生化技术自我整理.doc

一、生命大分子制备1、生物大分子的特性：（1）由结构比较简朴的小分子所组成（2）具有非常复杂的结构2、生物大分子制备难度：（1）生物材料的组成极其复杂（2）许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的环节繁多，流程又长（3）许多生物大分子极易失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件（4）溶液的温度、PH值、离子强度等各种参数综合影响溶液中生物大分子的制备，很难准确估计和判断，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。3、生物大分子制备的通常环节：（1）拟定要制备的生物大分子的目的和规定（2）建立相应的可靠的分析测定方法（3）通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子的物理化学性质（4）生物材料的破碎和预解决（5）分离纯化方案的选择和探索（6）生物大分子制备物的纯度的鉴定。规定达成一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰（7）产物的浓缩，干燥和保存4、蛋白质的分离纯化：（1）材料获得：天然获得；基因工程手段获得（2）粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步浓缩目的蛋白（3）细分离：常压柱层析：分子筛层析、离子互换层析、疏水层析、亲和层析（4）鉴定：纯度、浓度、活性5、蛋白质的结构研究：（1）一级结构：氨基酸组成分析、末端分析、肽谱分析（2）二级结构：紫外光谱法、荧光光谱法、园二色性法、红外光谱法、激光拉曼光谱法（3）高级结构：X-射线衍射法、核磁共振法（4）结构与功能的关系：突变、晶体分析、蛋白与蛋白的互相作用6、酶活力：酶催化一定化学反映的能力。7、酶活力单位：每分钟催化生成一微摩尔产生所需要的酶量为一个酶活力单位。8、制备生物大分子的方法：（1）以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等（2）以溶解度的差异为依据的方法：盐析。萃取、分派层析、选择性沉淀和结晶等（3）以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子互换层析等（4）以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等9、酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位娄，是酶制剂纯度的一个指标10、回收率：纯化过程中酶活性的收率11、纯化位数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值增大纯化位数和缓慢减少回收率的方法属于有应用价值的方法。12、蛋白质的鉴定：（1）浓度：紫外法、Lowry法、Bradford法、凯氏定氮法、双缩脲法（2）纯度：电泳法、化学法、仪器法（3）分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤、氨基酸组成分析、毛细管电泳（4）等电点：等电聚焦电泳（5）活性：激酶、磷酸化酶、运用靶酶活性、氧化还原酶、ELISA。二、沉淀法1、沉淀法：纯化大分子物质的一种经典方法。操作简朴，成本低廉。不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程，可以有选择性的沉淀杂质或有效成分。原理：不同物质在溶剂中的溶解度不同而达成分离的目的 (又称溶解度法)改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中各种物质的溶解度发生变化。选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。然后通过适当解决，即可达成从抽提液中分离有效成分的目的。2、沉淀可以分为可逆性沉淀和不可逆性沉淀可逆性沉淀：在沉淀过程中，有效成分结构和性质都没发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分离和纯化有效成分的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法。不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，并且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀物不也许再重新溶解于水溶液。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀。（沉淀物一般是杂质）3、常用的沉淀方法和沉淀剂：（1）盐析法：选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。（2）有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子，多糖及核酸类产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。（3）等电点沉淀法：用于氨基酸，蛋白质及其他两性物质的沉淀，但单独应用较少，多与其他方法结合使用。4、制备蛋白质：（1）盐析法：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。1-1优点：成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简朴、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增长，称为“盐溶”现象。但中性盐的浓度增长至一定期，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。1-2二步法1.选择一定浓度范围的盐溶液（如035%饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。pH应偏离有效成分的pI值，靠近杂质的pI值。经离心分离后得到上清液.2.再选择一定浓度范围的盐溶液（如35%55%饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，pH应调至接近有效成分的pI值。