以正丁醇补充脱水一次。二、几种常用的透明剂及透明方法透明剂都是石蜡的溶剂，不能与水相混。现介绍以下透明剂。1、二甲苯（xylol） 为较其他透明剂价格便宜，应用普遍的一种无色透明液体，能与酒精混合，也可溶解石蜡，并能与树胶混合成封藏剂，但不溶于水，长江大学生命科学学院备课用纸附录透明力强、速度快；其缺陷是：使组织收缩变脆，故在二甲苯中不宜停留时间过长，同时必须在材料完全脱水后方可使用二甲苯，若有很少量水分在组织内存在，就会出现乳雾状现象，通常在无水酒精与二甲苯之间，增添12 无水酒精和12 二甲苯的混合液，以便脱水彻底又可使材料减少收缩。装二甲苯的器具盖，要随手关闭，以免挥发污染室间空气。2、氯仿（chloroform） 为常用的透明剂，能与酒精混合，溶解石蜡，在石蜡制片中，浸蜡前的透明多采用氯仿，本编者习惯使用此剂。其优点是：组织在氯仿中浸久虽有收缩，但不强烈；易挥发，如浸蜡时渗入组织中的氯仿经蜡温易驱赶出去。局限性之处是：渗透力稍弱(如比二甲苯、苯透明慢)，可延长透明时间便于工作安排，此外，氯仿能退色，一般染色后的切片，不以氯仿解决。一般用三级氯仿透明，若材料柔嫩可以增长到五级透明解决。3、冬青油（wintergreen oil） 即水杨酸甲酯（Methyl salicylate），又称冬绿油。可作整体制片的透明剂，效果较好，对维管系统的制作透明也很抱负，但其渗透力很慢，且具毒性，用时要小心。4、丁香油（clove oil） 为切片染色后封固前最佳的透明剂；有的染料，如固绿、桔红G 可以丁香油配成饱和溶液，有作染色、分色、透明三步合并应用效果。另能溶于酒精及氯仿，可用95酒精混合使用，而二甲苯必须用纯酒精混合；丁香油的透明力比二甲苯效果好。其缺陷是易使组织变脆，且经丁香油透明的切片，需经二甲苯复解决，染色的部分才鲜明，封片后干燥时间较二甲苯长。5、香柏油（cedar oil） 为无色或绿色的芳香挥发性油，极毒，用时必须小心。纯香柏油常用于油镜使用上，使用此油作透明剂，不易使材料收缩变硬，作用慢，一般透明时间在10 h以上，且不易为石蜡代替。如用石蜡制片，仍须通过二甲苯一次，以除尽香柏油才利于石蜡透入组织内。6、苯（benzene） 苯的透明作用与二甲苯相似，用法相同，且收缩较少，但易挥发、爆炸，吸入苯后会引起中毒，尽量少用。7、甲苯(toluene) 甲苯的性能与二甲苯相同，可作二甲苯的代用品；其透明力慢，组织浸置甲苯中10 h以上也不变脆。长江大学生命科学学院备课用纸备注实验五 细胞组织分离制片法 （4 h）一、实验目的规定掌握组织分离制片原理与方法，并观测表皮细胞的形状及气孔的构造。学习数码显微照相技术。二、实验原理 以机械或药物将一部分细胞（或组织）或各个细胞分开的制片法，如用机械法分离叶表皮制片。三、实验材料与试剂 器材：生物显微镜、滴瓶、镊子、大方滤纸、培养皿、毛笔、染色缸、载玻片、剪刀、材料：蚕豆叶试剂：1 %番红水溶液；1 %龙胆紫；无水乙醇；盐酸；二甲苯；FAA固定液四、实验操作环节1、取样：采新鲜无病斑的蚕豆叶或鸭陌草叶，剪去两端及两侧的叶缘一小部分。2、固定：用FAA固定材料24 h并保存其中。3、取表皮：用镊子将已固定的蚕豆叶下表皮轻轻撕下一块，置培养皿的水中，然后用纸（薄道林纸或普通纸张）捞起叶表皮，使其平展于纸上，再用剪刀将纸和表皮剪成33 mm的小块，将此小块转移至另一洁净的培养皿水中，待纸与表皮分离，镊出纸块，留表皮于培养皿中。4、制片：在载玻片上加1滴蒸馏水，用毛笔挑取一块表皮至水滴中展平，倒去水，待表皮干燥。5、染色：1 %番红水溶液（或1 %龙胆紫）染色1-5 min。6、水洗：用蒸馏水洗数次，去浮色。7、分色：在低倍镜下观测，用盐酸分色（去除浮色）至适度（番红染色可深点）。8、水洗：自来水洗数次，洗净酸液，再用蒸馏水过一遍，终止分色。9、封片：经无水酒精脱水，3次二甲苯透明，用棉布擦干净。10、封藏：在材料上滴一滴二甲苯，再将加拿大树胶滴于其上，用载玻片沿着胶慢慢压下封片。