用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。1-3.常用的中性盐：硫酸铵。优点： 溶解度大，对温度不敏感 分离效果好 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 价格便宜，废液不污染环境 缺陷：样品欲继续纯化，需花一定期间脱盐。1-4.影响因素：1.盐析常数（Ks）；（lgS（溶解度）=-KsM（盐的浓度），Ks为盐析常数,其数值大,表达分级范围窄,盐析效果好）2.盐的分级范围的差异性；（盐析范围（盐离子强度）差异明显，分离效果好）3.pH值和盐浓度；（pH值常选在该蛋白质的等电点附近）4.蛋白质的浓度和纯度；（蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，一般控制样品液蛋白浓度在0.2%2%为宜。）5.温度和时间的影响（对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小）1-5.脱盐：凝胶过滤、透析。（2）有机溶剂沉淀法：1-1.基本原理1：有机溶剂能减少水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与蛋白质分子间的互相作用力，增长了蛋白质分子间的互相作用，导致蛋白质溶解度减少而沉淀。基本原理2：有机溶剂与水互溶,从蛋白质分子周边的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。1-2.优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。缺陷:对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。1-3有机溶剂的选择:要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。有机溶剂浓度的计算 ：V = V0 (S2 S1) (100S2) V = 需加入100浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所规定达成的有机溶剂的浓度 100是指加入的有机溶剂浓度为100，如所加入的有机溶剂的浓度为95，上式的(100S2) 项应改为 (95S2) 。（3）蛋白质沉淀剂：所用的试剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用。碱性蛋白质、凝集素（优点：反映条件较温和，专一性强）、重金属（要控制在较温和的条件下进行）。（4）聚乙二醇沉淀作用：聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用在生物大分子制备中，沉淀作用较满意的聚合物是分子量在4006000之间的聚乙二醇 优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀效能高；沉淀后有机聚合物容易去除。（5）选择性变性沉淀法：运用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变化沉淀而得到分离提纯。热变性、表面活性剂和有机溶剂变性、选择性酸碱变性。（6）晶体沉淀法：蛋白质结晶形成过程。5、制备核酸：从生物材料中分离出的DNA或RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在的。因此，制备核酸时，需先将这些复合物进行解聚，除去蛋白质，分离DNA与RNA,然后再通过沉淀法得到核酸。（1）DNP/RNP复合物的解聚：去污剂（SDS等可使膜蛋白和脂肪溶解，随后加入适量的乙酸钾溶液以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋白质）、有机溶剂（有机溶剂如苯酚、氯仿是蛋白质的一类变性剂，上层水相为核酸）、蛋白水解酶（可避免剪切和破坏核酸）（2）DNA与RNA的分离：酶水解法（提取DNA时，可用RNase水解RNA杂质）（3）核酸的沉淀：乙醇-盐溶液（加入NaAC或NH4AC以及2倍体积（对DNA）或2.5倍体积（对RNA）的冷无水乙醇，就可将核酸沉淀出来）、异丙醇（加入NaAC和0.54-1倍体积的异丙醇，离心即可得到核酸沉淀）三、层析法1、层析技术：亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。是运用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同限度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达成分离。2、共同特点：色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。 色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。3、常用术语：（1）色谱柱：装有固定相的管子玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱（2）固定相：层析的一个基质，可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子互换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，互换等作用。（3）流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。构成柱层析的流动相的溶液涉及：平衡液（用于柱平衡、溶解样品的缓冲液）、洗涤液（作为洗去杂质的溶液）和洗脱液（改变洗涤液的组成作为洗脱有效成分的溶液）。（4）层析:当流动相中样品混合物通过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相互相作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的顺序从固定相中流出。（5）操作容量（互换容量）：在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反映达成平衡时，存在于基质上的饱和容量。（数值越大，表白基质对该物质的亲合力越强。）