11、观测：在显微镜下观测，找到目的视野。12、拍照：将数码相机调到微距离拍照档，在自动拍照状态下，照下显微镜中的目的图象。长江大学生命科学学院备课用纸思考作业与参考文献 叶片表皮的 双子叶植物气孔分布 思考题与作业1、每人制作一张永久片；2、将观测结果绘图，并表白各部位的名称。参考文献1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2023电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996备注实验六 石蜡法制片包埋 （2 h）一、实验目的规定 掌握石蜡制片中包埋的重要原理与方法。了解各种透明剂的特点，了解实验中出现问题的因素。二、实验原理 包埋：浸蜡完全的组织和熔解的石蜡，倒入蜡块盒，随之快速冷却定形成蜡块的过程。常用的包埋剂有：石蜡和火棉胶。三、实验材料与试剂材料：浸蜡的南瓜茎试剂：纯蜡A、B、C 四、实验操作环节1、将电炉调节使蜡熔化达成 63-64 ，保持其温度，若温度太高，即将蜡锅移出电炉，转入下环节。2、从温箱中取出纯蜡C 杯，置于金属温台上。3、将纸片浸水润湿，放于玻璃块上，平放桌上（或水泥台上），再放一个包埋纸盒于湿纸上。用蜡勺取熔解石蜡转入包埋纸盒内，再从蜡杯C 中取出材料，随之转入有溶蜡的纸盒中，并将样品整齐排放纸盒内。此时较灵敏地用镊尖拨动材料，彼此间留一定距离，这样才便于切割成小蜡块安放切片机上切削。4、当上述手续完毕时，盒内的蜡面渐渐呈薄膜凝固面，此时可用手拿起玻璃片，先平放于脸盆水中，当进入脸盆后，玻璃较重便自行与纸片离开，纸盒也随着漂浮水面，这时不要搅动水或翻动蜡块，以免蜡块内的熔蜡流出，导致蜡块厚薄不均匀或蜡块内材料移动。5、使用过的玻璃片可以反复使用。（1）已冷却凝固的蜡盒，可从水中捞出，盒底向上，纸干后剥去盒纸，放入已编号的纸袋中备用。（2）包埋完毕后的用品，要及时整理清顺，集中存放下次再用。思考作业与参考文献思考题与作业材料包埋注意事项？参考文献1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2023电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996长江大学生命科学学院备课用纸附录三、包埋剂1、石蜡 是石油中提炼出来的多种碳氢化合物，生物制片所用的石蜡为专用石蜡。石蜡产品按熔点度而分规格。熔点高的较硬，低熔点的则软。硬石蜡对切成蜡带不利，太软的则易使组织材料蜡带皱缩，展片时带来困难。选用石蜡的原则：夏天室温高，应采用熔点高的（如58-60 ），冬天室温低，应采用熔点低的；如材料硬或拟切薄的切片应选用硬的熔点高的，厚的切片则采用低的。常用回收的石蜡较新蜡要好用，但要过滤（以桑皮四层叠成漏斗形进行过滤后再用）。2、火棉胶 为易着火的一种硝化纤维，但不易爆炸。常用于材料质地坚硬、易断折或过软的组织块，用火棉胶包埋效果良好。局限性处，价格高，操作时间久不能制作连续切片。常用浓度为2 %、4 %、6 %、8 %、10 %数种。购买火棉胶常见有透明固体和液体两类规格（能溶于丁香油、纯酒精、丙酮及乙醚中，上述浓度可按需要配制）长江大学生命科学学院备课用纸备注实验七 石蜡法制片切片、粘片及展片（5 h）一、实验目的规定了解切片机的使用方法，掌握切片、粘片及展片技术。二、实验原理1、切片：将包埋好的材料运用切片机（回转式切片机或滑走切片机）切成薄片（蜡带）。2、粘片与展片：是将切下的蜡带分割成适宜的片段，用粘贴剂（蛋清甘油或明胶甘油）贴于载玻片上的过程。粘片时必须注意蜡带伸展平整，故粘片与展片都是在载玻片上同时完毕的。三、实验材料与试剂器材：轮转式切片机、生物组织摊烤片机、展片台、台木、载玻片、毛笔、解剖刀、镊子、放大镜、蜡铲试剂：蛋清甘油四、实验操作环节1、分割：将桌上垫一层纸，然后放置一小木板，将石蜡块分割成小蜡块。