（6）分派系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。用K表达。K=溶质在固定相中的浓度 / 溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm凝胶层析，分派系数实质上表达某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分派关系。（7）迁移率（比移值）：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相自身移动的距离之比值。用Rf表达。K Rf （8）VtVoViVgVo:外水体积，是指凝胶柱中凝胶颗粒周边空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。即柱床内凝胶颗粒外空隙之间的水相体积。可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，比如蓝色葡聚糖-2023，分子量为200万，所有型号凝胶都会排阻Vi：内水体积，是指凝胶颗粒中孔穴的体积，固定相体积就是指内水体积。即凝胶颗粒内部所含水相体积。可用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯或其它与凝胶无吸附力的小分子物质测定。Vg：基质体积，是指凝胶颗粒实际骨架体积。即凝胶自身的体积。Vt：床体积，就是指凝胶柱所能容纳的总体积。r2h。Ve：洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积，即自加入样品时到组分最大浓度峰出现时所流出的体积。 大分子先被洗脱出来，Ve值小，Kav值也小；而小分子后被洗脱出来，Ve值大，Kav值也大。对于完全排阻的大分子，VeVo， Kav0；而对于完全渗透的小分子，VeVt， Kav1。一般Kav值在01之间，如Kav值大于1，则表达尚有些物质与凝胶有吸附作用，则VeVt 。(9)塔板理论：假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分派瞬间达至平衡， 达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分派系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。 当塔板数n较少时，组分在柱内达分派平衡的次数较少，曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。 理论塔板数：可得理论塔板高度 H 越小、理论塔板数 n 越多、色谱峰越窄，则柱效越高。分离度也大，从而提高了柱效 .(9)速率理论： u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中 A分别表达涡流扩散系数； B分子扩散系数； C传质阻力系数（涉及液相和固相传质阻力系数）。4、色谱法分类：（1）按固定相的外型：柱色谱(固定相装于柱内的色谱法)、平板色谱(固定相呈平板状的色谱)（2）按分离机理：吸附色谱(不同组份在固定相的吸附能力强弱不同)、分派色谱(不同组份在固定相上的溶解能力（分派系数）不同)、离子互换色谱(不同组份在固定相（离子互换剂）上的亲和力不同)、凝胶色谱(不同尺寸分子在固定相上（多孔凝胶）的渗透作用不同)、亲和色谱(不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力不同)（3）按流动相形式：气相色谱（GC）（气固（GSC）、气液（GLC）、液相色谱（LC）（液固（LSC）、液液（LLC）（4）按压力：高压液相、普通液相 （5）按照展开程序：洗脱法（用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂）、顶替法（对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂）、和迎头法。1、吸附层析：1、吸附柱层析：吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的一种层析方法1-1.原理：运用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，运用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德瓦尔力和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合，其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。1-2.一般环节（以羟基磷灰石为例）：解决基质装柱平衡上样洗涤洗脱收集（透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥）与绘制洗脱曲线基质再生1-3.注意柱的 d:h=1:101:40吸附剂用量为分离样品的 30 50 倍分析时的加样量一般 1 10Vt制备时的加样量一般 1 2Vt1-4、吸附剂有极性和非极性两种，前者有羟基磷灰石，硅胶，氧化铝和人造沸石等，后者有活性炭等。优秀吸附剂：表面积大，颗粒均匀，吸附选择性好，稳定性强，成本低廉。一般极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但为了便于解吸附，对于极性大的物质应选择极性小的吸附剂，否则反之。1-5、洗脱1-5-1、合适的洗脱剂：纯度高；稳定性好；能较完全洗脱下所分离的成分；粘度小；易和所需要的成分分开。1-5-2.（1）简朴洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束。（2）分步洗脱：按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱（3）梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时采用。洗脱能力是逐步连续增长的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或PH等。最常用的是浓度梯度。2、薄层层析：以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相，按纸层析操作进行展层的一种层析方法简便、快速、微量的层析方法；用的吸附剂及其选择原则和柱层析相同；（1）与柱层析的重要区别：薄层层析规定吸附剂的粒度更细，并规定粒度均匀（2）操作方法：薄层板的制备（薄层厚度一般为0.20.5mm，涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，再在105110活化约60分钟，置干燥器中备用）点样（用定量微升毛细管按规定吸取溶液后，以垂直方向小心接触板面使成圆点状，原点直径应不大于3mm，点样时须注意尽量不要损害薄层表面。）展开（点样后的薄层板置入加有展开剂的薄层展开箱中，密闭。一般采用上行展开，浸入后展开剂前沿距原点约5mm。展开距离一般在10cm左右） 检测（有颜色者直接在日光下观测，没有的可以用喷洒法或浸渍法均匀铺上显色剂在荧光下观测，还可在薄层扫描仪中进行光密度扫描或荧光扫描。 斑点移动的距离Rf= 展层剂移动的距离 ）（3）影响薄层色谱分析的重要因素：A样品的预解决及供试液的制备 B、薄层色谱的点样技术C、吸附剂的活性与相对湿度的影响D、溶剂蒸汽在薄层色谱中的作用E、温度的影响（4）仪器与材料：薄层板及吸附剂；涂布器；点样器材；展开相；显色与检测仪器。（5）常用吸附剂：硅胶 层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基吸附水分后通过氢键形成水合硅醇基，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增长而减少。 吸附色谱法一般采用含水量10-12%的硅胶，当含水量小于1%时活性最高，若吸水量超过17，吸附力极弱不能用作为吸附剂。 对硅胶的活化：加热脱水法活化。（6）展开剂种类：单一溶剂，混合溶剂规定：*将混合样品分开*易挥发，粘度小，组成简朴*对样品的定性与定量无干扰*毒性小，对人与环境安全选择：选用时考虑展层剂的极性与溶解度单一溶剂极性石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙醚3、聚酰胺薄膜层析：聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达成分离目的。用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N-末端2、疏水层析1、疏水层析：从分离纯化生命物质的机制来看，它属于吸附层析这一大类。是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立起来的层析技术。疏水层析比较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的物质。这不仅使有效成分的纯度得到提高，并且还保持了其本来的结构和生物活性。2、原理：运用蛋白质疏水性的差异进行分离。高盐结合，低盐洗脱亲水性较强的物质，一般在高浓度盐溶液中，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过减少流动相的离子强度，即可将固定在固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。2-1、吸附剂：在疏水层析过程中，所使用的固定相一般都是由载体和配体（疏水性基团）两部分构成，其配体对疏水性物质具有一定的吸附力，而载体有亲水性和非亲水性之分。亲水性：载体：重要是交联琼脂糖(Sepharose C1-4B)配体：苯基或辛基化合物（耦合）特点：不耐高压，一般仅合用于常压层析系统非亲水性：载体：硅胶,树脂(苯乙烯,二乙烯聚合物)等配体： 苯基,辛基,烷基(C4,C8,C18)等（共价结合）特点： 能耐压,机械性能好,不仅合用于常层析,并且还合用于高压层析.3、操作环节：层析柱的制备（将吸附剂（如苯基-Sepharpse CL-4B）悬浮于乙醇溶液中,浸泡一段时间,采用离心(或过滤)方法,弃上清液,收集沉淀物,并以50%浓度悬浮于样品缓冲液中.装柱,洗涤,平衡）加样与洗脱（样品中加入盐类使变性利于吸附。样品渐渐加入固定相后，先用平衡缓冲液洗涤，再减少盐浓度洗脱）再生（用8mol/L脲素溶液或含8mol/L脲素的缓冲液洗涤层析柱（以除去固定相吸附的杂质），接着用平衡缓冲液平衡。）4、优点：操作简朴，蛋白质回收率高，蛋白质变性也许小，选择性强柱子：交联琼脂糖 再生：尿素3、离子互换层析1、离子互换层析：是以离子互换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与互换剂上的平衡离子进行可逆互换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法2、原理：依据各种离子或离子化合物与离子互换剂的结合力不同而进行分离纯化的。2-1、离子互换剂：是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物载体通过一定的化学反映共价结合上某种电荷基团形成的。分三部分：高分子聚合物载体，电荷基团，平衡离子（以羧甲基纤维素为例）平衡离子带负电的离子互换剂与带负电的离子基团发生互换作用，称为阴离子互换剂(anion-exchange resin )。阴离子互换反映：( R（高分子聚合物载体）-X+（电荷基团）) Y-（平衡离子）- + A- ( R-X+) A- + Y-2-2、选择系数若值1，即RBRA，这表达离子互换剂对B+的结合力要比对A+的大；若 值=1，即RB=RA，这表达其对B+和A+的结合力相同；若 值1，即RBRA，表达其对B+的结合力要比对A+的小。2-3、一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。互换剂对离子的结合力顺序为：Na+ Ca2+ Al3+ Ti4+；Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+；Mg2+ Ca2+ Sr2+ Ba2+；F-Cl-Br- pH的蛋白带正电，能与阳离子互换剂结合，一般pI越大的蛋白与离子互换剂结合力越强。3、离子互换剂的选择3-1、载体疏水性离子互换剂：聚苯乙烯离子互换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为载体。聚苯乙烯离子互换剂互换容量高、机械强度大、流速快。重要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质，另一方面可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂（如十二烷基硫酸钠、tritonX-100）、尿素和两性电解质。