每个小样品四周留3-5 mm 的蜡边进行整修，每个蜡边与材料尽量呈平行线，上窄下宽，横切片厚15 m，纵切片厚20 m，削好的样品，装入已编号的纸袋中备用。2、固着：用烫蜡铲将小蜡块紧紧地固着在台木上，再进一步修整呈上窄下宽的倾斜面。有些坚硬的材料在切片前，需将材料切面微露出（没有蜡包被着），将露出的面朝向有水的培养皿中浸泡半天到一天再安装到切片机上切削，这样能使组织软化，切面达成光滑不碎裂、无刀痕。在夏季切片时，常用小冰块在蜡块面上冰冻几秒钟后，再进行切片效果较好。3、切片：先选择好刀片。（1）装紧蜡块固定锁紧扳手，并调节好角度与距离；（2）安装好切片刀，当倾角为15左右时，用固定螺旋扭紧；（3）先松开刀架固定钮移动刀架，同时从侧面观看，当切片刀刀刃与台木上的蜡面较平行且接近时进行固定，最后重新检查其它固定螺旋是否紧固。（4）调整切片厚度控制盘的刻度，一般切片厚度约在8-12 m 间。长江大学生命科学学院备课用纸（5）启动切片机总开关，试摇切片机手轮（顺时针方向摇动），左手持毛笔，每摇动一圈，就切下一个蜡片，第一片常贴在刀刃上，当第二片切下时，第一片与第二片的边沿即连在一起，连续摇动手轮，连续蜡带就形成。当蜡带连成一定长度后，用左手的毛笔将蜡带轻轻抬起（尽量避免蜡带与刀面接触），边摇边移动蜡带，待蜡带切下长达20-30 cm 时，停止摇手轮，用右手执另一毛笔顺刀刃轻轻取下蜡带，两毛笔托着整个蜡带平放于切片机左侧的蜡带盒内。使蜡带靠刀的光滑面向下，无光泽面向上；在粘片时，蜡带在载玻片上放置，也按光面向下（即紧贴玻璃面）的位置贴放。（6）用手持扩大镜先逐个检查蜡带，选出合适的材料，以圆刃解剖刀切断蜡带，保存在蜡带盒内以备粘片。（7）锁紧切片机总开关，进一步镜检切下蜡带是否合用。台木上材料不符合规定期，剩下的蜡块不必再切，另换上材料继续切片，这样可保护切片刀刃锋利。注意：在进行切片操作时，要耐心细致，不要对着蜡带发言，以免气体吹走蜡带，切片过程要随手注意关锁总开关钮，以防止手轮下降伤害人的手指和损坏材料或刀刃。4、粘片及展片：每片载玻片粘一片蜡片，展片后在36温箱中烘干。（1）将展片台通电，调节恒温约35左右；（2）蘸滴很少量蛋清甘油于载玻片的中央，以洗净的右手无名指来回涂沫均匀。每蘸一次蛋清甘油，可涂4-5 张载玻片；（3）将已涂蛋清甘油的载玻片平放于展片台上，并加数滴蒸馏水于载玻片上（水呈均匀散开。若载玻片上蘸水为聚集状，说明玻片不干净，必须另调换清洁玻片）。如用明胶甘油作粘贴剂，则改用3 %-4 %福尔马林液作伸展蜡带用。（4）将已选择的小蜡片，用解剖刀的刀尖蘸水（或用镊子）将蜡片转移至有水的载片中部，当蜡片受热完全伸展看不到有任何皱纹时为止。在展片过程中，要随时注意观测伸展情况，并用解剖刀（或镊子）拨正材料对的的位置，此外要注意温度，不使温度过高而溶化蜡片，或导致蜡片散乱，影响染色及封藏；长江大学生命科学学院备课用纸（5）从展片台上取下已展片的载玻片，略为倾斜使多余水分流入培养皿中，同时对材料的位置作最后调整定位；材料无破损、内容较好、伸展平直、无任何纤维丝和渣滓的切片为适合标准的，否则丢弃。（6）将选中的切片继续在展片台上烘烤，使蜡片中心、周边水分都除去，材料紧贴载玻片上，如材料干后有透明质感，表白粘、展片工作较好，如有粉质状白色蜡片，说明材料与载玻片未贴紧（也许有水汽及空隙引起），这为后续解决（染色、脱水、透明，封藏）带来很多麻烦，因此，必须在酒精灯火焰上较迅速地来回烘烤，直至材料发白处变成透明状而蜡不熔化为止。（7）在粘片、展片过程中，不断将展片台上的合格切片，转移至铝制摊片盘中，然后再转放至40 温箱中（中部或上层）继续烘烤3 d 左右方可制片，在放入温箱中的摊片盘，要交叉叠放，这样放的数量多，不占温箱内体积，又可避免磨损切片。思考作业与参考文献思考题与作业1、切片过程易出现何种问题？如何解决？2、粘片中蛋清甘油的加量对制片有何影响?参考文献1