此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质。亲水性离子互换剂：载体为天然或人工合成的与水有较强的亲和力的物质如纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）等.3-2、电荷基团看被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，假如带正电，例如polymyxin、 cytochrome C这些碱性蛋白质，他们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，则选择阳离子互换剂；如带负电，像heparin、nucleic acid這类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则选择阴离子互换剂；两性离子，以胰岛素（insulin）为例，它的等电点为pH 5.3，因此在pH5.3的碱性溶液中，使用阴离子互换剂。3-3、常用离子互换剂介绍:3-3-1、纤维素纤维素离子互换剂是以微晶纤维素为载体，通过化学方法引入电荷基团构成的。纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）和CM-纤维素（羧甲基纤维素）最常用，它们在生物大分子物质（蛋白质，酶，核酸等）的分离方面显示很大的优越性。 一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际互换容量要比离子互换树脂大的多；二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达成分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子互换纤维素已成为非常重要的一类离子互换剂。 3-3-2、葡聚糖（Sephadex）交联葡聚糖离子互换剂是以交联葡聚糖G-25和G-50为载体，通过化学方法引入电荷基团制成的。这类互换剂的外形呈珠状，对蛋白质和核酸等大分子物质有较高的结合容量，并且流速比无定形纤维素离子互换剂快。3-3-3、琼脂糖（Sepharose）琼脂糖离子互换剂重要是以交联琼脂糖CL-6B (SepharoseCL-6B)等为载体，通过化学方法引入电荷基团制成的。这类离子互换剂的外形呈珠状，网孔大，特别适合分离大分子量的蛋白质和核酸等物质，即使在流速快的操作下，也不影响分辨率。3-4常用术语3-4-1交联度：每种交联剂在基质中占的百分数 离子互换剂中的载体都是通过交联剂交联而制成的固体物质。这种基质比较稳定，不溶于水和其它普通溶剂，机械性能好。3-4-2吸水量或膨胀度如葡聚糖凝胶Sephadex: G25， G后面的阿拉伯数字代表凝胶吸水量（毫升水/克干胶）乘以10。1.交联度大，孔径小，吸水量少，膨胀度也小 , 反之亦然。2.电荷基团越强，膨胀度越大3.交联度小的离子互换剂处在低离子强度时，其膨胀度比处在高离子强度时大。弱阳离子互换剂的膨胀度是随着pH值的提高而增大，而弱阴离子互换剂的膨胀度却是随着pH值的减少而增大的 交联度大的离子互换剂的膨胀度几乎与离子强度的变化无关。3-4-3互换容量：离子互换剂能提供互换离子的量，它反映离子互换剂与溶液中离子进行互换的能力。样品组分与离子互换剂作用的表面积越大当然互换容量越高。 离子互换剂的总互换容量通常以每毫克或每毫升互换剂具有可解离基团的毫克当量数（meq / mg或meq / ml）来表达。3-5平衡离子1. 与离子互换剂结合力不会过强，否则组分离子难以与互换剂结合而使互换容量减少。2. 不对样品组分有明显影响。一般来讲强酸型离子互换剂对H +离子的结合力比Na+离子小，弱酸型离子互换剂对H +离子的结合力比Na+离子大。一般来讲强碱型离子互换剂对OH离子的结合力比Cl离子小，弱碱型离子互换剂对OH 离子的结合力比Cl 离子大。4、基本操作：层析柱及离子互换剂的解决（前解决：膨化后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂解决后要用水洗至中性，再用另一种试剂解决，最后再用水洗至中性；装柱：直径和柱长比一般为1:10到1:50之间）平衡缓冲液（一方面要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定，另一方面是要使各个待分离物质与离子互换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子互换剂的结合有较大的差别。）上样（一般为柱床体积的15为宜）洗脱缓冲液（1.要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。2.要使结合在离子互换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都可以被洗脱下来。3.洗脱液体积应足够大，使分离的各峰不致于太拥挤。4.此外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。）洗脱速度（一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会导致分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率减少等副作用） 样品的浓缩、脱盐离子互换剂的再生（酸（HCl）碱(NaOH)交替浸泡，或高浓度的盐溶液（NaCl）清洗，20乙醇或含0.02叠氮钠的缓冲液中可以长期保存）梯度洗脱：1.改变离子强度 在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子互换剂结合的各个组分被洗脱下来。2.改变PH 阳离子互换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子互换剂一般是pH从高到低。5、应用1. 水解决2. 分离纯化小分子物质3. 分离纯化生物大分子物质4. 测定蛋白质的等电点4、凝胶过滤1、凝胶过滤：运用某些化学惰性的多孔网状结构物质(多孔性凝胶填料)为介质,使预分离的混合物质按照分子量大小分别先后流出层析柱，而得以分离、纯化的方法。凝胶：指具有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种通过交联而具有立体网状结构的多聚体。分组分离是指将样品混合物按分子量大小提成两组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质，以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。2、原理：凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以一方面流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，由此反复进出凝胶颗粒中，经历的流程长，使移动速度减慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的限度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品通过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达成了分离目的。3、优缺陷凝胶过滤层析是层析分离中最简朴，最单纯的一种类型。具有条件温和、方法简朴、易操作、分离范围广、反复性好、回收率高的优点，常用作蛋白的精细纯化，能达成比较满意的分离效果。局限性之处：是需要较浓的样品上样浓度，收获的是被稀释了的蛋白液，纯化效果好，但生产流程长，因而不适合生产规模的大样品制备。4、常用术语（详见色谱法）4-1.分派系数与各种体积对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系： Kavb lg MWc （其中b、c为常数，MW表达物质的分子量。）Ve和Kav也成线性关系： Veb lg MWc （其中b、c为常数。）4-2排阻极限：指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表达分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。4-3.分级分离范围：表达一种凝胶合用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,00070,000，它表达分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。4-4.吸水率和床体积吸水率是指1g干的凝胶吸取水的体积或者重量，但它不涉及颗粒间吸附的水份。所以它不能表达凝胶装柱后的体积。（该值低于.g/g的为硬胶；高于.g/g的称为软凝胶.）床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。5、凝胶的种类和性质5-1、凝胶基质应具有的条件：（1）亲水性大，表面基质惰性，即基质与溶质之间不发生任何化学或物理互相作用（2）化学稳定性高，在较宽的pH值和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长（3）基质内含的带电离子基团少，以减少非特异吸附性，提高蛋白质收率（4）一定的孔径分布范围（5）良好的机械强度，允许较高的操作压力（流速）5-2、固定相：（1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶（Sephadex :G25, G50, G75, G100）、琼脂糖凝胶（Sepharose：2B, 4B, 6B）、聚丙烯酰胺（Bio-gel: P-6，P-30，P-60，P-100）都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们合用于水溶性作流动相，不适宜在高效液相色谱中。（2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。（3）刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。5-2-1葡聚糖凝胶一般以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。而以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀）作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。Sephadex: G25， G后面的阿拉伯数字代表凝胶吸水量（毫升水/克干胶）乘以10。具有大量羟基，亲水性很好，性质稳定。由于具有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有也许与分离物中的一些带电基团（特别是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05M的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附。同时新得凝胶可用易得到的蛋白质进行预层析。此外,葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用,采用凝胶过滤层析分离它们时,往往运用的是吸附性能,而不是排阻原理.5-2-2琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。是由D半乳糖（D-galactose）和3,6脱水半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的多糖链。它在100 C时呈液态，当温度降至45 C以下时，多糖链以氢键方式互相连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。Sepharose 6B：B是指的颗粒中琼脂糖含量近似值（%），分离球状蛋白和病毒的分子量极限：1044106 ； 4B是：1042107 ； 2B是：1044107琼脂糖凝胶在pH为49之间是稳定的，它在室温下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以030 C为宜。琼脂凝胶Sepharose具有亲水性,大孔性,非特异吸附力和大量活泼的羟基等优点。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。此外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明